实训五 酵母菌的形态观察及死活细胞鉴定
一、实验目的
1、观察酵母细胞的形态结构及出芽繁殖；
2、掌握鉴别死活酵母细胞的染色技术；
3、学会水浸制片观察酵母菌。
二、实验原理
酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，细胞一般呈球状、卵圆状、椭圆状、柱状或分枝状的假菌丝。其细胞核与细胞质有明显分化，菌体较细菌大几倍甚至十几倍，在高倍显微镜下即可观察到胞内有明显的细胞核和内含物。酵母菌的繁殖方式分为无性繁殖和有性繁殖两种。无性繁殖大多是以出芽的方式进行，也有分裂繁殖；有性繁殖则是通过接合产生子囊孢子。酵母菌的母细胞经过一系列的芽殖后，如长大的子细胞不与母细胞分离，就会形成藕节状的假菌丝，成为假丝酵母。
用生理盐水（或水-碘液染色液）制作水浸片可以观察酵母菌的形态和出芽繁殖方式。用美蓝染色液制水浸片可鉴别酵母细胞的死活状态。美蓝是一种弱氧化剂，氧化时呈蓝色，还原后呈无色。用美蓝对酵母菌进行染色时，活酵母细胞因新陈代谢不断进行，胞内具有很强的还原能力，能将进入细胞的美蓝还原，使得细胞呈无色。因此，具有还原能力的酵母活细胞为无色，而老化细胞还原能力弱，染色后呈淡蓝色，死细胞则失去还原能力，被染料染成蓝色。
三、实验材料
1、菌种：啤酒酵母或葡萄汁酵母（制成斜面培养物或液体培养物）
2、试剂：0.1%吕氏美蓝染色液、0.05%吕氏美蓝染色液、水-碘液染色液（革兰氏染液用碘液：水=1：3）、0.85%生理盐水
3、仪器及其他：显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、盖玻片、镊子、滴管、酒精灯、蒸馏水、吸水纸等
四、实验时间
2课时
五、实验步骤
（一）生理盐水浸（封）片（酵母菌的形态观察）
1、在载玻片中央加1滴无菌生理盐水（不宜用无菌水制作水浸片，否则细胞易破裂），然后以无菌操作从斜面培养基上用接种环取少量啤酒酵母菌苔与生理盐水混匀，使其分散成云雾状薄层。
2、用镊子取洁净盖玻片，先将其一边与菌液接触，然后缓慢地将盖玻片放下，避免产生气泡影响观察。
3、在显微镜下，先用低倍镜观察，再用高倍镜观察酵母菌的形态、大小及出芽情况。
（二）水-碘液浸片（酵母菌的形态观察）
1、在洁净载玻片中央滴1滴水-碘液，用接种环在火焰区以无菌操作方式从斜面培养基上取出少量菌种（或加1滴酵母菌悬液），与载玻片上的水-碘液相混合。
2、以同样方法盖上盖玻片后镜检。
（三）美蓝染色液制水浸片（酵母菌的死活细胞鉴别）
1、在洁净载玻片上加一滴0.1%吕氏美蓝染色液，用接种环以无菌操作挑取少量酵母菌苔放在美蓝染色液中，混合均匀，染色2-3min 。
2、取一块洁净的盖玻片，先将一边与染液接触，然后慢慢将盖玻片放下，避免产生气泡，并将多余染液用吸水纸吸干。
3、先用低倍镜观察，然后用高倍镜观察酵母的形态、出芽情况和着色情况。着色清晰的是死细胞，无色的是活细胞，淡蓝色的是老龄细胞。
4、染色约0.5h 后再进行观察，注意观察死细胞数量是否增加。
5、用0.05%吕氏美蓝染色液重复上述操作，比较两个浓度的美蓝染液的染色结果。
注意事项
1、如用酵母菌的液体培养物，先稍微振荡使酵母菌上浮，再用接种环以无菌操作方法取培养液。
2、美蓝浓度不宜过高，染色时间不宜过长，否则对细胞活性有影响。
3、美蓝染液不宜过多或过少，否则在加盖玻片时菌液溢出或有气泡。
实训五 酵母菌的形态观察及死活细胞鉴定
一、实验目的
1、观察酵母细胞的形态结构及出芽繁殖；
2、掌握鉴别死活酵母细胞的染色技术；
3、学会水浸制片观察酵母菌。
二、实验原理
酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，细胞一般呈球状、卵圆状、椭圆状、柱状或分枝状的假菌丝。其细胞核与细胞质有明显分化，菌体较细菌大几倍甚至十几倍，在高倍显微镜下即可观察到胞内有明显的细胞核和内含物。酵母菌的繁殖方式分为无性繁殖和有性繁殖两种。无性繁殖大多是以出芽的方式进行，也有分裂繁殖；有性繁殖则是通过接合产生子囊孢子。酵母菌的母细胞经过一系列的芽殖后，如长大的子细胞不与母细胞分离，就会形成藕节状的假菌丝，成为假丝酵母。
用生理盐水（或水-碘液染色液）制作水浸片可以观察酵母菌的形态和出芽繁殖方式。用美蓝染色液制水浸片可鉴别酵母细胞的死活状态。美蓝是一种弱氧化剂，氧化时呈蓝色，还原后呈无色。用美蓝对酵母菌进行染色时，活酵母细胞因新陈代谢不断进行，胞内具有很强的还原能力，能将进入细胞的美蓝还原，使得细胞呈无色。因此，具有还原能力的酵母活细胞为无色，而老化细胞还原能力弱，染色后呈淡蓝色，死细胞则失去还原能力，被染料染成蓝色。
三、实验材料
1、菌种：啤酒酵母或葡萄汁酵母（制成斜面培养物或液体培养物）
2、试剂：0.1%吕氏美蓝染色液、0.05%吕氏美蓝染色液、水-碘液染色液（革兰氏染液用碘液：水=1：3）、0.85%生理盐水
3、仪器及其他：显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、盖玻片、镊子、滴管、酒精灯、蒸馏水、吸水纸等
四、实验时间
2课时
五、实验步骤
（一）生理盐水浸（封）片（酵母菌的形态观察）
1、在载玻片中央加1滴无菌生理盐水（不宜用无菌水制作水浸片，否则细胞易破裂），然后以无菌操作从斜面培养基上用接种环取少量啤酒酵母菌苔与生理盐水混匀，使其分散成云雾状薄层。
2、用镊子取洁净盖玻片，先将其一边与菌液接触，然后缓慢地将盖玻片放下，避免产生气泡影响观察。
3、在显微镜下，先用低倍镜观察，再用高倍镜观察酵母菌的形态、大小及出芽情况。
（二）水-碘液浸片（酵母菌的形态观察）
1、在洁净载玻片中央滴1滴水-碘液，用接种环在火焰区以无菌操作方式从斜面培养基上取出少量菌种（或加1滴酵母菌悬液），与载玻片上的水-碘液相混合。
2、以同样方法盖上盖玻片后镜检。
（三）美蓝染色液制水浸片（酵母菌的死活细胞鉴别）
1、在洁净载玻片上加一滴0.1%吕氏美蓝染色液，用接种环以无菌操作挑取少量酵母菌苔放在美蓝染色液中，混合均匀，染色2-3min 。
2、取一块洁净的盖玻片，先将一边与染液接触，然后慢慢将盖玻片放下，避免产生气泡，并将多余染液用吸水纸吸干。
3、先用低倍镜观察，然后用高倍镜观察酵母的形态、出芽情况和着色情况。着色清晰的是死细胞，无色的是活细胞，淡蓝色的是老龄细胞。
4、染色约0.5h 后再进行观察，注意观察死细胞数量是否增加。
5、用0.05%吕氏美蓝染色液重复上述操作，比较两个浓度的美蓝染液的染色结果。
注意事项
1、如用酵母菌的液体培养物，先稍微振荡使酵母菌上浮，再用接种环以无菌操作方法取培养液。
2、美蓝浓度不宜过高，染色时间不宜过长，否则对细胞活性有影响。
3、美蓝染液不宜过多或过少，否则在加盖玻片时菌液溢出或有气泡。