1. GFP在蛋白质相互作用研究中的应用
在活体内检测蛋白与蛋白相互作用，对我们理解生物学过程至关重要。研究蛋白质相互作用的经典技术是酵母双杂交系统。它是一个基于转录因子模块结构的遗传学方法，由Fields 和Song 等人于1989年首次建立，随后在蛋白相互作用研究领域广泛应用。酵母双杂交系统的实验过程，就是将已知蛋白作为诱饵蛋白，在系统中捕获与其相互作用的蛋白质。来源于水母的GFP 在此系统中得到了广泛应用，人们可用它直接监测蛋白质与蛋白质的相互作用。
科学家利用两个增强型GFP （EGFP ）片段重建功能，从而开发出一种新型的报告系统以应用于酵母双杂交系统。该系统在基因水平上将EGFP 片段分别与诱饵蛋白及要捕获的蛋白融合，在体内共表达，从而研究蛋白与蛋白间的相互作用。与现有的酵母双杂交系统相比，EGFP 系统中的诱饵、靶蛋白载体的报告基因和复制控制元件均得到了改进。在酵母中，当蛋白与蛋白发生相互作用时，分开的EGFP 能够重新结合而发出荧光(图7)
1. 1 构建分离的EGFP 报告质粒
以分离的EGFP 作为酵母双杂交系统的报告基因有明显的优势，因为它不需要外源底物及辅助因子就能发出荧光。从理论上讲，该报告系统的基础是酵母中蛋白与蛋白间发生相互作用后，被分开的荧光蛋白片段会再次互相结合从而发出荧光。EGFP 报告质粒包括pNEGFP 和pCEGFP 。构建模式见图8。
在乙醇脱氢酶1（ADH1）启动子控制下，诱饵蛋白质粒编码的EGFP N-末端（NEGFP, 1-158位氨基酸）及靶蛋白质粒编码的EGFP C-末端（CEGFP, 159-239位氨基酸）能够被组成型表达，其转录被ADH1终止子序列终止。
构建的EGFP 报告质粒pNEGFP 和pCEGFP 分别为色氨酸和亮氨酸选择性，并且它们都是携带有低拷贝数起始位点（CEN6/ARS4起始位点）的着丝粒质粒。这些低拷贝数的质粒降低了蛋白表达水平，从而解决了酵母细胞中的蛋白毒性问题。为了克隆操作的方便，在质粒的多克隆位点（MCS ）还引入了Bam H I、Sal I及Pst I等其它克隆位点。另外，为了评价周围的结构域会否会产生空间位阻效应，研究人员还分析了由多种不同方法构建的EGFP 报告系统，进行构象优化。
下文将以酵母GAL4DD 与GAL11P 的相互作用为例，说明该系统的功能。
1.2 以分离的EGFP 为报告系统的酵母双杂交系统
为了验证当酵母中的蛋白间发生相互作用时，被分离的EGFP 会互补结合，研究人员以GAL4DD 作为诱饵蛋白，GAL11P 作为靶蛋白进行了实验。在蛋白与蛋白相互作用的研究中，经常使用这两种蛋白作为对照。实验中，研究人员将含有GAL11P 的
pCEGFP 质粒（pCEGFP:GAL11P）与包含GAL4DD 的pNEGFP:GAL4DD质粒一起转入酵母细胞，这样酵母就会含有pCEGFP:GAL11P和pNEGFP:GAL4DD两个质粒，这两个质粒均可用于研究荧光重建。另外，由于EGFP 片段（NEGFP 和CEGFP ）的空间位阻效应可能会影响到荧光发色基团的形成，为了确定合适的融合蛋白空间结构，研究人员构建了不同组合的EGFP 报告质粒，它们能够表达不同的EGFP 片段组合（图
9）。
将NEGFP 和CEGFP 融合载体转入YM4217酵母中（该酵母是ura3-52、his3-200、leu2-3和trp1-901突变株），同时添加Ura 、His 、Leu 和Trp 。为了确定酵母细胞是否含有相应的质粒，采用表1中NEGFP 和CEGFP 融合蛋白特异引物进行PCR 扩增。得到的PCR 产物经1%琼脂糖电泳分离后，分别得到594bp （1N-5N ）、474bp （6N ）、513bp （1C-4C, 6C）、243bp （5C ）的扩增产物。如图10a 所示，相应的594bp （
1N-
5N ）、474bp （6N ）、513bp （1C-4C, 6C）、243bp （5C ）PCR 产物只存在于转入后的酵母中，不存在于用作对照的YM4217酵母中，这说明在酵母双杂交系统中可以使用不同的选择标记。
为了确定酵母双杂交系统能否产生荧光，研究人员在共聚焦显微镜下观察表达NEGFP 和CEGFP 融合蛋白的YM4271酵母。计数发出荧光的酵母细胞后，他们发现在不同的NEGFP 和CEGFP 构建方式下，荧光重建效率不同，说明空间效应会影响荧光蛋白的互补结合。如图10b 所示，以全长EGFP 作为阳性对照，荧光重建率（R/E）为67%；而阴性对照，即未转染的酵母细胞根本不发出荧光。
表2总结了相关的荧光重建率百分比。设定酵母细胞转染效率为100%，另外还评估了分离的EGFP 相对于阳性对照的重建率百分比，数据为三个独立样品的平均值。如图10b 和表2所示，以pNEGFP 和pCEGFP 两个空载体转染作为空白对照，EGFP 重建率为14.9%。NEGFP:GAL4DD与CEGFP:GAL11P发生相互作用（图9组合1），与EGFP 阳性对照相比，EGFP 重建率达到40.1%。与此形成鲜明对比的是，
NEGFP:GAL4DD与GAL11P:CEGFP融合蛋白的重建率只有19.4%（图9组合2）。 正如预料一样，NEGFP:GAL4DD与pCEGFP 空载体（图9组合5）不会发生相互作用，作为非特异性对照，其与空白对照（空载体，NEGFP+CEGFP）重建效率相当。
pNEGFP 空载体与pCEGFP:GAL11P质粒（图9组合6）共转染的重建效率也相当低，只有17.9%，并且不会发出荧光。此外，GAL4DD: NEGFP融合蛋白无论与
CEGFP:GAL11P还是GAL11P: CEGFP（图9组合3、4）的重建效率都很低，分别为19.4%和13.4%，都不会发出荧光。这些发现表明，分子结构造成的空间位阻效应使得荧光沉积失败。研究证明，如果NEGFP 和CEGFP 分别在诱饵蛋白和靶蛋白的N-末端
就不会产生严重的空间位阻，从而形成荧光团发出荧光。
总之，在以EGFP 为报告基因的酵母双杂交系统中，当诱饵蛋白与靶蛋白相互作用时，被分开的EGFP 就会重建，其原有的荧光特性得以恢复，而且能够快速直接地监测到这种相互作用。
该系统有三方面的优势：
第一，EGFP 报告基因既不需要外源底物也不需要任何辅助因子；
第二，该系统采用低拷贝数质粒，减少了细胞毒性；
第三，这些转录因子可被用作诱饵蛋白。
1. GFP在蛋白质相互作用研究中的应用
在活体内检测蛋白与蛋白相互作用，对我们理解生物学过程至关重要。研究蛋白质相互作用的经典技术是酵母双杂交系统。它是一个基于转录因子模块结构的遗传学方法，由Fields 和Song 等人于1989年首次建立，随后在蛋白相互作用研究领域广泛应用。酵母双杂交系统的实验过程，就是将已知蛋白作为诱饵蛋白，在系统中捕获与其相互作用的蛋白质。来源于水母的GFP 在此系统中得到了广泛应用，人们可用它直接监测蛋白质与蛋白质的相互作用。
科学家利用两个增强型GFP （EGFP ）片段重建功能，从而开发出一种新型的报告系统以应用于酵母双杂交系统。该系统在基因水平上将EGFP 片段分别与诱饵蛋白及要捕获的蛋白融合，在体内共表达，从而研究蛋白与蛋白间的相互作用。与现有的酵母双杂交系统相比，EGFP 系统中的诱饵、靶蛋白载体的报告基因和复制控制元件均得到了改进。在酵母中，当蛋白与蛋白发生相互作用时，分开的EGFP 能够重新结合而发出荧光(图7)
1. 1 构建分离的EGFP 报告质粒
以分离的EGFP 作为酵母双杂交系统的报告基因有明显的优势，因为它不需要外源底物及辅助因子就能发出荧光。从理论上讲，该报告系统的基础是酵母中蛋白与蛋白间发生相互作用后，被分开的荧光蛋白片段会再次互相结合从而发出荧光。EGFP 报告质粒包括pNEGFP 和pCEGFP 。构建模式见图8。
在乙醇脱氢酶1（ADH1）启动子控制下，诱饵蛋白质粒编码的EGFP N-末端（NEGFP, 1-158位氨基酸）及靶蛋白质粒编码的EGFP C-末端（CEGFP, 159-239位氨基酸）能够被组成型表达，其转录被ADH1终止子序列终止。
构建的EGFP 报告质粒pNEGFP 和pCEGFP 分别为色氨酸和亮氨酸选择性，并且它们都是携带有低拷贝数起始位点（CEN6/ARS4起始位点）的着丝粒质粒。这些低拷贝数的质粒降低了蛋白表达水平，从而解决了酵母细胞中的蛋白毒性问题。为了克隆操作的方便，在质粒的多克隆位点（MCS ）还引入了Bam H I、Sal I及Pst I等其它克隆位点。另外，为了评价周围的结构域会否会产生空间位阻效应，研究人员还分析了由多种不同方法构建的EGFP 报告系统，进行构象优化。
下文将以酵母GAL4DD 与GAL11P 的相互作用为例，说明该系统的功能。
1.2 以分离的EGFP 为报告系统的酵母双杂交系统
为了验证当酵母中的蛋白间发生相互作用时，被分离的EGFP 会互补结合，研究人员以GAL4DD 作为诱饵蛋白，GAL11P 作为靶蛋白进行了实验。在蛋白与蛋白相互作用的研究中，经常使用这两种蛋白作为对照。实验中，研究人员将含有GAL11P 的
pCEGFP 质粒（pCEGFP:GAL11P）与包含GAL4DD 的pNEGFP:GAL4DD质粒一起转入酵母细胞，这样酵母就会含有pCEGFP:GAL11P和pNEGFP:GAL4DD两个质粒，这两个质粒均可用于研究荧光重建。另外，由于EGFP 片段（NEGFP 和CEGFP ）的空间位阻效应可能会影响到荧光发色基团的形成，为了确定合适的融合蛋白空间结构，研究人员构建了不同组合的EGFP 报告质粒，它们能够表达不同的EGFP 片段组合（图
9）。
将NEGFP 和CEGFP 融合载体转入YM4217酵母中（该酵母是ura3-52、his3-200、leu2-3和trp1-901突变株），同时添加Ura 、His 、Leu 和Trp 。为了确定酵母细胞是否含有相应的质粒，采用表1中NEGFP 和CEGFP 融合蛋白特异引物进行PCR 扩增。得到的PCR 产物经1%琼脂糖电泳分离后，分别得到594bp （1N-5N ）、474bp （6N ）、513bp （1C-4C, 6C）、243bp （5C ）的扩增产物。如图10a 所示，相应的594bp （
1N-
5N ）、474bp （6N ）、513bp （1C-4C, 6C）、243bp （5C ）PCR 产物只存在于转入后的酵母中，不存在于用作对照的YM4217酵母中，这说明在酵母双杂交系统中可以使用不同的选择标记。
为了确定酵母双杂交系统能否产生荧光，研究人员在共聚焦显微镜下观察表达NEGFP 和CEGFP 融合蛋白的YM4271酵母。计数发出荧光的酵母细胞后，他们发现在不同的NEGFP 和CEGFP 构建方式下，荧光重建效率不同，说明空间效应会影响荧光蛋白的互补结合。如图10b 所示，以全长EGFP 作为阳性对照，荧光重建率（R/E）为67%；而阴性对照，即未转染的酵母细胞根本不发出荧光。
表2总结了相关的荧光重建率百分比。设定酵母细胞转染效率为100%，另外还评估了分离的EGFP 相对于阳性对照的重建率百分比，数据为三个独立样品的平均值。如图10b 和表2所示，以pNEGFP 和pCEGFP 两个空载体转染作为空白对照，EGFP 重建率为14.9%。NEGFP:GAL4DD与CEGFP:GAL11P发生相互作用（图9组合1），与EGFP 阳性对照相比，EGFP 重建率达到40.1%。与此形成鲜明对比的是，
NEGFP:GAL4DD与GAL11P:CEGFP融合蛋白的重建率只有19.4%（图9组合2）。 正如预料一样，NEGFP:GAL4DD与pCEGFP 空载体（图9组合5）不会发生相互作用，作为非特异性对照，其与空白对照（空载体，NEGFP+CEGFP）重建效率相当。
pNEGFP 空载体与pCEGFP:GAL11P质粒（图9组合6）共转染的重建效率也相当低，只有17.9%，并且不会发出荧光。此外，GAL4DD: NEGFP融合蛋白无论与
CEGFP:GAL11P还是GAL11P: CEGFP（图9组合3、4）的重建效率都很低，分别为19.4%和13.4%，都不会发出荧光。这些发现表明，分子结构造成的空间位阻效应使得荧光沉积失败。研究证明，如果NEGFP 和CEGFP 分别在诱饵蛋白和靶蛋白的N-末端
就不会产生严重的空间位阻，从而形成荧光团发出荧光。
总之，在以EGFP 为报告基因的酵母双杂交系统中，当诱饵蛋白与靶蛋白相互作用时，被分开的EGFP 就会重建，其原有的荧光特性得以恢复，而且能够快速直接地监测到这种相互作用。
该系统有三方面的优势：
第一，EGFP 报告基因既不需要外源底物也不需要任何辅助因子；
第二，该系统采用低拷贝数质粒，减少了细胞毒性；
第三，这些转录因子可被用作诱饵蛋白。