细菌的生化鉴定

试验三细菌的生化鉴定

试验目的：掌握常用细菌生化鉴定方法和结果判定

熟悉细菌生化反应的临床意义，

试验仪器：电热恒温培养箱、电冰箱、蒸汽高压灭菌器、超净工作台、电子天平、

普通光学显微镜、鼓风电干燥箱、电磁炉、微波炉、生物安全柜等

试验材料：菌种：大肠埃希菌

培养基：EMB、KIA、葡萄糖、乳糖、甘露醇、麦芽糖、蔗糖

试剂：革兰染液

试验步骤：

1、分离培养：EMB平板制备，并分离划线；

2、形态学观察：

①菌落形态观察;观察比较三种细菌在EMB琼脂培养基上的菌落有何区别，并加以描述。

②菌体形态观察；革兰染色，将三种细菌涂在一张载玻片上，镜下观察细菌形态

3、生化鉴定：穿刺接种五糖管、双糖铁

4、血清学鉴定：伤寒沙门菌、志贺菌

5、结果报告

①菌落形态特征描述；

②菌体镜下形态画图

③生化鉴定结果；以列表形式给出，KIA用 -/-或+/-或-/+表示

④血清学鉴定结果

6、讨论：针对试验出现问题加以讨论。

讲解：

1、细菌鉴定的基本步骤：

①分离培养观察菌落形态特征：大小、湿润度、边缘、特征等。

②革兰染色：观察镜下菌体形态特征及染色性。

③生化鉴定：不同系均具有各自独立的酶系统，因而对底物的分解力各不相同，其代谢的产物也各异。这些代谢产物又个具有不同的生物化学特征，可利用生物化学的方法测定这些代谢产物以鉴定细菌。在临床细菌检验工作中，除根据细菌的形态、染色、培养特性进行初步鉴定外，对绝大多数分离的未知菌的属、种的鉴定无论是应用手工鉴定还是自动化仪器鉴定，都需要通过这些生物化学试验来实现，可见掌握各种生化反应的原理和应用是细菌鉴定的基础。因此依托前两项（特性观察和染色性）的结果，选择特征性的生化试验，是细菌鉴定的必要步骤。 ④血清学鉴定：在以上结果符合所检定的目的菌时，选择相应的鉴定血清做进一步鉴定菌种。

2、培养基成分及原理、接种方法及用途：

① 伊红---美兰培养基（EMB）：该培基中含有4%伊红和6.5%美兰两种指示剂及0.5%的乳糖和0.5%蔗糖，若被检菌能分解乳糖产酸，使培基的pH下降，则促使伊红与美兰结合成紫红色或紫黑色复合物，并附着于菌落的表面，且使菌落表面带有金属光泽；而碱性环境中二者不结合。故不分解乳糖的细菌其菌落无色。

伊红---美兰有抑制G+生长的作用，但粪链球菌除外。

该培养基亦是肠道菌的鉴别培养基。

接种方法：四区划线

② 双糖铁培养基原理：该培养基中加0.1%的葡萄糖、1%的乳糖及0.4%酚红。细菌分解糖类产酸指示剂可使培养基由原来的红色变为黄色。若细菌只分解葡萄糖而不分解乳糖，因乳糖含量少，所以产生的酸量亦少，由于斜面部分暴露在空气中面积大，产生少量的酸又在有O2的情况下被氧化，加之细菌利用培养基中含

氮物质，生成碱性产物，失去改变局部酸碱度的作用，故使斜面后来又变红，所以培养基斜面部分由培养初期的黄色变为红色，故观察结果时，斜面部分“不变色”仍呈红色；而在高层中生长的细菌，虽然产生的酸量亦少，因处于相对无O2状态，产生的酸不能被氧化分解，故使高层部分培养基仍保持黄色。由于该培

养基中含有Fe2+,若所检目的菌代谢产生H2S，则H2S+ Fe2+反应生成FeS使培养基

变黑。培养基中含有的硫代硫酸钠是一种还原剂，防止培养基中氧化物与H2S作

用而影响FeS的生成。该培基是鉴别肠道致病菌的一个非常重要的鉴别培养基。

接种方法：由培养基中央垂直刺入至距管底0.4cm处，再沿穿刺线退出接种针。双糖铁等有高层及斜面之分的培养基，先穿刺接种高层部分，退出接种针后直接在斜面上来回蛇形划线（可来回多划几次）

。

③ 五管糖：葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖。指示剂为0.4%溴麝香草酚蓝。若细菌分解相应的糖产酸，使指示剂由蓝色变为黄色。

接种方法：穿刺接种，同样不能直插到底，以防产气时漏掉观察。

3、血清学试验：凡符合沙门菌属属者，需做血清血鉴定。取一环相应的血清于

载玻片上，再取少量的被检菌与之混合，同时做生理盐水阴性对照。

结果判断：数分钟内出现肉眼可见的颗粒状凝集物即为阳性。

注意事项：1、平板倾注量：高度为平板高度的1/3，标记在皿。

2、注意穿刺接种用接种针不能穿到管底。

3、生化反应结果以列表形式报告。KIA结果用 +/-表示。