实验3 邻二氮菲吸光光度法测定痕量铁
一、实验目的
通过吸光光度法测定铁的基本条件试验，学习如何选择吸光光度分析的实验条件，并掌握吸光光度测量的基本方法和S22PC 型分光光度计的使用方法。
二、实验原理
物质分子对光辐射的吸收，是可以用一个连续改变波长的单色光来进行测量的，方法是用单色光照射某一吸光物质，测量单色光照射前后的强度，即入射光强度I 0 ，以及透过吸光物质后的透射光强度I ，并定义透光度T 为
T=I/I0 （3-1）
定义吸光度A 为
A=lg(1/T)=lg(I0/I) (3-2)
用测量仪器记录该物质在每一波长处的吸光度（A ）或透光度（T ），便可以得到该物质的吸收光谱或透射光谱。
根据朗伯（Lambert) 和比尔（Beer) 等人对物质在每一波长处吸收辐射的定量关系的研究，描述辐射强度和吸收物的吸收光程及浓度的关系式就称之为光吸收定律，其表示式为 A=lg(1/T)=lg(I0/I)=εbc (3-3)
式中 为摩尔吸光系数[L·(mol·cm) -1]，b 为吸收光程（cm) ，c 吸收物质的摩尔浓度（mol·L -1）。
光吸收定律确定了吸光度和吸收物质浓度之间的定量关系，因此它是紫外可见吸光光度法（或称分光光度法）进行定量分析的依据。应用此公式时应注意：①入射辐射必须是单色光；②光辐射与物质的作用仅限于吸收，若同时有散射、荧光和光化学反应产生将会引进较大误差；③吸收时，吸收体系中的各物质之间应无相互作用；④光吸收定律的线性关系只有在吸光物质低含量或稀溶液时才能成立。
实际定量测定时，吸收光程为定值，式（3-3）可写作
A=kc (3-4)
式中k 为与被测组分内在的相关性质因素以及实验测量条件有关的常数。它通过标准溶液测得的A 值来求出。实际采用的办法是，在某一浓度范围内，制备一系列不同浓度的被测物质的标准溶液c s ，在控制相同的实验条件下，测出它们的相应信号A s ~cs 直线来表达，其斜率便是k 值。然后再测定被测物质的未知试液的信号A x ，即可从拟合方程或作图所得的直线上获得被测物质在未知试液中的浓度c x 。这条A s ~cs 直线就是实验的校准曲线，也称工作曲线或标准曲线。拟合方程称为校准函数。这是一种间接的定量方法。
吸光度的实际测量方法是用同一强度的单色光通过相同光程测量溶液的液槽（又称比色皿）应配对，即液槽的厚度及透光窗面应完全一致。这样可消除盛放溶液的容器、溶剂对光
吸收的影响，以及溶液中被测物质以外的影响吸光度测量的因素。一般来说，参比溶液可选用溶剂、或除被测组分以外的试剂溶液，视测试体系的具体情况而定。
在可见区的吸光光度测量中，若被测组分本身有色，则可直接测量。若被测组分本身无色或颜色很浅，则可用显色剂与其反应（即显色反应），生成有色化合物，再进行吸光度的测量。大多数显色反应是络合反应，对显色反应有以下要求。
（1）灵敏度足够高，一般选择反应生成物的摩尔吸光系数大的显色反应，以适合于微量组分的测定。
（2）选择性好，干扰少或容易消除。
（3）生成的有色化合物组成恒定，化学性质稳定，与显色剂有较大的颜色差别。 在建立一个新的吸光光度的方法时，为了获得较高的灵敏度和准确度，应从显色反应和测量条件两个方面，考虑下列因素。
（1）研究被测离子、显色剂和有色化合物的吸收光谱，一般选择吸收光谱峰值波长为测量波长。
（2）溶液pH 值对吸光度的影响。
（3）显色剂用量、显色时间、颜色的稳定性及温度对吸光度的影响。
（4）被测离子符合比尔定律的浓度范围。
（5）干扰离子的影响及其排除的方法。
（6）参比溶液的选择。
此外，对方法的精密度和准确度，也需进行试验。
铁的显色试剂很多，例如硫氰酸铵、巯基乙酸、磺基水杨酸钠等。邻二氮菲是测定微量铁的一种较好的试剂，它与二价铁离子反应，成稳定的橙红色络合物（lgK 稳=21.3）
此反应很灵敏，络合物的摩尔吸光系数为1.1×104L·（mol·cm ）-1。在pH 2～9之间，颜色深度与酸度无关，而且很稳定，在有还原剂存在的条件下，颜色深度可以保持几个月不变。本方法的选择性很高，相当于铁含量40倍的Sn 2+、Al 3+、Ca 2+、M g2+、Zn 2+、SiO 32-；20倍的Cr 3+、M n2+、VO 3-、PO 43-；5倍的Co 2+、Cu 2+等均不干扰测定，所以此法应用很广。
三、仪器和试剂
1、仪器
S22PC 型分光光度计（附1cm 液槽2个）
容量瓶 50mL20个
滴定管 50mL1支
吸量管 1mL1支，2mL1支，6mL1支
量杯 10mL1个
2、试剂
铁标准溶液 100ug·mL-1：准确称取0.8634gNH 4Fe （SO 4）·12H 2O ，置于烧杯中，加入
20mL1：1（体积）的盐酸和少量水。溶解后，转移至1L 容量品中，用水稀释至刻度，摇匀
盐酸羟胺溶液 10％（临用时配置）
邻二氮菲溶液 0.15％（临用时配置）：应先用少许酒精溶解，再用水稀释
醋酸钠溶液 1mol·L -1
氢氧化钠 0.1mol·L -1 精密pH 试纸
四、实验步骤
1、绘制吸收曲线并选择测量波长
取两个50mL 容量瓶，其中一个加入0.60mL100ug·mL -1铁标准溶液。然后，在2个容量瓶中各加入1mL10％盐酸羟胺溶液，2mL0.15％邻二氮菲溶液及5mL1mol·L -1醋酸钠溶液，用水稀释至刻度，摇匀。
在S22PC 型分光光度计上，用1cm 液槽，以下不含铁的试剂溶液作参比溶液，在波长为450~540nm间，每隔5nm 测一次吸光度。操作方法见附录S22PC 型分光光度计及液槽的使用。以波长为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制吸收曲线。选择吸收曲线的峰值波长为本实验测量波长。
2、显色剂用量的确定
取10个50 mL容量瓶，每个瓶中都加入0.60mL100ug·m L-1铁标准溶液，1mL10％盐酸羟胺溶液，然后分别加入0、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.50、2.50及4.00mL0.15％邻二氮菲溶液。最后都加入5mL1mol·L-1醋酸钠溶液，用水稀释至刻度，摇匀。以不含显色剂的溶液作为参比溶液，使用1cm 液槽，在选定波长下测量。以显色剂浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘图。确定显色剂用量。
3、pH 值的影响
取9个50mL 容量瓶，每个瓶中都加入0.60mL100ug·mL -1铁标准溶液，1mL10％盐酸羟胺溶液，2mL0.15％邻二氮菲溶液。然后，用滴定管依次加入0、2.00、5.00、8.00、10.00、20.00、22.00、25.00及30.00mL0.1mol·L-1氢氧化钠溶液，用水稀释至刻度，摇匀。用精密pH 试纸测定上列溶液的pH 值。（也可用PH 计测量溶液的PH 。）再用1cm 液槽，以不含铁的各自相应的试剂溶液做参比溶液，在所选定的波长测量下吸光度。以PH 值为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制曲线。找出合适的PH 值范围。
4、绘制吸光度对铁的影响
取9个50ml 容量瓶，分别加入0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.60及2.00ml 100ug·mL -1铁标准溶液，每个容量瓶再加入1mL 10%盐酸羟胺溶液，2ml 0.15%邻二氮菲溶液，以及5ml 1mol·L -1醋酸钠溶液，用水稀释至刻度，摇匀，得一系列标准溶液。在选定的波长下，用1cm 液槽，以不含铁的试剂溶液作参比溶液，测量各个溶液的吸光度。以吸光度对铁的浓度作图。
5、未知试样溶液的测定
取3个50mL 容量瓶，分别移取5.00mL 未知试样溶液，按试验步骤 4 的方法配制溶液，并测量吸光度。
五、数据处理
（1）记录不同波长及相应吸光度，绘制吸收曲线，并确定最大吸峰值波长。
（2）记录显色剂用量与吸光度关系，绘制相应曲线，并确定实验应选择的显色剂用量。
（3）记录不同PH 值溶液的吸光度，绘制相应的曲线，从中决定颜色不变的PH 值范围。
（4）记录系列标准溶液浓度及相应的吸光度，绘制吸光度对铁浓度的曲线，并确定其线性范围。从曲线求得未知试样溶液原始浓度的平均值，相对平均偏差。
六、思考题
（1）实验中，盐酸羟胺、醋酸钠的作用是什么？若用氢氧化钠代替醋酸钠，有什么缺点？
（2）以本实验为例，说明溶液的颜色和吸收曲线峰值波长有何关系？
（3）试分析实验得到的吸光度对铁的浓度曲线。
（4）根据实验结果，计算铁（II ）-邻二氮菲络合物的摩尔吸光系数。
七、实验拓展
（1）用实验证实体系中不加还原剂盐酸羟胺，对测量吸光度的影响。
（2）本实验体系生成的铁（II)-邻二氮菲络合物非常稳定，请设计一个实验，测量该络合物的吸光度随时间的变化。发色后，多长时间达到稳定。
实验3 邻二氮菲吸光光度法测定痕量铁
一、实验目的
通过吸光光度法测定铁的基本条件试验，学习如何选择吸光光度分析的实验条件，并掌握吸光光度测量的基本方法和S22PC 型分光光度计的使用方法。
二、实验原理
物质分子对光辐射的吸收，是可以用一个连续改变波长的单色光来进行测量的，方法是用单色光照射某一吸光物质，测量单色光照射前后的强度，即入射光强度I 0 ，以及透过吸光物质后的透射光强度I ，并定义透光度T 为
T=I/I0 （3-1）
定义吸光度A 为
A=lg(1/T)=lg(I0/I) (3-2)
用测量仪器记录该物质在每一波长处的吸光度（A ）或透光度（T ），便可以得到该物质的吸收光谱或透射光谱。
根据朗伯（Lambert) 和比尔（Beer) 等人对物质在每一波长处吸收辐射的定量关系的研究，描述辐射强度和吸收物的吸收光程及浓度的关系式就称之为光吸收定律，其表示式为 A=lg(1/T)=lg(I0/I)=εbc (3-3)
式中 为摩尔吸光系数[L·(mol·cm) -1]，b 为吸收光程（cm) ，c 吸收物质的摩尔浓度（mol·L -1）。
光吸收定律确定了吸光度和吸收物质浓度之间的定量关系，因此它是紫外可见吸光光度法（或称分光光度法）进行定量分析的依据。应用此公式时应注意：①入射辐射必须是单色光；②光辐射与物质的作用仅限于吸收，若同时有散射、荧光和光化学反应产生将会引进较大误差；③吸收时，吸收体系中的各物质之间应无相互作用；④光吸收定律的线性关系只有在吸光物质低含量或稀溶液时才能成立。
实际定量测定时，吸收光程为定值，式（3-3）可写作
A=kc (3-4)
式中k 为与被测组分内在的相关性质因素以及实验测量条件有关的常数。它通过标准溶液测得的A 值来求出。实际采用的办法是，在某一浓度范围内，制备一系列不同浓度的被测物质的标准溶液c s ，在控制相同的实验条件下，测出它们的相应信号A s ~cs 直线来表达，其斜率便是k 值。然后再测定被测物质的未知试液的信号A x ，即可从拟合方程或作图所得的直线上获得被测物质在未知试液中的浓度c x 。这条A s ~cs 直线就是实验的校准曲线，也称工作曲线或标准曲线。拟合方程称为校准函数。这是一种间接的定量方法。
吸光度的实际测量方法是用同一强度的单色光通过相同光程测量溶液的液槽（又称比色皿）应配对，即液槽的厚度及透光窗面应完全一致。这样可消除盛放溶液的容器、溶剂对光
吸收的影响，以及溶液中被测物质以外的影响吸光度测量的因素。一般来说，参比溶液可选用溶剂、或除被测组分以外的试剂溶液，视测试体系的具体情况而定。
在可见区的吸光光度测量中，若被测组分本身有色，则可直接测量。若被测组分本身无色或颜色很浅，则可用显色剂与其反应（即显色反应），生成有色化合物，再进行吸光度的测量。大多数显色反应是络合反应，对显色反应有以下要求。
（1）灵敏度足够高，一般选择反应生成物的摩尔吸光系数大的显色反应，以适合于微量组分的测定。
（2）选择性好，干扰少或容易消除。
（3）生成的有色化合物组成恒定，化学性质稳定，与显色剂有较大的颜色差别。 在建立一个新的吸光光度的方法时，为了获得较高的灵敏度和准确度，应从显色反应和测量条件两个方面，考虑下列因素。
（1）研究被测离子、显色剂和有色化合物的吸收光谱，一般选择吸收光谱峰值波长为测量波长。
（2）溶液pH 值对吸光度的影响。
（3）显色剂用量、显色时间、颜色的稳定性及温度对吸光度的影响。
（4）被测离子符合比尔定律的浓度范围。
（5）干扰离子的影响及其排除的方法。
（6）参比溶液的选择。
此外，对方法的精密度和准确度，也需进行试验。
铁的显色试剂很多，例如硫氰酸铵、巯基乙酸、磺基水杨酸钠等。邻二氮菲是测定微量铁的一种较好的试剂，它与二价铁离子反应，成稳定的橙红色络合物（lgK 稳=21.3）
此反应很灵敏，络合物的摩尔吸光系数为1.1×104L·（mol·cm ）-1。在pH 2～9之间，颜色深度与酸度无关，而且很稳定，在有还原剂存在的条件下，颜色深度可以保持几个月不变。本方法的选择性很高，相当于铁含量40倍的Sn 2+、Al 3+、Ca 2+、M g2+、Zn 2+、SiO 32-；20倍的Cr 3+、M n2+、VO 3-、PO 43-；5倍的Co 2+、Cu 2+等均不干扰测定，所以此法应用很广。
三、仪器和试剂
1、仪器
S22PC 型分光光度计（附1cm 液槽2个）
容量瓶 50mL20个
滴定管 50mL1支
吸量管 1mL1支，2mL1支，6mL1支
量杯 10mL1个
2、试剂
铁标准溶液 100ug·mL-1：准确称取0.8634gNH 4Fe （SO 4）·12H 2O ，置于烧杯中，加入
20mL1：1（体积）的盐酸和少量水。溶解后，转移至1L 容量品中，用水稀释至刻度，摇匀
盐酸羟胺溶液 10％（临用时配置）
邻二氮菲溶液 0.15％（临用时配置）：应先用少许酒精溶解，再用水稀释
醋酸钠溶液 1mol·L -1
氢氧化钠 0.1mol·L -1 精密pH 试纸
四、实验步骤
1、绘制吸收曲线并选择测量波长
取两个50mL 容量瓶，其中一个加入0.60mL100ug·mL -1铁标准溶液。然后，在2个容量瓶中各加入1mL10％盐酸羟胺溶液，2mL0.15％邻二氮菲溶液及5mL1mol·L -1醋酸钠溶液，用水稀释至刻度，摇匀。
在S22PC 型分光光度计上，用1cm 液槽，以下不含铁的试剂溶液作参比溶液，在波长为450~540nm间，每隔5nm 测一次吸光度。操作方法见附录S22PC 型分光光度计及液槽的使用。以波长为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制吸收曲线。选择吸收曲线的峰值波长为本实验测量波长。
2、显色剂用量的确定
取10个50 mL容量瓶，每个瓶中都加入0.60mL100ug·m L-1铁标准溶液，1mL10％盐酸羟胺溶液，然后分别加入0、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.50、2.50及4.00mL0.15％邻二氮菲溶液。最后都加入5mL1mol·L-1醋酸钠溶液，用水稀释至刻度，摇匀。以不含显色剂的溶液作为参比溶液，使用1cm 液槽，在选定波长下测量。以显色剂浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘图。确定显色剂用量。
3、pH 值的影响
取9个50mL 容量瓶，每个瓶中都加入0.60mL100ug·mL -1铁标准溶液，1mL10％盐酸羟胺溶液，2mL0.15％邻二氮菲溶液。然后，用滴定管依次加入0、2.00、5.00、8.00、10.00、20.00、22.00、25.00及30.00mL0.1mol·L-1氢氧化钠溶液，用水稀释至刻度，摇匀。用精密pH 试纸测定上列溶液的pH 值。（也可用PH 计测量溶液的PH 。）再用1cm 液槽，以不含铁的各自相应的试剂溶液做参比溶液，在所选定的波长测量下吸光度。以PH 值为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制曲线。找出合适的PH 值范围。
4、绘制吸光度对铁的影响
取9个50ml 容量瓶，分别加入0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.60及2.00ml 100ug·mL -1铁标准溶液，每个容量瓶再加入1mL 10%盐酸羟胺溶液，2ml 0.15%邻二氮菲溶液，以及5ml 1mol·L -1醋酸钠溶液，用水稀释至刻度，摇匀，得一系列标准溶液。在选定的波长下，用1cm 液槽，以不含铁的试剂溶液作参比溶液，测量各个溶液的吸光度。以吸光度对铁的浓度作图。
5、未知试样溶液的测定
取3个50mL 容量瓶，分别移取5.00mL 未知试样溶液，按试验步骤 4 的方法配制溶液，并测量吸光度。
五、数据处理
（1）记录不同波长及相应吸光度，绘制吸收曲线，并确定最大吸峰值波长。
（2）记录显色剂用量与吸光度关系，绘制相应曲线，并确定实验应选择的显色剂用量。
（3）记录不同PH 值溶液的吸光度，绘制相应的曲线，从中决定颜色不变的PH 值范围。
（4）记录系列标准溶液浓度及相应的吸光度，绘制吸光度对铁浓度的曲线，并确定其线性范围。从曲线求得未知试样溶液原始浓度的平均值，相对平均偏差。
六、思考题
（1）实验中，盐酸羟胺、醋酸钠的作用是什么？若用氢氧化钠代替醋酸钠，有什么缺点？
（2）以本实验为例，说明溶液的颜色和吸收曲线峰值波长有何关系？
（3）试分析实验得到的吸光度对铁的浓度曲线。
（4）根据实验结果，计算铁（II ）-邻二氮菲络合物的摩尔吸光系数。
七、实验拓展
（1）用实验证实体系中不加还原剂盐酸羟胺，对测量吸光度的影响。
（2）本实验体系生成的铁（II)-邻二氮菲络合物非常稳定，请设计一个实验，测量该络合物的吸光度随时间的变化。发色后，多长时间达到稳定。