基于同步扫描相机的荧光寿命测量系统研究

第26卷第4期

2009年10月

深圳大学学报理工版

JOURNAL OF SHE NZHE N UN I V ERSI TY SC I E NCE AND E NGI N EER I N G

Vol 126No 14Oct 12009

文章编号:100022618(2009) 0420331206

【生物医学工程】

基于同步扫描相机的荧光寿命测量系统研究

邵永红, 李　恒

1, 2

, 王　岩, 屈军乐, 牛憨笨

111

(1. 深圳大学光电工程学院, 光电子器件与系统教育部重点实验室, 广东省光电子器件与系统重点实验室, 深圳518060;

2. 西安工业大学光电工程学院, 西安710032)

摘　要:建立一台基于同步扫描相机的双光子激发荧光寿命显微测量系统, 频率为76MHz, 利用钛宝石飞秒激光器作为光源, 、扫描速度以及非线性等进行标定. 该系统的时间分辨率为9p 4%, 1. 测量了荧光染料Rose Bengal (R s B ) 的荧光衰减曲线, , 得到R s B 的荧光寿命为763p s, 关键词:; 同步扫描相机; 扫描速度; 时间分辨率:Q 　　　　文献标识码:A 　　荧光显微技术是生命科学研究和临床诊断的重要工具. 荧光具有多参量特性, 荧光光谱可反映样品组分, 荧光寿命可反映荧光分子所处微环境信息. 通过测量荧光寿命, 可间接获得荧光分子所处微环境内的生理生化参数, 如pH 值、离子浓度(Ca 2+和K +等) 和氧压等. 荧光寿命测量和成像结合可定量获取样品功能信息, 具有直观、准确和信息全面等优点, 已在生物物理、生物化学及临床医学诊断等领域获得广泛应用

[224][1]

寿命显微测量系统. 和文献[12, 13]中重复频率为1MHz 的扫描相机系统相比, 该系统采用重复频率为76MHz 的同步扫描相机, 可大幅提高光能利用率. 该系统具有时间分辨率高、非线性小、扫描速度可调以及灵敏度高等优点. 利用钛蓝宝石飞秒激光器和一组标准具对系统的时间分辨率、扫描速度和扫描非线性等参数进行了标定, 并测量了荧光染料Rose Bengal 的寿命. 实验结果表明, 该系统在不同扫描速度下具有皮秒量级的时间分辨率和良好的扫描非线性特性, 且荧光寿命的测量精度高. 这种基于高重复频率同步扫描相机的荧光寿命显微测量技术, 可在生物医学研究及临床诊断等领域得到广泛应用.

[527]

近年来, 随着多光子激发技术的发展

, 荧

光光谱和荧光显微技术也取得较大进展. 双光子激发采用近红外光作为激发光源, 具有对样品中焦点以外区域的光漂白和光损伤小、荧光成像穿透深度深、荧光激发波长范围宽、激发光与荧光容易分离等优点. 结合荧光寿命测量, 双光子荧光显微技术具有更高的时间分辨率和空间分辨率.

基于扫描相机的荧光寿命测量方法近年日趋受到关注, 渐显强大优势

[8211]

1　实验系统及工作原理

本文所建立的双光子激发荧光寿命显微测量系统如图1. 该系统由钛蓝宝石锁模飞秒激光器、荧光显微镜、样品台、同步扫描相机、光锥耦合CCD 实时读出系统以及计算机等组成. 扫描相机采用S20多碱阴极, 光谱响应范围为185～900n m , 灵

. 同步扫描相机具有时

间分辨率高、测量时间短、灵敏度高、适于高重复频率微弱荧光信号的测量、可提供随时间连续变化的信息以及能记录荧光衰减全过程等优点

[9, 10]

. 本

文建立了一台基于同步扫描相机的双光子激发荧光

收稿日期:

基金项目:作者简介:通讯作者:

敏度为100μA /l m .

2009205208; 修回日期:2009206208

国家自然科学基金资助项目(60627003) ; 广东省科技计划资助项目(2008a060205003) 邵永红(19722) , 男(汉族) , 吉林省德惠市人, 深圳大学副教授、博士. E 2mail:shaoyh@szu 1edu 1cn 牛憨笨(19402) , 男(汉族) , 中国工程院院士、深圳大学研究员. E 2mail:hbniu@szu 1edu 1cn

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　332深圳大学学报理工版第26

卷

etal on, 简称FP 标准具) . 标准具的前反射面在800n m 的反射率为50%, 后反射面为100%, 前后表

面严格平行. FP 标准具腔长为20mm , 腔介质为

K9玻璃. 激光经过标准具后产生一列脉冲串, 相

邻两个光脉冲的时间间隔Δt 与玻璃片厚度d g 和玻

璃的折射率n g 有关, 即

Δt =2n g d g /c . (1) 其中, c 为光在真空中传播速度. 由标准具输出的

图1　双光子激发荧光寿命显微测量系统

F i g 11　Setup of two 2photon exc it a ti on fluorescence

li feti m e spectro m eter

钛蓝宝石锁模飞秒激光器输出光脉冲的重复频率为76MHz, 脉冲宽度为120fs, 700n m 范围内连续可调. 脉冲序列通过50/50分束镜后成像到扫描相机的狭

缝上. 当扫描相机处于静态时, 受偏转系统作用, ; , , 3, 图中相邻狭缝像的空间距离对应光脉冲的

π/4范时间间隔. 在正弦波偏转电压信号过零点±

围内可近似为线性变化, 对此区域的扫描近似为线性扫描, 即扫描相机的有效工作区

分成两束. , DM , 对样品进行双光

子激发, , 由镜头f 1成像到扫描相机的光电阴极上. 另一束触发光束通过P I N 转换成电信号, 经滤波和放大后产生一高压正弦波作为扫描相机的扫描信号. 光电阴极发出的光电子在正弦偏转电压作用下进行偏转, 将时间衰减变化的荧光信号转化为扫描相机荧光屏上空间位置变化的荧光信号, 最后, 利用光锥耦合CCD 实时读出系统记录荧光衰减信号. 通过对荧光

衰减曲线进行拟合分析, 可得样品的荧光寿命.

2　扫描相机的标定

211时间分辨率与扫描速度的标定

扫描相机的标定光路如图2. 钛蓝宝石锁模飞

[14]

秒激光器输出光脉冲的波长为800n m , 经30/70分束镜后, 一部分光进入P I N 用于触发扫描电路, 另一部分光进入法布里-珀罗标准具(Fabry 2Per ot

图2　相机标定原理图

F i g 12　Sche ma ti c illustra ti on of Streak cam era ca li bra ti on

图3　扫描相机动态测量结果

F i g 13　Result of the streak cam era

dynam i c m ea surem en t

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第4期邵永红, 等:基于同步扫描相机的荧光寿命测量系统研究　333

本文将时间分辨率定义为相机在动态工作条件

下狭缝像的最大半高全宽(full width half maxi m u m , F WHM ) 所对应的时间. 由式(1) 可计算得到相邻两个脉冲之间的时间间隔为204p s, 通过测量相邻两个狭缝像所占的像素数, 能算出每个像素所占的时间, 再得到狭缝像的半高全宽所占像素数, 并计算出对应的时间, 即为相机的时间分辨率. 扫描电路的输入功率不同, 时间分辨率也不同, 功率和时间分辨率的关系如表1. 改变放大器的输入功率, 可改变加到偏转板上的正弦扫描电压线性区的斜

率, 从而改变相机的扫描速度. 该系统扫描电路的

输入功率与扫描速度的关系如表1. 根据表1数据进行拟合, 得到扫描速度U 与功率P 的关系曲线如图4, 两者满足

U =K

P .

(2)

由于扫速U 与通道时间T ch 成反比, 故通道时间与功率P 的关系为

T ch =N /

P .

(3)

其中, 式(2) 和式(3) 中的和N 都为经验常数. 通过对表178, N =21604.

表1　扫描相机的标定结果　　　　Table 1　Ca li of P /W

T ch /ps

Δτ/ps

17. 01. . 520310. 389. 74

U /(mm ・ns

-1

) 量程2. 1. 681. 471. 381. 30

P s 9. 428. 948. 628. 278. 008. 93

U /(mm ・ns

-1

) 量程/ns

1. 251. 191. 151. 101. 061. 02

0. 51. 01. 52. 02. 52. 8

3. 4022. 2. 1. 1. 7301. 633

. 13. 16. 7919. 2120. 4321. 64

3. 03. 54. 04. 24. 55. 0

1. 5701. 4901. 4371. 3791. 3341. 276

22. 5023. 7224. 5825. 6226. 4827. 70

图4　扫描速度和通道时间与扫描信号功率关系曲线

F i g 14　Curve of sweep speed and p i xel ti m e w ith scann i n g si gna l power

212　非线性的标定

表示为

ζ=

n d

从理论上讲, 荧光屏上各狭缝像之间的时间间

隔应该是相等的, 但在实际测量中各条纹之间的时间间隔有偏差, 如图3. 这主要是因为正弦偏转电压是非线性的. 虽然本文假设正弦波电压过零点在π/4范围内是线性变化的, 但实际上该扫描信号±

具有非线性, 从而导致扫描速度在荧光屏上的不同其位置各异, 测量扫描非线性对评估系统性能指标及提高测量精度具有重要意义. 扫描相机的非线性

∑(d

- d ) , 　i =1, 2, …, n .

(4)

其中, d i 为第i 个条纹的间距; d 为所有条纹间距的

均值.

实验中, 我们分别对功率为310W 、315W 和410W 的常用量程进行非线性标定, 得到对应的非线性值为3186%、3188%和2133%.由此可见, 该扫描相机的扫描电路具有良好的非线性.

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　334深圳大学学报理工版第26卷

(5) 对图5(b ) 中的数据进行最小二乘拟合, 得

3　荧光寿命测量实验

对于单组分荧光团的寿命测量, 其荧光强度衰减可表示为单指数函数

I (t ) =I 0e

τ-t/

到Rose Bengal 染料的荧光寿命约为763p s, 与文献

[12]的寿命值相符.

结　语

(5)

其中, I 0是t =0时的荧光强度; I (t ) 是样品受到光

脉冲激发后t 时刻测量得到的荧光强度; τ为荧光寿命, 是荧光分子的特征值; 为荧光强度I 衰减到初

-1

始值I 0的e (37%) 时所需要的时间. 对于复杂的多组分问题, 可采用多指数函数荧光衰减曲线拟合的方法

[15, 16]

本文建立了一台基于同步扫描相机的双光子激发荧光寿命显微测量系统, 其时间分辨率为9p s, 扫描非线性小于4%, 时间测量量程为218ns, 可的测量. , , 该系统, 从而得到更多的寿命信息; , 还可实现双光子激发多光谱分辨荧光寿命测量和成像, 为区分多荧光团或多组分生物组织提供互补的对比机制具.

[17219]

, 分别求出各个组分的强度和荧光寿命.

(a ) . 图5(. 根据式

, 可为生物医学研究提供一种强大的研究工

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[6]

[7]

图5　Rose Benga l 染料的荧光寿命图像

及荧光强度衰减曲线

F i g 15　Fluorescence li feti m e i m age and i n ten sity decay curve of Rose Benga l

[8]

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【B i o m ed i ca l Eng i n eer i n g 】

A fluorescence li fetim e spectro m eter ba sed

on a synchroscan streak cam era

SHAO Y ong 2hong , L I Heng , W ANG Yan ,

QU Jun 2le , and Hanben N I U

　　1) College of Op t oelectr onic Engineering

Key Laborat ory of Op t oelectr onic Devices and 　System s of M inistry of Educati on,

Key Labor ot ory of Op t oelectr onics Devices 　and System s of Guangdong Pr ovince, Shenzhen University Shenzhen 518060P . R. China

2) College of Op t 2electr o Engineering

Xi πan Technol ogical University Xi πan 710032P . R. China

1, 2

Abstract:A t w o 2phot on excitati on fluorescence lifeti m e s pectr ometer based on a synchr oscan streak ca mera was

p resented . The s pectr ometer was calibrated using a Titanium:Sapphire fe m t osecond laser in conjuncti on with a cust om 2made synchr onized streak circuit, tunable delay generat or and a set of etal ons . Experi m ental results show that the te mporal res oluti on of this s pectr ometer is 9p s, nonlinearity is less than 4%, and the s weep range is 218ns . Fluorescence decay p r ofile of fluorescent dye Rose Bengal (R s B ) is recorded with the s pectr ometer . Nonlinear least square fitting of the decay p r ofile gives that the lifeti m e of R s B is 763p s, consistent with standard fluorescence dyes .

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　336深圳大学学报理工版第26卷

Key words:fluorescence m icr oscopy; fluorescence lifeti m e; t w o 2phot on excitati on; synchr oscan streak ca mera; s weep s peed; te mporal res oluti on

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【中文责编:英　子; 英文责编:雨　辰】

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2009年10月

深圳大学学报理工版

JOURNAL OF SHE NZHE N UN I V ERSI TY SC I E NCE AND E NGI N EER I N G

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文章编号:100022618(2009) 0420331206

【生物医学工程】

基于同步扫描相机的荧光寿命测量系统研究

邵永红, 李　恒

1, 2

, 王　岩, 屈军乐, 牛憨笨

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(1. 深圳大学光电工程学院, 光电子器件与系统教育部重点实验室, 广东省光电子器件与系统重点实验室, 深圳518060;

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, 荧

基于扫描相机的荧光寿命测量方法近年日趋受到关注, 渐显强大优势

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1　实验系统及工作原理

. 同步扫描相机具有时

间分辨率高、测量时间短、灵敏度高、适于高重复频率微弱荧光信号的测量、可提供随时间连续变化的信息以及能记录荧光衰减全过程等优点

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. 本

文建立了一台基于同步扫描相机的双光子激发荧光

收稿日期:

基金项目:作者简介:通讯作者:

敏度为100μA /l m .

2009205208; 修回日期:2009206208

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etal on, 简称FP 标准具) . 标准具的前反射面在800n m 的反射率为50%, 后反射面为100%, 前后表

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K9玻璃. 激光经过标准具后产生一列脉冲串, 相

邻两个光脉冲的时间间隔Δt 与玻璃片厚度d g 和玻

璃的折射率n g 有关, 即

Δt =2n g d g /c . (1) 其中, c 为光在真空中传播速度. 由标准具输出的

图1　双光子激发荧光寿命显微测量系统

F i g 11　Setup of two 2photon exc it a ti on fluorescence

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钛蓝宝石锁模飞秒激光器输出光脉冲的重复频率为76MHz, 脉冲宽度为120fs, 700n m 范围内连续可调. 脉冲序列通过50/50分束镜后成像到扫描相机的狭

缝上. 当扫描相机处于静态时, 受偏转系统作用, ; , , 3, 图中相邻狭缝像的空间距离对应光脉冲的

π/4范时间间隔. 在正弦波偏转电压信号过零点±

围内可近似为线性变化, 对此区域的扫描近似为线性扫描, 即扫描相机的有效工作区

分成两束. , DM , 对样品进行双光

衰减曲线进行拟合分析, 可得样品的荧光寿命.

2　扫描相机的标定

211时间分辨率与扫描速度的标定

扫描相机的标定光路如图2. 钛蓝宝石锁模飞

[14]

秒激光器输出光脉冲的波长为800n m , 经30/70分束镜后, 一部分光进入P I N 用于触发扫描电路, 另一部分光进入法布里-珀罗标准具(Fabry 2Per ot

图2　相机标定原理图

F i g 12　Sche ma ti c illustra ti on of Streak cam era ca li bra ti on

图3　扫描相机动态测量结果

F i g 13　Result of the streak cam era

dynam i c m ea surem en t

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第4期邵永红, 等:基于同步扫描相机的荧光寿命测量系统研究　333

本文将时间分辨率定义为相机在动态工作条件

率, 从而改变相机的扫描速度. 该系统扫描电路的

输入功率与扫描速度的关系如表1. 根据表1数据进行拟合, 得到扫描速度U 与功率P 的关系曲线如图4, 两者满足

U =K

P .

(2)

由于扫速U 与通道时间T ch 成反比, 故通道时间与功率P 的关系为

T ch =N /

P .

(3)

其中, 式(2) 和式(3) 中的和N 都为经验常数. 通过对表178, N =21604.

表1　扫描相机的标定结果　　　　Table 1　Ca li of P /W

T ch /ps

Δτ/ps

17. 01. . 520310. 389. 74

U /(mm ・ns

-1

) 量程2. 1. 681. 471. 381. 30

P s 9. 428. 948. 628. 278. 008. 93

U /(mm ・ns

-1

) 量程/ns

1. 251. 191. 151. 101. 061. 02

0. 51. 01. 52. 02. 52. 8

3. 4022. 2. 1. 1. 7301. 633

. 13. 16. 7919. 2120. 4321. 64

3. 03. 54. 04. 24. 55. 0

1. 5701. 4901. 4371. 3791. 3341. 276

22. 5023. 7224. 5825. 6226. 4827. 70

图4　扫描速度和通道时间与扫描信号功率关系曲线

F i g 14　Curve of sweep speed and p i xel ti m e w ith scann i n g si gna l power

212　非线性的标定

表示为

ζ=

n d

从理论上讲, 荧光屏上各狭缝像之间的时间间

具有非线性, 从而导致扫描速度在荧光屏上的不同其位置各异, 测量扫描非线性对评估系统性能指标及提高测量精度具有重要意义. 扫描相机的非线性

∑(d

- d ) , 　i =1, 2, …, n .

(4)

其中, d i 为第i 个条纹的间距; d 为所有条纹间距的

均值.

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　334深圳大学学报理工版第26卷

(5) 对图5(b ) 中的数据进行最小二乘拟合, 得

3　荧光寿命测量实验

对于单组分荧光团的寿命测量, 其荧光强度衰减可表示为单指数函数

I (t ) =I 0e

τ-t/

到Rose Bengal 染料的荧光寿命约为763p s, 与文献

[12]的寿命值相符.

结　语

(5)

其中, I 0是t =0时的荧光强度; I (t ) 是样品受到光

脉冲激发后t 时刻测量得到的荧光强度; τ为荧光寿命, 是荧光分子的特征值; 为荧光强度I 衰减到初

-1

始值I 0的e (37%) 时所需要的时间. 对于复杂的多组分问题, 可采用多指数函数荧光衰减曲线拟合的方法

[15, 16]

[17219]

, 分别求出各个组分的强度和荧光寿命.

(a ) . 图5(. 根据式

, 可为生物医学研究提供一种强大的研究工

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F i g 15　Fluorescence li feti m e i m age and i n ten sity decay curve of Rose Benga l

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【B i o m ed i ca l Eng i n eer i n g 】

A fluorescence li fetim e spectro m eter ba sed

on a synchroscan streak cam era

SHAO Y ong 2hong , L I Heng , W ANG Yan ,

QU Jun 2le , and Hanben N I U

　　1) College of Op t oelectr onic Engineering

Key Laborat ory of Op t oelectr onic Devices and 　System s of M inistry of Educati on,

Key Labor ot ory of Op t oelectr onics Devices 　and System s of Guangdong Pr ovince, Shenzhen University Shenzhen 518060P . R. China

2) College of Op t 2electr o Engineering

Xi πan Technol ogical University Xi πan 710032P . R. China

1, 2

Abstract:A t w o 2phot on excitati on fluorescence lifeti m e s pectr ometer based on a synchr oscan streak ca mera was

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　336深圳大学学报理工版第26卷

Key words:fluorescence m icr oscopy; fluorescence lifeti m e; t w o 2phot on excitati on; synchr oscan streak ca mera; s weep s peed; te mporal res oluti on

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【中文责编:英　子; 英文责编:雨　辰】

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基于同步扫描相机的荧光寿命测量系统研究

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