一株地衣芽孢杆菌的性质研究及发酵培养基优化
1212*
刘阳，谭明，潘宝平，宋诙
（1．天津师范大学生命科学学院，天津300387；2．天津工业生物技术研究所基因工程与微生物应用技术研究组，天津300308）
摘要［目的］研究实验室自分离的地衣芽孢杆菌KL6作为微生物饲料添加剂的可行性，并对其发酵培养基进行优化，确定最佳培养条件，为工业化发酵提供依据。［方法］运用表型试验对其进行生理生化评价及产酶评价；运用4因素3水平正交试验和单因素试验对其培养基进行改进，并对其发酵条件进行优化。［结果］地衣芽孢杆菌KL6的D－葡萄糖产酸试验、硝酸盐还原试验、淀粉水解试验等均呈阳性；4种因素对活菌数影响的显著性次序为：MnSO4＞NaCl＞酵母粉＞蛋白胨，对芽孢数影响的显著性次序为：MnSO4＞蛋白胨＞NaCl＞酵母粉，NaCl1．0%、25%浓度的硫酸锰0．2%；生长适宜温度为37℃，培养基的最佳配比为：蛋白胨1．0%、酵母粉0．5%、进行发
9
酵罐放大培养，最佳放罐时间应在14～16h，获得的菌体数量约101．63×10个/ml，芽孢率为97．11%。［结论］体外评价试验表明，地衣芽孢杆菌KL6具有作为微生物饲料添加剂的潜力；发酵培养基及条件优化试验表明，地衣芽孢杆菌KL6能够适于高密度液体发酵。该试验为以KL6为基础的微生物饲料添加剂的开发和大规模发酵培养提供了理论依据。关键词地衣芽孢杆菌；微生物饲料添加剂；发酵；培养基优化；正交试验中图分类号Q935文献标识码A文章编号0517－6611（2012）03－01348－04ResearchontheCharacterandOptimizationofFermentationMediumforBacilluslicheniformis，KL6LIUYangetal（LifeScienceCollege，TianjinNormalUniversity，Tianjin300387）Abstract［Objective］TheaimwastostudythefeasibilityofseparatingBacilluslicheniformis，KL6，asmicrobialfeedadditives，optimizedits
anddeterminedtheoptimumcultureconditionsoastoprovideabasisofindustrialfermentation．［Method］Thephysiologi-fermentationmedium，
calandbiochemicalandenzyme-producingofBacilluslicheniformis，KL6，wereevaluatedbyphenotypictests．Fermentationmediumandcondi-tionsbyand4-factorsand3-levelsorthogonalandsingle-factorexptsimprovedtheculturemediumandoptimizedfermentationcondition．［Re-thesult］Thenumberofviablecellwasinfluencedbyfourfactorsinorderofsignificanceasfollows：MnSO4＞NaCl＞Yeastextract＞Peptone，
numberofsporeswasMnSO4＞Peptone＞NaCl＞Yeastextract，andtheoptimumcultureconditionwas：Peptone1%，Yeastextract0.5%，NaCl1%，25%MnSO4．ThesuitabletemperatureofBacilluslicheniformiswas37℃．Thefermentationprocessofthefermentershouldbestopat14－16h，atthattimethenumberofviablecellwas101．63×109permilliliter，andtherateofsporeswas97．11%．［Conclusion］Ontheba-Bacilluslicheniformis，KL6，hadpotentialasmicrobialfeedadditives．Onthebasisofresultsthatop-sisoftheresultsofinvitroevaluationtest，timizedfermentationmediumandconditions，Bacilluslicheniformis，KL6，wassuitableforhigh-densityfermentationofliquid．Thisexperimentprovidedatheoreticalbasistothedevelopmentofmicrobialfeedadditivesandlarge-scalefermentationwhichwasbasedonKL6．
KeywordsBacilluslicheniformis；Microbialfeedadditives；Fermentation；Mediumoptimization；Phenotypictest
地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）是芽孢杆菌中较具应用潜力的菌种之一，在医药、饲料加工、农药等行业均取得国内外对于地衣芽孢杆菌各方了较好的研究成果。近年来，面应用的报道日益增多
［1］
1%、pH7．0～7．2；基础发酵培养基：氯化钠0．5%、琼脂2%，pH7．0～7．2；直链淀蛋白胨1%、酵母粉0.5%、氯化钠1%，0．5%直链粉培养基：蛋白胨1%、酵母粉0.5%、氯化钠1%，pH7．0～7．2；支链淀粉培养基：蛋白胨1%、淀粉，酵母粉0.5%、0．5%支链淀粉，pH7．0～7．2；酪蛋白培氯化钠1%、0．5%酪蛋白，酵母粉0.5%、氯化钠1%、养基：蛋白胨1%、
pH7．0～7．2；甘露聚糖培养基：蛋白胨1%、酵母粉0.5%、氯0．5%甘露聚糖，pH7．0～7．2；果胶培养基：蛋白胨化钠1%、
1%、0．5%果胶，pH7．0～7．2；木酵母粉0.5%、氯化钠1%、0．5%木聚糖培养基：蛋白胨1%、酵母粉0.5%、氯化钠1%、pH7．0～7．2；纤维素培养基：蛋白胨1%、聚糖，酵母粉0.5%、0．5%纤维素，pH7．0～7．2。以上培养基氯化钠1%、121℃灭菌20min。均需在高压蒸汽灭菌器中灭菌，1．1．3
主要试剂与设备。生理生化鉴定管均购自杭州天和
微生物试剂有限公司。主要设备有精密电子天平、生化培养箱、恒温培养振荡器、洁净工作台、紫外可见分光光度计、实验室pH计、高压蒸汽灭菌器。1．2
方法
生理生化评价及产酶评价。
D-L-D-D-葡萄糖产酸、阿拉伯糖产酸、甘露醇产酸、
1．2．11．2．1．1
。饲用微生态制剂为活菌制剂，具
有改善宿主微生态平衡、提高动物健康水平、促进动物生长提高动物生产性能的作用。笔者通过体外试验研究实发育、
验室分离得到的一株地衣芽孢杆菌KL6菌株的生长特性，及高胆汁环境的耐受能力，并对其发酵条件进行优其对高热、
化，旨在为筛选动物高效益生菌株及其大规模发酵提供理论依据。11．11．1．1
材料与方法材料
供试菌种。地衣芽孢杆菌KL6，分离自云南温泉；地
衣芽孢杆菌CICC23584，购自中国工业微生物菌种保藏管理实验室编号：DT。中心，1．1．2
培养基。种子培养基：蛋白胨1．6%、酵母粉1%、氯
pH7．0～7．2；检测培养基：蛋白胨1．6%、酵母粉化钠0．5%，
天津市科技计划项目（10ZCKFSY06400）。
刘阳（1986－），女，天津人，硕士研究生，研究方向：动物
，E-mail：sunnysaihui@126．com。*通讯学分子生物学方向
作者，研究员，博士，博士生导师，从事基因工程和微生物应
E-mail：hui．song@live．com。用技术研究，
10-21收稿日期2011-基金项目
作者简介
木糖产酸试验。将待测的KL6菌液分别接种于D-葡萄糖细L-D-菌微量生化鉴定管、阿拉伯糖细菌微量生化鉴定管、甘D-木糖产酸细菌微量生化鉴定管露醇细菌微量生化鉴定管、
中，每个鉴定管接1ml。将其置于恒温培养振荡器上，在转温度为37℃下培养过夜。另外各留一支不速为220r/min，
接种培养基作为对照。如变黄色，表示产酸，为阳性；不变色或变蓝，则为阴性。在相同条件下与地衣芽孢杆菌DT作对比。1．2．1．2
硝酸盐还原试验。取1ml待测的活化KL6菌液接
种于硝酸盐还原细菌微量生化鉴定管中，后置于恒温培养振荡器上，在转速为220r/min，温度37℃下培养过夜。另留一支不接种培养基作为对照。如变红棕色为阳性，无色为阴性。在相同条件下与地衣芽孢杆菌DT作对比。1．2．1．3
胆汁耐受试验。取1ml待测的活化KL6菌液接种
于胆汁耐受细菌微量生化鉴定管中，后置于恒温培养振荡器上，在转速为220r/min，温度37℃下培养过夜。另留一支不不能生长为阴性。接种培养基作为对照。如能生长为阳性，在相同条件下与地衣芽孢杆菌DT作对比。
1．2．1．450℃条件下生长状况。将纯培养的KL6菌株接种50℃培养24h，于检测培养基，后置于生化培养箱中，观察细菌生长状况。能生长为阳性，不能生长则为阴性。在相同条件下与地衣芽孢杆菌DT作对比。
1．2．1．57%NaCl耐受试验。将纯培养的KL6菌株接种于后置于恒温培养振荡器中培含有7%NaCl的种子培养基，
养，转速为220次/min，温度为37℃，培养24h后能生长为阳性，不能生长为阴性。在相同条件下与地衣芽孢杆菌DT作对比
［2］
（1）温度对生长量的影响。选取25、30、35、37、40和45℃这6个温度作为恒温培养振荡器温度，220r/min培养
［3］
24h后，采用稀释梯度平皿计数法统计活菌数。
（2）氧对生长量的影响。将10、20、30、40ml基础发酵培养基分别装入直径18cm的试管，接入地衣芽孢杆菌KL6，接塞好试管塞并用锡纸将管口包严后置于恒温培种量为1%，
220r/min37℃培养24h测OD600值。养振荡器振荡培养，
每个处理2个重复，并在相同条件下与地衣芽孢杆菌DT作对比。
（3）比浊法测定摇瓶培养地衣芽孢杆菌KL6菌种生长情况。采用基础发酵培养基进行摇瓶培养，恒温培养振荡器转速为220r/min，按接种量1%接入地衣芽孢温度为37℃，
杆菌KL6，每1h测定1次OD600值，用未接种的培养基适当稀释后作空白对照并在相同条件下与地衣芽孢杆菌DT作对比。
表1
试验号123456789
蛋白胨∥%
1．01．01．01．51．51．52．02．02．0
4
正交试验L9（3）
酵母粉∥%
1．01．50．51．01．50．51．01．50．5
NaCl∥%1．50．51．00．51．01．51．01．50．5
MnSO4∥%0．150．100．050．050．150．100．100．050．15
。
淀粉水解试验。用牙签将KL6分别接种于直链与
1．2．1．6
37℃培养24h，支链淀粉培养基表面，后置于生化培养箱，滴加少量碘液，轻轻旋转，使碘液铺满整个平板。菌落周围若出现无色透明圈为阳性，反之为阴性。在相同条件下与地衣芽孢杆菌DT作对比。1．2．1．7
酪蛋白水解试验。用牙签将KL6接种于酪蛋白培
37℃培养24h。菌落周围若养基表面，后置于生化培养箱，出现无色透明圈为阳性，反之为阴性。在相同条件下与地衣芽孢杆菌DT作对比。1．2．1．8
甘露聚糖、果胶、木聚糖、纤维素水解试验。用牙
签将KL6分别接种于甘露聚糖、果胶、木聚糖、纤维素培养基37℃培养24h，表面，后置于生化培养箱，滴加少量0．1%刚果红染液，轻轻旋转，使染液铺满整个平板。菌落周围若出现无色透明圈为阳性，反之为阴性。在相同条件下与地衣芽孢杆菌DT作对比。1．2．21．2．2．1
发酵培养基及条件的优化。
发酵培养基的优化。在单因素试验基础上，采用4
1．2．3发酵罐试验。在摇瓶优化发酵条件的基础上，进行
10L发酵罐的扩大培养。根据发酵罐培养的有关条件，定容6L，121℃灭菌20min，加5‰消泡剂，培养温度37℃，在保证溶氧为50%的情况下调节搅拌转速与通气量。每1h测定1次OD600值，用未接种的培养基适当稀释后作空白对照。试验重复3次。22．12．22．2．1
结果与分析
地衣芽孢杆菌生理生化评价
KL6与对比菌株DT生
理生化评价及产酶评价结果如表2所示。
地衣芽孢杆菌发酵培养基及条件的优化
4种因素对活菌数发酵培养基的优化。从表3可见，
影响的显著性次序为：MnSO4＞NaCl＞酵母粉＞蛋白胨；适NaCl1．0%、25%浓度宜条件为蛋白胨1.0%、酵母粉0．5%、的硫酸锰0．2%。4种因素对芽孢数影响的显著性次序为：MnSO4＞蛋白胨＞NaCl＞酵母粉；适宜条件为蛋白胨1.0%、NaCl1．0%、25%浓度的硫酸锰0．2%。酵母粉0．5%、2．2．2
25～37℃时，随着发酵条件的优化。从图1可见，
OD600值升高，37℃时达到最大值；高于37℃温度的升高，
OD600值反而下降，时，因而地衣芽孢杆菌KL6的最适生长温KL6在装样量为10ml的试管中度为37℃。如图2所示，
OD600值最大，且随着装样量的的升高而下降，说明KL6对氧
因素3水平正交试验（表1），对地衣芽孢杆菌KL6进行摇瓶24h后测定其活菌数及芽孢数。采用稀培养，接种量为1%，释梯度平皿计数法统计活菌数；85℃水浴10min后，采用稀释梯度平皿计数法统计芽孢数。1．2．2．2影响。
发酵条件的优化。采用优化培养基，通过单因子
试验，测定不同温度等条件对地衣芽孢杆菌KL6生长量的
1350
安徽农业科学2012年
的需求较高，在发酵过程中应注意通气量与转速的调整。在
表2
菌株KL6DT菌株KL6DT
D-葡萄糖产酸试验
+
+耐受试验++
L-阿拉伯糖产酸试验
+
+淀粉水解试验++
KL6对氧的需求较高。与DT的比较中可以看出，
生理生化评价及产酶评价
D-木糖产酸试验
+
+甘露聚糖水解试验
+
+
硝酸盐还原试验
+
+果胶水解试验++
胆汁耐受试验++木聚糖水解试验++
50℃条件下是否生长
+
+纤维素水解试验
+
+
D-甘露醇产酸试验
+
+酪蛋白水解试验
+
+
表3
试验号123456789Kh1Kh2Kh3RhKy1Ky2Ky3Ry
蛋白胨%1．01．01．01．51．51．52．02．02．028．6510．1718．2518．4820．295．270．5719．72
酵母粉%1．01．50．51．01．50．51．01．50．520．078．6728．3319．665．380．8919．8718．98
正交试验结果NaCl%1．50．51．00．51．01．51．01．50．54．9817．1734．9229．940．375．7020．0719．70
MnSO4
%0．150．100．050．050．150．100．100．050．153．5716．0837．4233．850．200．8325．1024．90
活菌数0．2013．5072．2527．750．252．5032．2512．2510．25
芽孢数0．101．5859．2015．310．300．200．720．800．20
千万个/ml千万个/ml
图2KL6与DT对氧需求的比较
注：K
h为活菌数均值；Ky为芽孢数均值；Rh为活菌数极差；Ry为芽孢数极差。
图3摇瓶发酵过程中OD600值变化
图1活菌数与温度的关系
如图3所示，在0～5h内，地衣芽孢杆菌KL6处于生长延滞期，镜检可见菌体较小，数量极少；而5～22h是KL6的对数生长期，镜检显示菌体数量急剧增多，形态增大增长，并KL6处于生长稳定期，开始出现芽孢；在24～26h时，镜检可
KL6开始知菌体全部形成芽孢，孢囊略为膨大；从26h开始，进入生长衰亡期，细菌数明显减少，部分芽孢开始脱落。并KL6的生长速度较快。且，从KL6与DT的比较中可以看出，
2．3发酵罐试验如图4所示，在
0～5h内，地衣芽孢杆
镜检可见菌体较小，数量极少
；而在菌KL6处于生长延滞期，
图4
发酵罐发酵过程中OD600值变化
5～15h内，是KL6的对数生长期，镜检显示菌体数量急剧增多，菌体形态增大增长，并开始出现芽孢；在16～18h时，KL6处于生长稳定期，镜检可知菌体全部形成芽孢，孢囊略为膨大；从19h开始，KL6开始进入生长衰亡期，细菌数明显减少，部分芽孢开始脱落。在生产中通常选用处于对数生长期的菌体作为种子，是由于此时的种子既保持有旺盛的增又达到了高浓度可以缩短发酵周期殖能力，
［4］
，因而该试验
40卷3期刘阳等一株地衣芽孢杆菌的性质研究及发酵培养基优化
1351
选定地衣芽孢杆菌KL6发酵罐培养最佳放罐时间应在14～16h。
发酵最终OD600平均值为11．53，发酵罐发酵周期较摇瓶
9
发酵周期短，获得的菌体数量约101．63×10个/ml，芽孢率
生理生化评价及产酶评价，结果表明，地衣芽孢杆菌KL6具有作为微生物饲料添加剂的潜力。通过单因素试验及正交试验方法确定：4种因素对活菌数影响的显著性次序为：MnSO4＞NaCl＞酵母粉＞蛋白胨；对芽孢数影响的显著性次序为：MnSO4＞蛋白胨＞NaCl＞酵母粉。培养基的最佳配比NaCl1．0%、25%浓度的硫酵母粉0．5%、为：蛋白胨1．0%、
进行发酵罐放大培养，酸锰0．2%。生长适宜温度为37℃，
最佳放罐时间应在14～16h，获得的菌体数量约101．63×109个/ml，芽孢率为97．11%。该方法较经验方法收获菌体极大地缩短发酵时间。该试验表明地衣芽孢杆量大大提高，
为以KL6为基础的微生菌KL6能够适于高密度液体发酵，
物饲料添加剂的开发和大规模发酵培养提供了理论依据。参考文献
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为97．11%（图5）。由于发酵罐的搅拌和通氧条件均优于摇瓶发酵，因此，菌体浓度和芽孢同步形成率都明显优于摇瓶发酵
。
图5发酵罐发酵最终活菌数与芽孢数
3结论
该试验对实验室自分离菌株地衣芽孢杆菌KL6进行了
檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪
（上接第1347页）
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刘阳，谭明，潘宝平，宋诙
（1．天津师范大学生命科学学院，天津300387；2．天津工业生物技术研究所基因工程与微生物应用技术研究组，天津300308）
摘要［目的］研究实验室自分离的地衣芽孢杆菌KL6作为微生物饲料添加剂的可行性，并对其发酵培养基进行优化，确定最佳培养条件，为工业化发酵提供依据。［方法］运用表型试验对其进行生理生化评价及产酶评价；运用4因素3水平正交试验和单因素试验对其培养基进行改进，并对其发酵条件进行优化。［结果］地衣芽孢杆菌KL6的D－葡萄糖产酸试验、硝酸盐还原试验、淀粉水解试验等均呈阳性；4种因素对活菌数影响的显著性次序为：MnSO4＞NaCl＞酵母粉＞蛋白胨，对芽孢数影响的显著性次序为：MnSO4＞蛋白胨＞NaCl＞酵母粉，NaCl1．0%、25%浓度的硫酸锰0．2%；生长适宜温度为37℃，培养基的最佳配比为：蛋白胨1．0%、酵母粉0．5%、进行发
9
酵罐放大培养，最佳放罐时间应在14～16h，获得的菌体数量约101．63×10个/ml，芽孢率为97．11%。［结论］体外评价试验表明，地衣芽孢杆菌KL6具有作为微生物饲料添加剂的潜力；发酵培养基及条件优化试验表明，地衣芽孢杆菌KL6能够适于高密度液体发酵。该试验为以KL6为基础的微生物饲料添加剂的开发和大规模发酵培养提供了理论依据。关键词地衣芽孢杆菌；微生物饲料添加剂；发酵；培养基优化；正交试验中图分类号Q935文献标识码A文章编号0517－6611（2012）03－01348－04ResearchontheCharacterandOptimizationofFermentationMediumforBacilluslicheniformis，KL6LIUYangetal（LifeScienceCollege，TianjinNormalUniversity，Tianjin300387）Abstract［Objective］TheaimwastostudythefeasibilityofseparatingBacilluslicheniformis，KL6，asmicrobialfeedadditives，optimizedits
anddeterminedtheoptimumcultureconditionsoastoprovideabasisofindustrialfermentation．［Method］Thephysiologi-fermentationmedium，
calandbiochemicalandenzyme-producingofBacilluslicheniformis，KL6，wereevaluatedbyphenotypictests．Fermentationmediumandcondi-tionsbyand4-factorsand3-levelsorthogonalandsingle-factorexptsimprovedtheculturemediumandoptimizedfermentationcondition．［Re-thesult］Thenumberofviablecellwasinfluencedbyfourfactorsinorderofsignificanceasfollows：MnSO4＞NaCl＞Yeastextract＞Peptone，
numberofsporeswasMnSO4＞Peptone＞NaCl＞Yeastextract，andtheoptimumcultureconditionwas：Peptone1%，Yeastextract0.5%，NaCl1%，25%MnSO4．ThesuitabletemperatureofBacilluslicheniformiswas37℃．Thefermentationprocessofthefermentershouldbestopat14－16h，atthattimethenumberofviablecellwas101．63×109permilliliter，andtherateofsporeswas97．11%．［Conclusion］Ontheba-Bacilluslicheniformis，KL6，hadpotentialasmicrobialfeedadditives．Onthebasisofresultsthatop-sisoftheresultsofinvitroevaluationtest，timizedfermentationmediumandconditions，Bacilluslicheniformis，KL6，wassuitableforhigh-densityfermentationofliquid．Thisexperimentprovidedatheoreticalbasistothedevelopmentofmicrobialfeedadditivesandlarge-scalefermentationwhichwasbasedonKL6．
KeywordsBacilluslicheniformis；Microbialfeedadditives；Fermentation；Mediumoptimization；Phenotypictest
地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）是芽孢杆菌中较具应用潜力的菌种之一，在医药、饲料加工、农药等行业均取得国内外对于地衣芽孢杆菌各方了较好的研究成果。近年来，面应用的报道日益增多
［1］
1%、pH7．0～7．2；基础发酵培养基：氯化钠0．5%、琼脂2%，pH7．0～7．2；直链淀蛋白胨1%、酵母粉0.5%、氯化钠1%，0．5%直链粉培养基：蛋白胨1%、酵母粉0.5%、氯化钠1%，pH7．0～7．2；支链淀粉培养基：蛋白胨1%、淀粉，酵母粉0.5%、0．5%支链淀粉，pH7．0～7．2；酪蛋白培氯化钠1%、0．5%酪蛋白，酵母粉0.5%、氯化钠1%、养基：蛋白胨1%、
pH7．0～7．2；甘露聚糖培养基：蛋白胨1%、酵母粉0.5%、氯0．5%甘露聚糖，pH7．0～7．2；果胶培养基：蛋白胨化钠1%、
1%、0．5%果胶，pH7．0～7．2；木酵母粉0.5%、氯化钠1%、0．5%木聚糖培养基：蛋白胨1%、酵母粉0.5%、氯化钠1%、pH7．0～7．2；纤维素培养基：蛋白胨1%、聚糖，酵母粉0.5%、0．5%纤维素，pH7．0～7．2。以上培养基氯化钠1%、121℃灭菌20min。均需在高压蒸汽灭菌器中灭菌，1．1．3
主要试剂与设备。生理生化鉴定管均购自杭州天和
微生物试剂有限公司。主要设备有精密电子天平、生化培养箱、恒温培养振荡器、洁净工作台、紫外可见分光光度计、实验室pH计、高压蒸汽灭菌器。1．2
方法
生理生化评价及产酶评价。
D-L-D-D-葡萄糖产酸、阿拉伯糖产酸、甘露醇产酸、
1．2．11．2．1．1
。饲用微生态制剂为活菌制剂，具
有改善宿主微生态平衡、提高动物健康水平、促进动物生长提高动物生产性能的作用。笔者通过体外试验研究实发育、
验室分离得到的一株地衣芽孢杆菌KL6菌株的生长特性，及高胆汁环境的耐受能力，并对其发酵条件进行优其对高热、
化，旨在为筛选动物高效益生菌株及其大规模发酵提供理论依据。11．11．1．1
材料与方法材料
供试菌种。地衣芽孢杆菌KL6，分离自云南温泉；地
衣芽孢杆菌CICC23584，购自中国工业微生物菌种保藏管理实验室编号：DT。中心，1．1．2
培养基。种子培养基：蛋白胨1．6%、酵母粉1%、氯
pH7．0～7．2；检测培养基：蛋白胨1．6%、酵母粉化钠0．5%，
天津市科技计划项目（10ZCKFSY06400）。
刘阳（1986－），女，天津人，硕士研究生，研究方向：动物
，E-mail：sunnysaihui@126．com。*通讯学分子生物学方向
作者，研究员，博士，博士生导师，从事基因工程和微生物应
E-mail：hui．song@live．com。用技术研究，
10-21收稿日期2011-基金项目
作者简介
木糖产酸试验。将待测的KL6菌液分别接种于D-葡萄糖细L-D-菌微量生化鉴定管、阿拉伯糖细菌微量生化鉴定管、甘D-木糖产酸细菌微量生化鉴定管露醇细菌微量生化鉴定管、
中，每个鉴定管接1ml。将其置于恒温培养振荡器上，在转温度为37℃下培养过夜。另外各留一支不速为220r/min，
接种培养基作为对照。如变黄色，表示产酸，为阳性；不变色或变蓝，则为阴性。在相同条件下与地衣芽孢杆菌DT作对比。1．2．1．2
硝酸盐还原试验。取1ml待测的活化KL6菌液接
种于硝酸盐还原细菌微量生化鉴定管中，后置于恒温培养振荡器上，在转速为220r/min，温度37℃下培养过夜。另留一支不接种培养基作为对照。如变红棕色为阳性，无色为阴性。在相同条件下与地衣芽孢杆菌DT作对比。1．2．1．3
胆汁耐受试验。取1ml待测的活化KL6菌液接种
于胆汁耐受细菌微量生化鉴定管中，后置于恒温培养振荡器上，在转速为220r/min，温度37℃下培养过夜。另留一支不不能生长为阴性。接种培养基作为对照。如能生长为阳性，在相同条件下与地衣芽孢杆菌DT作对比。
1．2．1．450℃条件下生长状况。将纯培养的KL6菌株接种50℃培养24h，于检测培养基，后置于生化培养箱中，观察细菌生长状况。能生长为阳性，不能生长则为阴性。在相同条件下与地衣芽孢杆菌DT作对比。
1．2．1．57%NaCl耐受试验。将纯培养的KL6菌株接种于后置于恒温培养振荡器中培含有7%NaCl的种子培养基，
养，转速为220次/min，温度为37℃，培养24h后能生长为阳性，不能生长为阴性。在相同条件下与地衣芽孢杆菌DT作对比
［2］
（1）温度对生长量的影响。选取25、30、35、37、40和45℃这6个温度作为恒温培养振荡器温度，220r/min培养
［3］
24h后，采用稀释梯度平皿计数法统计活菌数。
（2）氧对生长量的影响。将10、20、30、40ml基础发酵培养基分别装入直径18cm的试管，接入地衣芽孢杆菌KL6，接塞好试管塞并用锡纸将管口包严后置于恒温培种量为1%，
220r/min37℃培养24h测OD600值。养振荡器振荡培养，
每个处理2个重复，并在相同条件下与地衣芽孢杆菌DT作对比。
（3）比浊法测定摇瓶培养地衣芽孢杆菌KL6菌种生长情况。采用基础发酵培养基进行摇瓶培养，恒温培养振荡器转速为220r/min，按接种量1%接入地衣芽孢温度为37℃，
杆菌KL6，每1h测定1次OD600值，用未接种的培养基适当稀释后作空白对照并在相同条件下与地衣芽孢杆菌DT作对比。
表1
试验号123456789
蛋白胨∥%
1．01．01．01．51．51．52．02．02．0
4
正交试验L9（3）
酵母粉∥%
1．01．50．51．01．50．51．01．50．5
NaCl∥%1．50．51．00．51．01．51．01．50．5
MnSO4∥%0．150．100．050．050．150．100．100．050．15
。
淀粉水解试验。用牙签将KL6分别接种于直链与
1．2．1．6
37℃培养24h，支链淀粉培养基表面，后置于生化培养箱，滴加少量碘液，轻轻旋转，使碘液铺满整个平板。菌落周围若出现无色透明圈为阳性，反之为阴性。在相同条件下与地衣芽孢杆菌DT作对比。1．2．1．7
酪蛋白水解试验。用牙签将KL6接种于酪蛋白培
37℃培养24h。菌落周围若养基表面，后置于生化培养箱，出现无色透明圈为阳性，反之为阴性。在相同条件下与地衣芽孢杆菌DT作对比。1．2．1．8
甘露聚糖、果胶、木聚糖、纤维素水解试验。用牙
签将KL6分别接种于甘露聚糖、果胶、木聚糖、纤维素培养基37℃培养24h，表面，后置于生化培养箱，滴加少量0．1%刚果红染液，轻轻旋转，使染液铺满整个平板。菌落周围若出现无色透明圈为阳性，反之为阴性。在相同条件下与地衣芽孢杆菌DT作对比。1．2．21．2．2．1
发酵培养基及条件的优化。
发酵培养基的优化。在单因素试验基础上，采用4
1．2．3发酵罐试验。在摇瓶优化发酵条件的基础上，进行
10L发酵罐的扩大培养。根据发酵罐培养的有关条件，定容6L，121℃灭菌20min，加5‰消泡剂，培养温度37℃，在保证溶氧为50%的情况下调节搅拌转速与通气量。每1h测定1次OD600值，用未接种的培养基适当稀释后作空白对照。试验重复3次。22．12．22．2．1
结果与分析
地衣芽孢杆菌生理生化评价
KL6与对比菌株DT生
理生化评价及产酶评价结果如表2所示。
地衣芽孢杆菌发酵培养基及条件的优化
4种因素对活菌数发酵培养基的优化。从表3可见，
影响的显著性次序为：MnSO4＞NaCl＞酵母粉＞蛋白胨；适NaCl1．0%、25%浓度宜条件为蛋白胨1.0%、酵母粉0．5%、的硫酸锰0．2%。4种因素对芽孢数影响的显著性次序为：MnSO4＞蛋白胨＞NaCl＞酵母粉；适宜条件为蛋白胨1.0%、NaCl1．0%、25%浓度的硫酸锰0．2%。酵母粉0．5%、2．2．2
25～37℃时，随着发酵条件的优化。从图1可见，
OD600值升高，37℃时达到最大值；高于37℃温度的升高，
OD600值反而下降，时，因而地衣芽孢杆菌KL6的最适生长温KL6在装样量为10ml的试管中度为37℃。如图2所示，
OD600值最大，且随着装样量的的升高而下降，说明KL6对氧
因素3水平正交试验（表1），对地衣芽孢杆菌KL6进行摇瓶24h后测定其活菌数及芽孢数。采用稀培养，接种量为1%，释梯度平皿计数法统计活菌数；85℃水浴10min后，采用稀释梯度平皿计数法统计芽孢数。1．2．2．2影响。
发酵条件的优化。采用优化培养基，通过单因子
试验，测定不同温度等条件对地衣芽孢杆菌KL6生长量的
1350
安徽农业科学2012年
的需求较高，在发酵过程中应注意通气量与转速的调整。在
表2
菌株KL6DT菌株KL6DT
D-葡萄糖产酸试验
+
+耐受试验++
L-阿拉伯糖产酸试验
+
+淀粉水解试验++
KL6对氧的需求较高。与DT的比较中可以看出，
生理生化评价及产酶评价
D-木糖产酸试验
+
+甘露聚糖水解试验
+
+
硝酸盐还原试验
+
+果胶水解试验++
胆汁耐受试验++木聚糖水解试验++
50℃条件下是否生长
+
+纤维素水解试验
+
+
D-甘露醇产酸试验
+
+酪蛋白水解试验
+
+
表3
试验号123456789Kh1Kh2Kh3RhKy1Ky2Ky3Ry
蛋白胨%1．01．01．01．51．51．52．02．02．028．6510．1718．2518．4820．295．270．5719．72
酵母粉%1．01．50．51．01．50．51．01．50．520．078．6728．3319．665．380．8919．8718．98
正交试验结果NaCl%1．50．51．00．51．01．51．01．50．54．9817．1734．9229．940．375．7020．0719．70
MnSO4
%0．150．100．050．050．150．100．100．050．153．5716．0837．4233．850．200．8325．1024．90
活菌数0．2013．5072．2527．750．252．5032．2512．2510．25
芽孢数0．101．5859．2015．310．300．200．720．800．20
千万个/ml千万个/ml
图2KL6与DT对氧需求的比较
注：K
h为活菌数均值；Ky为芽孢数均值；Rh为活菌数极差；Ry为芽孢数极差。
图3摇瓶发酵过程中OD600值变化
图1活菌数与温度的关系
如图3所示，在0～5h内，地衣芽孢杆菌KL6处于生长延滞期，镜检可见菌体较小，数量极少；而5～22h是KL6的对数生长期，镜检显示菌体数量急剧增多，形态增大增长，并KL6处于生长稳定期，开始出现芽孢；在24～26h时，镜检可
KL6开始知菌体全部形成芽孢，孢囊略为膨大；从26h开始，进入生长衰亡期，细菌数明显减少，部分芽孢开始脱落。并KL6的生长速度较快。且，从KL6与DT的比较中可以看出，
2．3发酵罐试验如图4所示，在
0～5h内，地衣芽孢杆
镜检可见菌体较小，数量极少
；而在菌KL6处于生长延滞期，
图4
发酵罐发酵过程中OD600值变化
5～15h内，是KL6的对数生长期，镜检显示菌体数量急剧增多，菌体形态增大增长，并开始出现芽孢；在16～18h时，KL6处于生长稳定期，镜检可知菌体全部形成芽孢，孢囊略为膨大；从19h开始，KL6开始进入生长衰亡期，细菌数明显减少，部分芽孢开始脱落。在生产中通常选用处于对数生长期的菌体作为种子，是由于此时的种子既保持有旺盛的增又达到了高浓度可以缩短发酵周期殖能力，
［4］
，因而该试验
40卷3期刘阳等一株地衣芽孢杆菌的性质研究及发酵培养基优化
1351
选定地衣芽孢杆菌KL6发酵罐培养最佳放罐时间应在14～16h。
发酵最终OD600平均值为11．53，发酵罐发酵周期较摇瓶
9
发酵周期短，获得的菌体数量约101．63×10个/ml，芽孢率
生理生化评价及产酶评价，结果表明，地衣芽孢杆菌KL6具有作为微生物饲料添加剂的潜力。通过单因素试验及正交试验方法确定：4种因素对活菌数影响的显著性次序为：MnSO4＞NaCl＞酵母粉＞蛋白胨；对芽孢数影响的显著性次序为：MnSO4＞蛋白胨＞NaCl＞酵母粉。培养基的最佳配比NaCl1．0%、25%浓度的硫酵母粉0．5%、为：蛋白胨1．0%、
进行发酵罐放大培养，酸锰0．2%。生长适宜温度为37℃，
最佳放罐时间应在14～16h，获得的菌体数量约101．63×109个/ml，芽孢率为97．11%。该方法较经验方法收获菌体极大地缩短发酵时间。该试验表明地衣芽孢杆量大大提高，
为以KL6为基础的微生菌KL6能够适于高密度液体发酵，
物饲料添加剂的开发和大规模发酵培养提供了理论依据。参考文献
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为97．11%（图5）。由于发酵罐的搅拌和通氧条件均优于摇瓶发酵，因此，菌体浓度和芽孢同步形成率都明显优于摇瓶发酵
。
图5发酵罐发酵最终活菌数与芽孢数
3结论
该试验对实验室自分离菌株地衣芽孢杆菌KL6进行了
檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪
（上接第1347页）
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