实验二 琼脂糖凝胶电泳的制备及核酸检测
一. 实验目的
1、掌握琼脂糖凝胶电泳的原理;
2、学习琼脂糖凝胶电泳的操作。
二、实验原理
溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与DNA的含量成正比。用肉眼观察，可检测到5 ng以上的DNA。
1．影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素：
1)DNA分子大小
迁移速率U与logN成反比（N为碱基对数目）。分子大小相等，电荷基本相等（DNA结构重复性）。分子越大，迁移越慢。等量的空间结构紧密的电泳快（超螺旋>线性DNA）
2) 琼脂糖浓度：不同的凝胶浓度，分辨不同范围的DNA
Agarose： 0.5%： 1-30 kb；
0.7%： 0.8-12 kb
1.2%： 0.4-7 kb；
1.5%： 0.2-3 kb.
3)DNA构象：一般迁移速率超螺旋环状>线状DNA>单链开环
4)所加电压：低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过5V/cm
5)碱基组成与温度：一般影响不大4 -30 ℃
6)嵌入染料的存在：降低线性DNA迁移率，(不提倡加在电泳液中)
7)电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的迁移率，无离子存在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致DNA变性，一般采用1×TAE，1×TBE，1×TPE（均含EDTA pH8.0）。
2．溴化乙锭（EB）为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。
3．电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝呈蓝紫色；二甲苯晴呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。
4、电泳缓冲液：TAE TBE
TAE 与 TBE不同之处在于TBE用硼酸代替了TAE中的冰醋酸。
三、仪器和试剂
仪器
微量移液器，电泳仪，电泳槽，微波炉
试剂
琼脂糖：1.0%；
电泳缓冲液（50 × TAE 电泳缓冲液取Tris24.2g ，冰醋酸5.7ml ， 0.25mol/L EDTA (pH8.0)20ml ，加蒸馏水至100ml ）
EB：5 µl / 100 ml TBE
电泳材料：标准分子量核酸（DL2000）
四、操作步骤
（1）制胶（以20 mL为例）
a. 称取0.2 g 琼脂糖，加入20 ml 的TAE缓冲液（pH 8.0），摇匀； b. 微波炉加热，至琼脂糖完全溶解（要防止过热溢出三角瓶）；
c. 将制胶板放入制胶槽中，插入适当的梳子，将溶解的琼脂糖（约50℃）加入2ul EB后，混均匀，倒入其中，直至厚度为4～6 mm（如有气泡要把气泡赶出），在室温下冷却凝固(约30~ 45 min)；
d. 将制胶板置于电泳槽中，小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。
（2）点样
用微量移液器将5 µl含蓝色染液的 DL2000 加入点样孔下部。
（3）电泳
打开电源开关，调节电压至3~5 V/cm(约100 V)，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约30-40分钟后即可观察结果。
（4）观察
将电泳好的胶置于紫外透射检测仪上，打开紫外灯，可见到橙红色核酸条带，根据条带粗细，可粗略估计该样品DNA的浓度。如同时有已知分子量的标准DNA进行电泳，则可通过线性DNA条带的相对位置初步估计样品的分子量。
五、实验结果与分析
1、有条带跑完电泳后两边淡，中间较粗，很可能是由于点样时不均匀，两边点样较少；
2、有条带跑完电泳后看不见，很可能是由于样品未加入点样孔，飘浮在电泳液里了
六、思考题
做琼脂糖凝胶电泳应注意哪些问题？
1、加样时枪头不要碰坏凝胶壁，否则DNA的带型将不会整齐，加样前要用枪头吸打凝胶孔中的溶液，以赶走样品空中的气泡。2、应注意每孔最大上样容量及样品孔体积，以免加样时样品流入附近样品孔造成交叉污染，影响结果分析。
3．配琼脂糖时应使其完全熔化后方可制胶。
4．琼脂糖凝胶易于破碎，操作时要轻缓。
5．电泳时应注意电源线路，预防触电。
6．溴化乙淀具有致癌作用，配制及使用时应带乳胶或一次性塑料手套。并在专门的实验室内使用。
7．紫外线对人体有损伤作用，开灯时间不宜太长，注意防护。
实验二 琼脂糖凝胶电泳的制备及核酸检测
一. 实验目的
1、掌握琼脂糖凝胶电泳的原理;
2、学习琼脂糖凝胶电泳的操作。
二、实验原理
溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与DNA的含量成正比。用肉眼观察，可检测到5 ng以上的DNA。
1．影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素：
1)DNA分子大小
迁移速率U与logN成反比（N为碱基对数目）。分子大小相等，电荷基本相等（DNA结构重复性）。分子越大，迁移越慢。等量的空间结构紧密的电泳快（超螺旋>线性DNA）
2) 琼脂糖浓度：不同的凝胶浓度，分辨不同范围的DNA
Agarose： 0.5%： 1-30 kb；
0.7%： 0.8-12 kb
1.2%： 0.4-7 kb；
1.5%： 0.2-3 kb.
3)DNA构象：一般迁移速率超螺旋环状>线状DNA>单链开环
4)所加电压：低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过5V/cm
5)碱基组成与温度：一般影响不大4 -30 ℃
6)嵌入染料的存在：降低线性DNA迁移率，(不提倡加在电泳液中)
7)电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的迁移率，无离子存在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致DNA变性，一般采用1×TAE，1×TBE，1×TPE（均含EDTA pH8.0）。
2．溴化乙锭（EB）为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。
3．电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝呈蓝紫色；二甲苯晴呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。
4、电泳缓冲液：TAE TBE
TAE 与 TBE不同之处在于TBE用硼酸代替了TAE中的冰醋酸。
三、仪器和试剂
仪器
微量移液器，电泳仪，电泳槽，微波炉
试剂
琼脂糖：1.0%；
电泳缓冲液（50 × TAE 电泳缓冲液取Tris24.2g ，冰醋酸5.7ml ， 0.25mol/L EDTA (pH8.0)20ml ，加蒸馏水至100ml ）
EB：5 µl / 100 ml TBE
电泳材料：标准分子量核酸（DL2000）
四、操作步骤
（1）制胶（以20 mL为例）
a. 称取0.2 g 琼脂糖，加入20 ml 的TAE缓冲液（pH 8.0），摇匀； b. 微波炉加热，至琼脂糖完全溶解（要防止过热溢出三角瓶）；
c. 将制胶板放入制胶槽中，插入适当的梳子，将溶解的琼脂糖（约50℃）加入2ul EB后，混均匀，倒入其中，直至厚度为4～6 mm（如有气泡要把气泡赶出），在室温下冷却凝固(约30~ 45 min)；
d. 将制胶板置于电泳槽中，小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。
（2）点样
用微量移液器将5 µl含蓝色染液的 DL2000 加入点样孔下部。
（3）电泳
打开电源开关，调节电压至3~5 V/cm(约100 V)，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约30-40分钟后即可观察结果。
（4）观察
将电泳好的胶置于紫外透射检测仪上，打开紫外灯，可见到橙红色核酸条带，根据条带粗细，可粗略估计该样品DNA的浓度。如同时有已知分子量的标准DNA进行电泳，则可通过线性DNA条带的相对位置初步估计样品的分子量。
五、实验结果与分析
1、有条带跑完电泳后两边淡，中间较粗，很可能是由于点样时不均匀，两边点样较少；
2、有条带跑完电泳后看不见，很可能是由于样品未加入点样孔，飘浮在电泳液里了
六、思考题
做琼脂糖凝胶电泳应注意哪些问题？
1、加样时枪头不要碰坏凝胶壁，否则DNA的带型将不会整齐，加样前要用枪头吸打凝胶孔中的溶液，以赶走样品空中的气泡。2、应注意每孔最大上样容量及样品孔体积，以免加样时样品流入附近样品孔造成交叉污染，影响结果分析。
3．配琼脂糖时应使其完全熔化后方可制胶。
4．琼脂糖凝胶易于破碎，操作时要轻缓。
5．电泳时应注意电源线路，预防触电。
6．溴化乙淀具有致癌作用，配制及使用时应带乳胶或一次性塑料手套。并在专门的实验室内使用。
7．紫外线对人体有损伤作用，开灯时间不宜太长，注意防护。