微生物常规生理生化试验
摘要 利用大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）进行淀粉和油脂实验，证明不同微生物对各种有机大分子的水解能力的不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统，掌握进行微生物大分子水解实验的原理和方法；使用大肠杆菌（Escherichia coli）和普通变形杆菌（Proteus vulgaris）进行葡萄糖和乳糖发酵试验，了解糖发酵的原理和在肠道细菌鉴定中的重要作用，掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法；利用大肠杆菌（Escherichia coli）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）进行吲哚试验和甲基红试验，了解两个实验的反应原理以及在肠道细菌鉴定中的意义和方法。 关键词 生理生化 大分子试验 糖发酵试验 吲哚试验 甲基红试验 前言 微生物代谢与其他生物代谢有着许多相似之处，也有不同之处。微生物代谢重要特征之一，就是代谢类型的多样性，因此使得微生物在自然界的物质循环中起着重要的作用，同时也为人类开发利用微生物资源提供更多的机会与途径。人们在微生物的分类鉴定工作中，常利用其生理生化反应作用作为重要依据。
微生物对大分子淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利用。胞外酶主要为水解酶，通过加水裂解大的物质为较小的化合物，使其能被运输至细胞内，这些过程均可以通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实。 糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异。不同的细菌含有发酵不同糖(醇)的酶，因而发酵糖(醇)的能力各不相同，其产生的代谢产物亦不相同，如有的产酸产气，有的产酸不产气。
IMViC试验是吲哚（indol test）、甲基红（methyl red test）、伏-普（Voges-Prokarer test）和柠檬酸盐（cirate test）4个试验的缩写，这4个试验主要是用来快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌，多用于水的细菌检查。
1、材料与方法
1.1材料
1.1.1菌种
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ）、大肠杆菌（Escherichia coli）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。
1.1.2试剂
固体油脂培养基3个、固体淀粉培养基2个、葡萄糖发酵培养基试管和乳糖培养基试管各3支（内装有倒置的德汉氏小管）、蛋白胨水培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基、革兰氏染色用卢戈氏碘染液、甲基红指示剂、乙醚和吲哚试剂等
1.1.3仪器和其他用品
无菌平皿、无菌试管、接种环、试管架等
1.2方法
1.2.1淀粉水解试验
(1)将淀粉培养基溶化后，冷至50℃左右，以无菌操作制成平板。
(2)将制成的平板用记号笔划成四部分，将、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌分别在不同部位无菌操作画“.”接种，并在4部分上写上菌名。
(3)将上述已接种的平板倒置于37℃温室中培养48小时。
(4)将已培养48小时的平皿取出，打开皿盖，滴加少量卢戈氏碘液于平板上，轻轻旋转平皿，使碘液均匀铺满整个平板。
1.2.2油脂水解实验
(1)将溶化的油脂培养基冷至50℃左右时，充分振荡，使油脂均匀分布，用无菌操作倒入平皿中，待凝。
(2)将制成的平板用记号笔划成四部分，分别以金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌作为试验菌，均用无菌操作画“.”接种，并在4部分上写上菌名。
(3)将接种的平板倒置于37℃温室中培养48小时。
(4)取出平板，观察平板底层长菌的地方，如出现红色斑点，说明脂肪被水解，为阳性反应。
1.2.3葡萄糖发酵试验和乳糖发酵试验
（1）用记号笔在各试管外壁上分别标明发酵培养基名称和所接种的细菌菌名。
（2）取葡萄糖发酵培养基试管3支，分别接种标记变形杆菌和大肠杆菌，第三支不接种，作为对照。另取乳糖发酵培养基试管3支，同样分别接入变形杆菌和大肠杆菌，第三支不接种，作为对照。接种后，轻缓摇动试管，使其均匀，防止倒置的小试管进入气泡。
（3）将接种过和作为对照的6支试管置于37℃恒温培养箱培养48h。
（4）观察各试管颜色变化以及德汉氏小管中有无气泡
1.2.4吲哚试验和甲基红试验
(1)将大肠杆菌和产气肠杆菌分别接入2支蛋白胨水培养基（吲哚试验）、2支葡萄糖蛋白胨水培养基（甲基红试验）。
（2）将接种过的4支试管置37℃恒温培养箱培养48h。
（3）吲哚实验：培养2d后的蛋白胨水培养物内加3～4滴乙醚，摇动数次，静至1min，待乙醚上升后，沿管壁徐徐滴加2滴吲哚试剂，产生红色环状物者为阳性反应。
(4)甲基红实验：培养2d后的葡萄糖蛋白胨水培养基内加2滴甲基红试剂，培养物变为红色者为阳性，黄色者为阴性
2、结果与分析
2.1结果
2.1.1四种细菌淀粉及油脂水解实验结果见表Ⅰ-1：
附：“+”表示阳性，“-”表示阴性。 2.1.2葡萄糖发酵及乳糖发酵结果见表Ⅰ-2：
表Ⅰ-2葡萄糖及乳糖发酵试验结果记录
附：“+”表示产酸或产气，“-”表示不产酸或不产气。
2.1.3吲哚试验及甲基红试验结果见表Ⅰ-3：
附：“+”表示阳性反应，“-”表示阴性反应。
2.1.4试验现象见图1-6：
图1 淀粉培养基 图2 油脂培养基
图3葡萄糖培养基试管 图4乳糖培养基试管 图5蛋白胨水试管 图6葡蛋水培养基试管
2.2分析
大分子物质水解试验：淀粉遇碘会产生蓝色，但如果细菌能分泌胞外淀粉酶将胞外淀粉分解、吸收利用，用碘测定不再产生蓝色，在菌苔周围会出现无色透明圈，根据透明圈的大小还能初步判断该菌水解淀粉能力强弱。实验中，只有枯草芽孢杆菌周围出现透明
圈（见图-1），说明在淀粉水解反应中，枯草芽孢杆菌呈阳性，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌呈阴性。脂肪水解后产生脂肪酸可改变培养基的pH，使pH降低，加入培养基的中性红指示剂会使培养基从淡红色变为深红色，说明胞外存在着脂肪酶，实验中，只有铜绿假单胞菌周围出现红色斑点（见图2），说明铜绿假单胞菌的脂肪水解为阳性反应，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌为阴性反应。
糖发酵试验：有的细菌分解某种糖会产生某种有机酸和气体，当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色变为黄色，气体的产生可由倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。实验中，葡萄糖培养基试管中，接种大肠杆菌和变形杆菌的试管内出现气泡且培养基变为黄色，对照组无气泡，培养基仍为紫色；乳糖培养基试管中，接种大肠杆菌的试管内产生气体且变为黄色，接种变形杆菌的试管内无气体且仍为紫色，说明大肠杆菌能分解葡萄糖和乳糖产酸产气，普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。
IMViC试验：吲哚试验可用来检测吲哚的产生，有些细菌产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸，产生吲哚和丙酮酸。吲哚与对二甲基苯甲醛结合形成红色的玫瑰吲哚，但并非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力。试验中，接种大肠杆菌的蛋白质水培养基内，乙醚和培养物之间产生了红色环状物（见图5），为阳性反应，产气杆菌为阴性反应。甲基红试验用来检测由葡萄糖产生的有机酸，当细菌代谢糖产生酸时，培养基就会变酸，使加入培养基中的甲基红指示剂由橙黄色变为红色，即甲基红反应。试验中，只有接种大肠杆菌的葡萄糖蛋白胨水培养基变红色，因此，大肠杆菌为阳性，产气肠杆菌为阴性。
3、小结
本次实验是三个生理生化反应同时做的，虽然实验中六种培养基是六个组分别做的，我们没有亲自体验每一种培养基的制作过程，但从接种到观察的一系列步骤都是每个小组独立完成的，从实验结果来看，实验还算比较成功，从实验中我们理解了生理生化反应的基本原理，也体会到了其在微生物鉴别中的重要性。实验中，我们采用了设计空白对照组的方法，以后的实验中还会经常用到。
在吲哚试验中，由于我们实验组同学的失误，把产气肠杆菌接成了变形杆菌，因此，我们只观察大肠杆菌培养基的红色环，没有观察产气肠杆菌有没有红色环产生，只能借其他同学的产气肠杆菌观察。在以后的实验中，一定要看清实验要求，接种前，要把该标记的标记好，一定要清菌种再接种。
实验一些影响试验成功与否的细节必须注意，在大分子试验中，4种菌接到了一个培养皿中，做好记号十分重要；糖发酵试验中，在接种后，应轻轻摇动试管使其均匀，防止倒置的小管进入气泡，避免造成假象，得出错误结果；吲哚试验中，要注意加入3-4滴乙醚，摇动数次，静置1min，待乙醚上升后，再沿试管壁徐徐加入2滴吲哚试剂，只有这样才能出现红色环状物；在甲基红试验中，注意甲基红不要过量，以免出现假阳性。
4、参考文献
【1】复旦大学出版社1993年 祖若夫 胡宝龙 周德庆 《微生物学实验教程》
【2】高等教育出版社2007年 沈平 陈向东 《微生物学实验 第四版》
【3】高等教育出版社2006年沈平 陈向东 《微生物学 第二版》
微生物常规生理生化试验
摘要 利用大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）进行淀粉和油脂实验，证明不同微生物对各种有机大分子的水解能力的不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统，掌握进行微生物大分子水解实验的原理和方法；使用大肠杆菌（Escherichia coli）和普通变形杆菌（Proteus vulgaris）进行葡萄糖和乳糖发酵试验，了解糖发酵的原理和在肠道细菌鉴定中的重要作用，掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法；利用大肠杆菌（Escherichia coli）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）进行吲哚试验和甲基红试验，了解两个实验的反应原理以及在肠道细菌鉴定中的意义和方法。 关键词 生理生化 大分子试验 糖发酵试验 吲哚试验 甲基红试验 前言 微生物代谢与其他生物代谢有着许多相似之处，也有不同之处。微生物代谢重要特征之一，就是代谢类型的多样性，因此使得微生物在自然界的物质循环中起着重要的作用，同时也为人类开发利用微生物资源提供更多的机会与途径。人们在微生物的分类鉴定工作中，常利用其生理生化反应作用作为重要依据。
微生物对大分子淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利用。胞外酶主要为水解酶，通过加水裂解大的物质为较小的化合物，使其能被运输至细胞内，这些过程均可以通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实。 糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异。不同的细菌含有发酵不同糖(醇)的酶，因而发酵糖(醇)的能力各不相同，其产生的代谢产物亦不相同，如有的产酸产气，有的产酸不产气。
IMViC试验是吲哚（indol test）、甲基红（methyl red test）、伏-普（Voges-Prokarer test）和柠檬酸盐（cirate test）4个试验的缩写，这4个试验主要是用来快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌，多用于水的细菌检查。
1、材料与方法
1.1材料
1.1.1菌种
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ）、大肠杆菌（Escherichia coli）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。
1.1.2试剂
固体油脂培养基3个、固体淀粉培养基2个、葡萄糖发酵培养基试管和乳糖培养基试管各3支（内装有倒置的德汉氏小管）、蛋白胨水培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基、革兰氏染色用卢戈氏碘染液、甲基红指示剂、乙醚和吲哚试剂等
1.1.3仪器和其他用品
无菌平皿、无菌试管、接种环、试管架等
1.2方法
1.2.1淀粉水解试验
(1)将淀粉培养基溶化后，冷至50℃左右，以无菌操作制成平板。
(2)将制成的平板用记号笔划成四部分，将、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌分别在不同部位无菌操作画“.”接种，并在4部分上写上菌名。
(3)将上述已接种的平板倒置于37℃温室中培养48小时。
(4)将已培养48小时的平皿取出，打开皿盖，滴加少量卢戈氏碘液于平板上，轻轻旋转平皿，使碘液均匀铺满整个平板。
1.2.2油脂水解实验
(1)将溶化的油脂培养基冷至50℃左右时，充分振荡，使油脂均匀分布，用无菌操作倒入平皿中，待凝。
(2)将制成的平板用记号笔划成四部分，分别以金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌作为试验菌，均用无菌操作画“.”接种，并在4部分上写上菌名。
(3)将接种的平板倒置于37℃温室中培养48小时。
(4)取出平板，观察平板底层长菌的地方，如出现红色斑点，说明脂肪被水解，为阳性反应。
1.2.3葡萄糖发酵试验和乳糖发酵试验
（1）用记号笔在各试管外壁上分别标明发酵培养基名称和所接种的细菌菌名。
（2）取葡萄糖发酵培养基试管3支，分别接种标记变形杆菌和大肠杆菌，第三支不接种，作为对照。另取乳糖发酵培养基试管3支，同样分别接入变形杆菌和大肠杆菌，第三支不接种，作为对照。接种后，轻缓摇动试管，使其均匀，防止倒置的小试管进入气泡。
（3）将接种过和作为对照的6支试管置于37℃恒温培养箱培养48h。
（4）观察各试管颜色变化以及德汉氏小管中有无气泡
1.2.4吲哚试验和甲基红试验
(1)将大肠杆菌和产气肠杆菌分别接入2支蛋白胨水培养基（吲哚试验）、2支葡萄糖蛋白胨水培养基（甲基红试验）。
（2）将接种过的4支试管置37℃恒温培养箱培养48h。
（3）吲哚实验：培养2d后的蛋白胨水培养物内加3～4滴乙醚，摇动数次，静至1min，待乙醚上升后，沿管壁徐徐滴加2滴吲哚试剂，产生红色环状物者为阳性反应。
(4)甲基红实验：培养2d后的葡萄糖蛋白胨水培养基内加2滴甲基红试剂，培养物变为红色者为阳性，黄色者为阴性
2、结果与分析
2.1结果
2.1.1四种细菌淀粉及油脂水解实验结果见表Ⅰ-1：
附：“+”表示阳性，“-”表示阴性。 2.1.2葡萄糖发酵及乳糖发酵结果见表Ⅰ-2：
表Ⅰ-2葡萄糖及乳糖发酵试验结果记录
附：“+”表示产酸或产气，“-”表示不产酸或不产气。
2.1.3吲哚试验及甲基红试验结果见表Ⅰ-3：
附：“+”表示阳性反应，“-”表示阴性反应。
2.1.4试验现象见图1-6：
图1 淀粉培养基 图2 油脂培养基
图3葡萄糖培养基试管 图4乳糖培养基试管 图5蛋白胨水试管 图6葡蛋水培养基试管
2.2分析
大分子物质水解试验：淀粉遇碘会产生蓝色，但如果细菌能分泌胞外淀粉酶将胞外淀粉分解、吸收利用，用碘测定不再产生蓝色，在菌苔周围会出现无色透明圈，根据透明圈的大小还能初步判断该菌水解淀粉能力强弱。实验中，只有枯草芽孢杆菌周围出现透明
圈（见图-1），说明在淀粉水解反应中，枯草芽孢杆菌呈阳性，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌呈阴性。脂肪水解后产生脂肪酸可改变培养基的pH，使pH降低，加入培养基的中性红指示剂会使培养基从淡红色变为深红色，说明胞外存在着脂肪酶，实验中，只有铜绿假单胞菌周围出现红色斑点（见图2），说明铜绿假单胞菌的脂肪水解为阳性反应，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌为阴性反应。
糖发酵试验：有的细菌分解某种糖会产生某种有机酸和气体，当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色变为黄色，气体的产生可由倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。实验中，葡萄糖培养基试管中，接种大肠杆菌和变形杆菌的试管内出现气泡且培养基变为黄色，对照组无气泡，培养基仍为紫色；乳糖培养基试管中，接种大肠杆菌的试管内产生气体且变为黄色，接种变形杆菌的试管内无气体且仍为紫色，说明大肠杆菌能分解葡萄糖和乳糖产酸产气，普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。
IMViC试验：吲哚试验可用来检测吲哚的产生，有些细菌产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸，产生吲哚和丙酮酸。吲哚与对二甲基苯甲醛结合形成红色的玫瑰吲哚，但并非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力。试验中，接种大肠杆菌的蛋白质水培养基内，乙醚和培养物之间产生了红色环状物（见图5），为阳性反应，产气杆菌为阴性反应。甲基红试验用来检测由葡萄糖产生的有机酸，当细菌代谢糖产生酸时，培养基就会变酸，使加入培养基中的甲基红指示剂由橙黄色变为红色，即甲基红反应。试验中，只有接种大肠杆菌的葡萄糖蛋白胨水培养基变红色，因此，大肠杆菌为阳性，产气肠杆菌为阴性。
3、小结
本次实验是三个生理生化反应同时做的，虽然实验中六种培养基是六个组分别做的，我们没有亲自体验每一种培养基的制作过程，但从接种到观察的一系列步骤都是每个小组独立完成的，从实验结果来看，实验还算比较成功，从实验中我们理解了生理生化反应的基本原理，也体会到了其在微生物鉴别中的重要性。实验中，我们采用了设计空白对照组的方法，以后的实验中还会经常用到。
在吲哚试验中，由于我们实验组同学的失误，把产气肠杆菌接成了变形杆菌，因此，我们只观察大肠杆菌培养基的红色环，没有观察产气肠杆菌有没有红色环产生，只能借其他同学的产气肠杆菌观察。在以后的实验中，一定要看清实验要求，接种前，要把该标记的标记好，一定要清菌种再接种。
实验一些影响试验成功与否的细节必须注意，在大分子试验中，4种菌接到了一个培养皿中，做好记号十分重要；糖发酵试验中，在接种后，应轻轻摇动试管使其均匀，防止倒置的小管进入气泡，避免造成假象，得出错误结果；吲哚试验中，要注意加入3-4滴乙醚，摇动数次，静置1min，待乙醚上升后，再沿试管壁徐徐加入2滴吲哚试剂，只有这样才能出现红色环状物；在甲基红试验中，注意甲基红不要过量，以免出现假阳性。
4、参考文献
【1】复旦大学出版社1993年 祖若夫 胡宝龙 周德庆 《微生物学实验教程》
【2】高等教育出版社2007年 沈平 陈向东 《微生物学实验 第四版》
【3】高等教育出版社2006年沈平 陈向东 《微生物学 第二版》