基因工程综合实验
武汉科技大学医学院生化教研室
目 录
分子生物学实验综合规程································································································3 参考书目 ··························································································································3 实验内容····························································································································4 实验一 实验基础知识和基本技能培训··········································································5 实验二 大肠杆菌感受态细胞的制备··············································································7 实验三 质粒DNA 的转化·······························································································8 实验四 碱裂解法提取质粒DNA····················································································9 实验五PCR 基因扩增·····································································································11 实验六DNA 的限制性核酸内切酶消化········································································13 实验七琼脂糖凝胶电泳检测DNA·················································································15
分子生物学实验综合规程
☐ 上课时间提前5分钟进入实验室；不迟到、不早退，无故旷课累计3次没成绩； ☐ 请假须医院病假条或班主任签字的假条；
☐ 上课时需穿实验服，不许在实验室内吃东西，不背着书包做实验，不穿拖鞋进实验室； ☐ 实验课期间不许打闹、闲聊等，不大声喧哗，保持课堂纪律，实验过程中，至始至终需全组同学一起完成，任何人中途不得缺席。
☐ 必须做到课前认真预习，课间做好实验记录、课后详细总结实验结果并按时提交实验报告；
☐ 公用试剂不得污染！每次都必须用新枪头。公用台上公用试剂不得私自拿到自己实验台上；
☐ 不得私自拿走或乱放别人的实验物品、实验产品；
☐ 不得擅自使用实验室中非本实验仪器、试剂。
☐ 实验废液不随便倾倒，随时保持实验台的整洁；
☐ 爱护实验器材，实验器材损坏必须按规定赔偿；
☐ 实验前按仪器性能与要求，进行仪器预热；
☐ 实验完成后检查电源插座，用完仪器后必须复位，仪器清洁干净 、摆放整齐；每组实验物品齐全，需教师验收，枪量程要归位，发现问题及时报修；
☐ 每位同学负责自己实验台面和柜体的卫生，值日生负责公用实验台、地面等处卫生； ☐ 每次轮到打扫卫生的小组，要认真做好值日工作，离开实验室须向教师声明；
☐ 同学与老师之间、同学与同学之间、实验班与实验班之间一定要互相协作配合保持公用房间卫生，注意门窗水电的安全。
☐ 遵守通用的实验室规则。
违反上述任何一条规则责任自负，并要扣分，造成损失要照价赔偿。
参考书目：分子生物学实验指导，魏群 主编，高教出版社
分子生物学实验指导，刘进元 主编，清华大学出版社
实 验 内 容
实验一 分子生物学实验的基本知识和基本技能培训
实验二 大肠杆菌感受态细胞的制备
实验三 质粒DNA 的转化
实验四 碱裂解法提取质粒DNA
实验五PCR 基因扩增
实验六DNA 的限制性核酸内切酶消化
实验七 琼脂糖凝胶电泳检测DNA
实验一 实验基础知识和基本技能培训
实验目的 学习和掌握分子生物学实验的基本技术和技能，了解分子生物学实验中常用的仪器设备，
熟悉常用玻璃器皿、耗材。
实验原理 通过多媒体、胶片、板书、实物演示等各种教学方式，让学生初步学习和掌握分子生物学
实验的基本知识和基本技能，了解分子生物学实验常用仪器设备，熟悉常用玻璃器皿、耗材。
1. 分子生物学实验综合规程（见前页）
2. 分子生物学实验设备
1) 温度控制系统：冰箱：4 ℃、-20℃、-70 ℃--样品、试剂和材料等的保存
2) 恒温培养箱：细菌平板的培养
3) 恒温空气摇床；菌体的培养
4) 灭菌器: 培养基、试剂、耗材等的灭菌
5) PCR 仪：PCR 扩增、保温实验等
6) 恒温水浴及微量加热器：保证实验温度的恒定
7) 电泳仪：电泳时提供电压和电流
8) 电泳槽：核酸或蛋白质的电泳定性分析时的凝胶支架
9) 凝胶成像系统：电泳结果的定性和定量分析
10) 紫外分析仪：电泳结果的定性分析
11) 台式高速冷冻离心机：样品的分离
12) 分光光度计：样品的定量测定
13) 超净工作台：提供洁净工作环境
14) 电子天平：样品、试剂等的称量
15) p H 计：精确的pH 值测定
16) 移液器；液体试剂的精确取量
17) 制冰机：保证操作过程中温度的恒定
3. 分子生物学基本技术
3.1实验规范训练－仪器的操作
要求：
a) 仪器在未经培训前，不得擅自使用
b) 严格按操作规程使用仪器，
c) 有些仪器必须有教师在场时才能使用，并由教师操作
d) 违反规定的使用者，造成的后果由使用者承担
3.2实验规范训练－量程的选择
1)
2)
3)
天平 烧杯、量筒、容量瓶、试剂瓶－－不同规格 量程的选择－移液器 3.3实验规范训练－标签
1)
2)
3) 所用的器皿上一定要做标记 标签一定要贴到固定的位置 标签上应包括具体的名称、组别、实验班、日期
3.4实验规范－实验操作
1) 详细记录和分析实验结果并按时提交实验报告
2) 实验中一定要处处用心、勤动手，多问为什么
3) 仔细操作和观察
4) 保留好每一步的实验样品，在确准的情况下才能当废液扔掉
4 实验准备
4.1 清点和熟悉常用玻璃器皿、耗材等
4.2 洗涤本学期实验用玻璃器皿
4.3 配制试剂
1) 0.1 mol/L CaCl2 100 mL
2) 5 mol/L NaOH 100 mL 胶塞
3) LB 液体培养基 100 mL
胰蛋白胨（typtone) 1g
酵母提取物（yeast extract) 0.5g
NaCl 1g
加部分水溶解后加20μL 5 mol/L NaOH，定容到100 mL（40 mL到两个250mL 锥形瓶，3 mL分别到大试管中，用于预培养及复苏）
4) 10%(w/v)SDS储液 50 mL，室温保存
5) 1 mol/L Tris 200 mL
6) 2 mol/L HCL 100 mL
7) 0.5 mol/L EDTA 100 mL
80 mL水中加18.61g EDTA-Na2H 2O ，用NaOH 调 pH 8（约需2g NaOH），后定容至100 mL
8) 5xTAE 1000 mL
9) 70%乙醇 500 mL
10) Amp ：100 mg/ mL 20ml ，分装每管 1 mL，－20℃保存
注意：先将所需烧杯、量筒、玻棒、双蒸水、微量离心管灭菌待温度降到室温后，在超净台中配制，再用一次性滤器过滤分装于1.5 mL无菌微量离心管中，－20℃保存
4.4 高温灭菌
1) LB 液体培养基
2) 1.5mL 离心管 2瓶/组
3) 枪头/1组 ： 1mL 1盒，200uL 1盒
4) 培养皿 12套/组
5) 无菌水 100 mL /班
6) 0.1 mol/L CaCl2
实验二 大肠杆菌感受态细胞的制备
实验目的 制备出感受态细胞。
实验原理 感受态就是细菌吸收转化因子的生理状态，只有发展为感受态的细胞才能稳定摄取外来
的DNA 分子。受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl 2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许带有外源DNA 的载体分子进入的感受态细胞。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl 2 法，简便易行，且其转化效率完全可以满
足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年) ，因此CaCl 2法为使用更广泛。
一、材料
大肠杆菌 E.coli DH5α，100ml 三角瓶，1.5ml 离心管(又称eppendorf 管), 离心管架，1000 ul 、200ul 枪头，大量冰块，
二、设备
微量移液器(200μl,1000μl)，高压蒸汽消毒器(灭菌锅) ，恒温摇床、冷冻离心机, 超净工作台, 紫外光度计，双蒸水器，冰箱等。
三、试剂准备
1、LB 液体培养基：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5g，NaCl 10 g，溶于800ml 蒸馏水中，用NaOH 调pH 至7.5, 加水至总体积1升，高压下蒸气灭菌15分钟。
2、LB 固体培养基：液体培养基中每升加12g 琼脂粉，高压灭菌。
3、高压灭菌的0.1mo1／L CaCl2：母液1M CaCl2 147 g CaCl2 2H2O ，加水到1L
4、高压灭菌过的30％甘油
四 操作步骤
大肠杆菌感受态细胞的制备
（1） （已预先准备好）从新活化的E.coli DH5α菌平板上挑取一单菌落（超净工作台操作），接种
于3～5ml LB液体培养中，37℃振荡培养12h 左右，直至对数生长期。将该菌悬液以1：100～1：50转接于20ml LB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～30min 测一次OD600nm ，至OD600nm≤0.5时停止培养；
（2） 取培养液1.5ml 转入微量离心管中，在冰上冷却10min ，于4℃，5000r ／min 离心10min （从
这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）。
（3） 倒净上清培养液，用1ml 冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴，0～4℃，5000r
／min 离心10min ；
（4） 弃去上清液，加入500µl 冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞。0～4℃，5000r ／min
离心10min ；
（5） 弃去上清液，加入100µl 冰冷的0.1mo1／L CaCl 2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，
即制成了感受态细胞悬液；
（6） 制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，也可加入占总体积15％左右高压灭菌过的甘
油，混匀后在超净工作台分装到Eppendorf 微量离心管中，液氮速冻后，置于-70℃条件下，可保存半年至一年。
实验三 质粒DNA 的转化
实验目的 把DNA 引入感受态受体细胞，使受体菌具有新遗传性，并从中选择出转化子。
实验原理 受体细胞经过一些特殊方法如化学试剂法的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改
变，成为能允许外源DNA 分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的DNA 分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(即带有异源DNA 分子的受体细胞) 。
CaCl 2法的基本原理：细菌处于0℃，CaCl 2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，外源DNA 形成抗DNA
酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面，经短时间42℃热激处理，促进细胞吸收DNA 复合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如氨苄青霉素耐药（Amp r ）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含Amp 的选择性培养基上，倒置培养过夜，可获得细菌菌落。
转化(Transformation)是将外源DNA 分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
一、材料
IL-18质粒，大肠杆菌感受态，1.5ml 塑料离心管，离心管架，
1000 ul、200ul 、20ul 枪头，9cm 培养皿，一次性滤膜（0.22um ），大量碎冰
二、设备
微量移液器(2μl,200μl,1000μl)，高压蒸汽消毒器(灭菌锅) ，培养箱，恒温水浴锅，恒温摇床，离心机 超净工作台，双蒸水器，冰箱等。
三、试剂准备
LB 固体培养基
LB 液体培养基
氨苄青霉素（apm ）：无菌水配置成100mg/ml溶液，用滤膜抽滤，-20℃保存
灭菌双蒸水ddH2O
四 实验操作
（1） 平板的制备：LB 固体培养基中加入Amp (100μg/ml)，转化反应前一天，倒置平板，保存。
（2） 分别用2个100µl 感受态细胞悬液(如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面操作：
第一组，质粒DNA 组：2 µl IL-18质粒DNA +100 µl 感受态细胞悬液
第二组，空白对照组，2ul 无菌水＋100µl 感受态细胞悬液
（3） 将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置15 min，于42℃水浴中保温90s ，然后迅速冰上冷却2-5 min
（4） 立即向上述管中分别加入0.9ml LB液体培养基（在超净工作台操作，不需要在冰上），使总
体积到1ml ，摇匀后于37℃振荡培养约60min ，使受体菌恢复正常生长状态，并使转化体表达抗生素基因产物(Ampr ) 。
（5） 在超净工作台取各样品培养液0.1ml 在平板上涂布，分别接种于含抗菌素LB 平板培养基上
（做好标记，日期），涂匀。
（6） 培养皿正置于37℃培养箱中2h ，待菌液完全被培养基吸收后，倒置过夜(12-16小时) 。
（7） 观察转化子出现的情况，待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培养， 置于4℃条件保存待
用。
注意事项
1. 加入质粒后要轻轻混匀，动作一定要轻柔。
2. 42℃热激时间一定不能超过90s 。
思考题
1、制备感受态细胞的原理是什么？
2、可将外源基因转化受体细胞的方法有哪些？
实验四 碱裂解法提取质粒DNA
实验目的 1、掌握最常用的提取质粒DNA 的方法和检测方法；
2、了解制备原理及各种试剂的作用。
实验原理 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA 的方法，碱变性抽提质粒DNA 是基于染
色体DNA 与质粒DNA 的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH 值高达12.6的碱性
条件下，染色体DNA 的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA 的大部分氢键也
断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高
盐缓冲液去调节其pH 值至中性时，变性的质粒DNA 又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA 不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA 与不稳定的大
分子RNA 、蛋白质－SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去。
（简明原理：碱裂解法是基于DNA 的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质
粒DNA 变性，再将pH 值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA ，而染色体DNA 不会
复性，缠结成网状物质，通过离心除去。）
细菌质粒是一类双链、闭环的DNA ，大小范围从1kb 至200kb 以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA 分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA 的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA 。
一、材料
含IL-18质粒的大肠杆菌，1.5ml 塑料离心管, 离心管架，枪头及盒、吸水纸。
二、设备
微量移液器(20μl,200μl,1000μl)， 台式高速离心机，恒温振荡摇床， 高压蒸汽消毒器(灭菌锅) ， 涡旋振荡器，恒温水浴锅，双蒸水器，冰箱，等。
三、试剂准备
1、 LB 液体培养基：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5g，NaCl 10g，溶于800ml
蒸馏水中，用NaOH 调pH 至7.5，加水至总体积1升，高压下蒸气灭菌15分钟。
2. 氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成 100mg/ml水溶液，-20℃保存备用。
3. 溶液Ⅰ：50mM 葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。
配制方法：1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml ，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml ，葡萄糖4.730g ，加ddH 2O 至500ml 。在121℃高压灭菌15min ，贮存于4℃。
4. 溶液Ⅱ：0.2M NaOH，1% SDS。
配制方法：2M NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH 2O 至10ml 。使用前临时配置。
5. 溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc ）缓冲液，pH 4.8。
配制方法：5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml ，加ddH 2O 至500ml 。4℃保存备用。
6. 苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可
起消除抽提过程中出现的泡沫。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。
7. 无水乙醇；
8. 70%乙醇；
9. TE ：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。
配制方法：1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml ，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml ，加ddH 2O 至100ml 。121℃高压湿热灭菌20min ，4℃保存备用。
1M Tris Cl（Tris(三羟甲基) 氨基甲烷）：800ml H2O 中溶解 121g Tris碱，用浓盐酸调pH 值，混匀后加水到1L ；
0.5M EDTA （乙二胺四乙酸）：700ml H 2O 中溶解186.1g Na 2EDTA.2H 2O ，用10M NaOH 调 pH8.0(需约50ml) ， 补H 2O 到 1L 。
10. RNA 酶A 母液：将RNA 酶A 溶于10mmol/L Tris·Cl(pH7.5), 15mmol/L NaCl 中，配成10mg/ml
的溶液，于100℃加热15分钟，使混有的DNA 酶失活。冷却后用1.5ml eppendorf管分装成小份保存于-20℃。
四、操作步骤
1． 用灭菌牙签挑取LB 固体培养基上生长的单菌落，接种于5ml LB（含Amp 100ug/ml）液体培养基中，37℃、200rmp 振荡培养过夜（约12-14hr ）。
2． 取1.5ml 菌液置于1.5ml EP管中，15,000rpm 离心30秒，弃上清，将离心管倒置于吸水纸上，使液体尽可能流尽。
3． 加入100ul 溶液Ⅰ，震荡悬菌，室温放置5分钟。
4． 加入200ul 溶液Ⅱ，轻轻颠倒混匀5次，置冰浴5分钟。
5． 加入150ul 溶液Ⅲ，颠倒混匀，置冰浴10分钟。此时，可见大量白色沉淀。
6． 15,000rpm 离心5分钟，将上清400ul 转移至另一干净的EP 管中，弃沉淀。
7． 加入240ul 异丙醇（0.6体积），混匀，置室温10分钟。
8． 15,000rpm 离心10分钟，弃上清，控干。
9． 50ul TE溶解沉淀，加入50ul 冰预冷的5M LiCl，混匀，置冰浴10分钟。
10． 15,000rpm 离心10分钟，将上清100ul 转移至另一干净的EP 管中。
11． 等体积酚:氯仿:异戊醇抽提一次，氯仿:异戊醇抽提一次。（可不做）
12． 2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，混匀，置-20℃沉淀10分钟。
13． 15,000rpm 离心10分钟，弃上清。
14． 待乙醇挥发干净后，将沉淀溶于20ul TE(pH8.0，含20μg /ml RnaseA，约4μl)中，37℃水浴30min 以降解RNA 分子，储于-20℃冰箱中待用。
注意事项
1. 溶液II 必需新鲜配制。
2. 严格控制碱变性的时间（即步骤4）的时间，使其不超过5分钟。因为，如质粒处于强碱性环境中时间过长，可发生不可逆变性。
3. 在加入溶液III 后，要充分混匀并迅速置于冰上。如未见大量白色沉淀，说明实验失败，立即重做。
4. 弃上清时，必须控干，即除尽管内的液体。在做最后一步时，应尽量将乙醇挥发干净，可用滤纸条小心吸净离心管壁上的乙醇液滴以节省时间。
5. 提取过程应尽量保持低温。
思考题
1、 裂解细菌时需注意的事项有哪些？
2、 碱裂解法提取质粒DNA 中溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的作用是什么？
3、 简要说明作为基因工程的载体，质粒必须具备哪些特点。
4、 简要说明质粒提取的3个步骤及其原理。
实验五 PCR 基因扩增
实验目的 1、掌握PCR 基因扩增的方法；
2、了解制备原理及应用。
实验原理PCR 反应（Polymerase Chain Reaction, 多聚合酶链式反应）：模仿细胞内发生的DNA 复制
过程，在体外有酶催化合成特异性DNA 片段，为最常用的分子生物学技术之一。其原理
是通过高温变性模板、引物与模板退火、引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多
次循环反应，使目的DNA 得以几何级数倍增。
其主要步骤是：
1）将待扩增的模板DNA 置高温下（通常为93℃-94℃）使其变性解成单链；
2）人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；
3）耐热的DNA 聚合酶（Taq 酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA 的新互补链。
PCR 反应体系组成包括：DNA 模板，4种dNTP ，两条引物，Taq 酶和Taq 酶的缓冲液。
PCR 能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA 片段，并能轻易在皮克（pg ）水平起始DNA 混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA 片段。PCR 技术具有操作简便、省时、灵敏度高、对原始材料的质和量要求低的特点，使得PCR 技术一经问世就被迅速而广泛地用于各个领域：
1) 基因克隆及定量、扩增特异性片段用于探针、体外获得突变体、提供大量DNA 用于测序等；
2) 遗传病的产前诊断；
3) 致病病原体的检测；
4) 癌基因的检测和诊断；
5) DNA 指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证；
6) 动、植物检疫；
7) 在转基因动植物中检查植入基因的存在。
一、试剂准备
根据目的基因序列，合成两条（10μM）的引物：
引物1(正向序列) ：
引物2(反向序列) ：
10-100ng/ul DNA模板
10×PCR Buffer
20mM dNTPmix：含dATP 、dCTP 、dGTP 、dTTP 各20mM
Taq 酶 1U/ul
灭菌双蒸水ddH2O
琼脂糖
二 设备
PCR 仪，灭菌锅，双蒸水器，离心机，冰箱，紫外分析仪，移液器(2ul, 20μ)，枪头200ul ，20ul ，一次性手套， 0.2ml 离心管及架，冰块，
三、操作步骤
1．取0.2 ml灭菌PCR 管1只。
2．如下建立20 ul PCR反应体系，依次加入各组分，分别点在PCR 管壁的不同部位：
灭菌双蒸馏水
15 µl 10× Taq DNA聚合酶缓冲液 dNTP (2.5 mM /each) Primer1（10 mM） Primer2（10 mM） 模板 2 µl 1 µl 0.3 µl 0.3 µl 1 µl
轻弹管壁以混匀各组分，离心数秒
Taq DNA聚合酶 0.5 µl
轻弹管壁以混匀，再离心数秒，
3．如下进行PCR 扩增反应：
94 ℃，5 min
94 ℃，30 sec
60 ℃，30 sec 72 ℃，1 min
72 ℃，10 min 1 cycle
4．扩增产物保存于4℃待用。
四、注意事项
1．聚合酶缓冲液从低温取出后要充分溶解并混匀，冷冻会使缓冲液形成浓度梯度。
1 cycle 25 cycles
2．Mg 2+浓度过高，产物特异性差；过低，产物得率低。
3．dNTP 浓度过高，反应速度快，但碱基错配率高，成本也高；过低则反应速度慢。
4．引物浓度若过高，会引起错配和非特异性产物的扩增及二聚体的产生。
5．为防止污染，应设阴性对照（除无模板外，其它同样品管）。
6．退火温度一般在40 ℃~60 ℃之间，退火时间在30 sec左右。引物长度为15~25 bp时，退火温度T m = 4×(G+C) +2×(A+T)；允许范围内，T m 越高，特异性也越高。
7．扩增片段大小1 kb，则需适当延长时间。8．扩增反应结束后，一般需在72 ℃下再延伸10 min。
9．循环次数理论上进行20~25次即可，但实际操作中进行25~30个循环较佳。
思考题
1、PCR 的原理是什么？
2、PCR 反应体系包括哪些组分？
1. 简述PCR 的基本原理和注意事项。
2. 如何预防PCR 出现假阳性结果?
实验六 DNA 的限制性核酸内切酶消化
实验目的 1. 熟记限制性核酸内切酶在基因工程中的应用。
2. 掌握利用限制性核酸内切酶切割DNA 的基本方法。
实验原理
限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA 中特定核苷酸序列，并能在识别位点或其附近切割DNA 双链的一类核酸水解酶。其种类繁多、主要从原核生物中分离得到。此类酶的发现及应用，对现代分子生物学的发展起到了重大的推动作用。
限制性核酸内切酶可分为I 、II 、III 三类。其中，I 类和III 类限制酶在同一蛋白质分子中兼有修饰（甲基化）作用和依赖于ATP 的限制（切割）活性。III 类限制酶只在识别位点上切割DNA ，然后从底物上解离；而I 类限制酶结合位点与切割部位不一致，没有固定的切割位点，故I 类和III 类限制酶在分子生物学实验中不常用。II 类限制酶是由两种酶分子组成的二元系统：一是限制性内切酶，它能识别双链DNA 的特异序列并在这个序列内进行切割，产生特异的DNA 片断；另一类是独立的甲基化酶，它和同类限制酶识别相同序列，但发挥不同作用（甲基化作用），如：EcoR I限制酶和EcoR I 甲基化酶可识别同一序列，但作用各不相同（前者切割，后者甲基化）。II 类限制酶的识别序列为反向重复序列（回文结构或二重对称结构），具有180°旋转对称性，长度约为4、5、6个碱基（少数酶识别更长的序列或兼并序列），富含GC 。
限制性核酸内切酶切割DNA 双链后，可产生3种切口。平端切口：限制酶在二重对称轴上同时切割DNA 的两条链产生的末端；5´突出的粘端切口：限制酶在二重对称轴的5´端切割DNA 每条链，使双链DNA 交错断开而产生的末端；3´突出的粘端切口：限制酶在二重对称轴的3´端切割DNA 每条链，使双链DNA 交错断开而产生的末端。
限制性内切酶的活性单位U 为：特定条件下，1小时内在50 ul 体系中酶解1ug DNA(λ噬菌体DNA) 所需要的酶量。
通常，利用质粒的大小和限制性酶切位点来鉴定质粒。具体做法是：首先，选用一种或两种限制性核酸内切酶切割质粒；然后，进行琼脂糖凝胶电泳；最后，根据DNA 片断的电泳迁移率和酶切图谱对质粒进行鉴定。
一、试剂
1、 限制性核酸内切酶EcoR I，Hind III及其相应的缓冲液
2、 灭菌蒸馏水
3、 实验八提取的高纯度质粒
二、设备
微量移液器(20μl,200μl,1000μl)， 台式高速离心机，高压蒸汽消毒器(灭菌锅) ，恒温水浴锅，双蒸水器，冰箱，等。
三、操作步骤
1．取1.5ml 灭菌EP 管1只。
2．建立15ul 酶切反应体系，分别加入：
灭菌蒸馏水： 10ul
10*Buffer R： 1.5ul ；
质粒DNA ： 3ul
EcoR I： 0.3ul ；
Hind III： 0.3ul
混匀，6000rpm ，离心10秒。
3．37℃ 水浴2小时。
四、注意事项
1．内切酶：内切酶从冰箱取出后应置于冰上，用后迅速放回冰箱。一般最后加内切酶，每次取酶须更换新的吸头。
2．DNA ：要有一定的纯度（不能含有迹量酚、氯仿、EDTA 、SDS 等）。
3．酶解温度和时间：酶解温度一般为37℃。酶解时间可根据加入酶量而定，酶量多则时间可较短；相反酶量少可通过延长时间来达到完全酶解DNA 的目的。
4．酶解容积：一般50ul ，可随需酶切的DNA 量的多少而增减；一般加入内切酶的容积不能超过总体积的1/10，否则，甘油浓度过高会抑制内切酶的活性。
5．混匀：可用移液枪吹打或手指轻弹管壁混匀，对于大分子DNA 则操作必须轻柔，混匀后作短暂离心。
6．反应终止：①若以后不再进行酶促反应，则加入EDTA 至终浓度为10mmol/L。②若以后还要进行酶促反应（如连接），则可于65℃保温20min ，但此法灭活可能并不完全。③用酚:氯仿抽提，乙醇沉淀。
7．酶解结果鉴定：酶解完成后，不必立即终止反应，可先取出适量反应液进行琼脂糖凝胶电泳，观察结果后再决定是否终止反应。
五、思考题
1．限制性核酸内切酶切割DNA 双链后，可产生哪些切口，各有何特点？
2．简述限制性核酸内切酶消化DNA 时的注意事项。
实验七 琼脂糖凝胶电泳检测DNA
实验目的 本实验旨在学习水平式琼脂糖凝胶电泳，检测DNA 含量与分子量。
实验原理 根据DNA 分子量不同，采用外加电场使其分开，用EB 嵌入DNA 分子后在紫外下显色。
琼脂糖凝胶电泳是利用琼脂糖溶化再凝固后能形成带有一定孔隙的固体基质的特性。DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。
1） 在电场的作用下及中性pH 的缓冲条件下，带负电的核酸分子向正极迁移。由于糖一磷酸骨架在
结构上的重复性质，相同数量的双链DNA 几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。
2） 在一定的电场强度下，DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA 分子本身的大小和构型。
具有不同的相对分子质量和不同构型的DNA 片段泳动速度不一样，可进行分离。
3） 溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，当DNA 样品在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动时，溴化
乙锭从正极向负极移动，这样溴化乙锭分子就会嵌入DNA 分子中形成络合物，使DNA 在紫外光下发射很强的荧光。在溴化乙锭足够的情况下，荧光的强度正比于DNA 的含量，这样就可以检测DNA 的浓度。
不同构型的DNA 分子，其电泳迁移率也是不同的。我们所提取的质粒往往有三种构型：超螺旋环状、线状和带切口环状。电泳时，由于三者的空间构象紧密程度不同，所以，它们的迁移率并不相同。一般情况下，具有超螺旋构型的质粒，由于其结构最为紧密，所以它的迁移率也就最大，跑在最前面；其次为具有线性构型的质粒，具有带切口环状构型的质粒跑在最后。质粒经限制性核酸内切酶切割后，其构型均为线性，其电泳迁移率主要取决于分子量大小。
质粒DNA 样品中如果还有染色体DNA 或RNA ，在凝胶电泳上也可以分别观察到电泳区带，由此可分析样品的纯度。（见图1）
图1 核酸的琼脂糖凝胶电泳
一、材料
质粒，1.5ml 塑料离心管，离心管架，透明胶带，防护眼镜
二、设备
微量移液器(20μl)，高压灭菌锅，电泳仪，琼脂糖平板电泳装置，微波炉，紫外透射仪等。
三、试剂准备
1. TAE 电泳缓冲液：50X 储存液，pH8.5：242gTris 碱，57.1ml 冰醋酸，37.2 g Na 2EDTA.2H 2O ，加
水至1L ；
1X 工作液： 40mmol/L Tri Ac，2mmol/L EDTA
2．溴化乙锭（EB ）：10mg/ml，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可。
（注意：EB 为强诱变剂，操作时带手套）
3. DNA loading buffer（上样缓冲液）：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF ，40%（W/V）蔗糖水溶液，
贮存于 4℃。(作用：增加样品密度以保证DNA 沉入加样孔内；使样品带有颜色便于简化上样过程；其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。 在0.5 ×TBE 琼脂糖凝胶电泳中溴酚蓝的迁移率约与300bp 的线状双链DNA 相同，而二甲苯氰FF 约与4000bp 的DNA 相同。) 4 DNA Maker标准分子量： λDNA/EcoR I+ Hind III Maker
5. 1% 琼脂糖凝胶：称取1g 琼脂糖于三角烧瓶中，加100ml 1×TAE ，微波炉加热至完全溶化，
冷却至60℃左右，缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min 以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液1×TAE ），即可上样。
6. 无菌水
四 实验操作
1、 琼脂糖凝胶的制备
1．制备1%琼脂糖凝胶：用胶布封住制胶板两侧，插入适当梳子。150ml 三角烧瓶中加入1×TAE 20ml ，称取琼脂糖200mg 倒入其中，混匀，电炉上煮沸，冷却至60℃（不烫手）时，加入10mg/ml EB 2ul ，混匀，全部倒入制胶板中，静置待凝胶凝固。轻轻将两侧胶布撕去，梳子拨起，往电泳槽中注入1×TAE 缓冲液直至刚没过凝胶1mm 。
2．点样：于一洁净塑料薄膜上混匀5ul 待电泳样品和5ul 上样缓冲液，10ul/孔点样，记住点样位置。
3．电泳：将加样一端接上负极，另一端接上正级，电压为60V 恒压电泳。待溴酚蓝移动到接近正级一端3cm 时，停止电泳。
4．戴手套将凝胶移至凝胶成像系统内观察电泳结果。
[注意]
1. EB见光易分解，故应装在棕色瓶中，并于4℃ 条件下保存。
2. EB是强诱变剂并有中等毒性，配制和使用时都应戴手套，并且不要把EB 洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB 的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。
3. 溴酚蓝为常用电泳指示剂，呈蓝紫色。在1%、1.4%、2%的琼脂糖凝胶电泳中，溴酚蓝的迁移率分别与600bp 、200bp 、150bp 的双链线性DNA 片段大致相同。
思考题
1、论述EB 显色的原理。
2、DNA 的分子大小及构型与迁移速率的关系如何？
3、凝胶上样缓冲液的作用是什么？
1．试分析如何通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定DNA 的浓度、纯度和分子量。
基因工程综合实验
武汉科技大学医学院生化教研室
目 录
分子生物学实验综合规程································································································3 参考书目 ··························································································································3 实验内容····························································································································4 实验一 实验基础知识和基本技能培训··········································································5 实验二 大肠杆菌感受态细胞的制备··············································································7 实验三 质粒DNA 的转化·······························································································8 实验四 碱裂解法提取质粒DNA····················································································9 实验五PCR 基因扩增·····································································································11 实验六DNA 的限制性核酸内切酶消化········································································13 实验七琼脂糖凝胶电泳检测DNA·················································································15
分子生物学实验综合规程
☐ 上课时间提前5分钟进入实验室；不迟到、不早退，无故旷课累计3次没成绩； ☐ 请假须医院病假条或班主任签字的假条；
☐ 上课时需穿实验服，不许在实验室内吃东西，不背着书包做实验，不穿拖鞋进实验室； ☐ 实验课期间不许打闹、闲聊等，不大声喧哗，保持课堂纪律，实验过程中，至始至终需全组同学一起完成，任何人中途不得缺席。
☐ 必须做到课前认真预习，课间做好实验记录、课后详细总结实验结果并按时提交实验报告；
☐ 公用试剂不得污染！每次都必须用新枪头。公用台上公用试剂不得私自拿到自己实验台上；
☐ 不得私自拿走或乱放别人的实验物品、实验产品；
☐ 不得擅自使用实验室中非本实验仪器、试剂。
☐ 实验废液不随便倾倒，随时保持实验台的整洁；
☐ 爱护实验器材，实验器材损坏必须按规定赔偿；
☐ 实验前按仪器性能与要求，进行仪器预热；
☐ 实验完成后检查电源插座，用完仪器后必须复位，仪器清洁干净 、摆放整齐；每组实验物品齐全，需教师验收，枪量程要归位，发现问题及时报修；
☐ 每位同学负责自己实验台面和柜体的卫生，值日生负责公用实验台、地面等处卫生； ☐ 每次轮到打扫卫生的小组，要认真做好值日工作，离开实验室须向教师声明；
☐ 同学与老师之间、同学与同学之间、实验班与实验班之间一定要互相协作配合保持公用房间卫生，注意门窗水电的安全。
☐ 遵守通用的实验室规则。
违反上述任何一条规则责任自负，并要扣分，造成损失要照价赔偿。
参考书目：分子生物学实验指导，魏群 主编，高教出版社
分子生物学实验指导，刘进元 主编，清华大学出版社
实 验 内 容
实验一 分子生物学实验的基本知识和基本技能培训
实验二 大肠杆菌感受态细胞的制备
实验三 质粒DNA 的转化
实验四 碱裂解法提取质粒DNA
实验五PCR 基因扩增
实验六DNA 的限制性核酸内切酶消化
实验七 琼脂糖凝胶电泳检测DNA
实验一 实验基础知识和基本技能培训
实验目的 学习和掌握分子生物学实验的基本技术和技能，了解分子生物学实验中常用的仪器设备，
熟悉常用玻璃器皿、耗材。
实验原理 通过多媒体、胶片、板书、实物演示等各种教学方式，让学生初步学习和掌握分子生物学
实验的基本知识和基本技能，了解分子生物学实验常用仪器设备，熟悉常用玻璃器皿、耗材。
1. 分子生物学实验综合规程（见前页）
2. 分子生物学实验设备
1) 温度控制系统：冰箱：4 ℃、-20℃、-70 ℃--样品、试剂和材料等的保存
2) 恒温培养箱：细菌平板的培养
3) 恒温空气摇床；菌体的培养
4) 灭菌器: 培养基、试剂、耗材等的灭菌
5) PCR 仪：PCR 扩增、保温实验等
6) 恒温水浴及微量加热器：保证实验温度的恒定
7) 电泳仪：电泳时提供电压和电流
8) 电泳槽：核酸或蛋白质的电泳定性分析时的凝胶支架
9) 凝胶成像系统：电泳结果的定性和定量分析
10) 紫外分析仪：电泳结果的定性分析
11) 台式高速冷冻离心机：样品的分离
12) 分光光度计：样品的定量测定
13) 超净工作台：提供洁净工作环境
14) 电子天平：样品、试剂等的称量
15) p H 计：精确的pH 值测定
16) 移液器；液体试剂的精确取量
17) 制冰机：保证操作过程中温度的恒定
3. 分子生物学基本技术
3.1实验规范训练－仪器的操作
要求：
a) 仪器在未经培训前，不得擅自使用
b) 严格按操作规程使用仪器，
c) 有些仪器必须有教师在场时才能使用，并由教师操作
d) 违反规定的使用者，造成的后果由使用者承担
3.2实验规范训练－量程的选择
1)
2)
3)
天平 烧杯、量筒、容量瓶、试剂瓶－－不同规格 量程的选择－移液器 3.3实验规范训练－标签
1)
2)
3) 所用的器皿上一定要做标记 标签一定要贴到固定的位置 标签上应包括具体的名称、组别、实验班、日期
3.4实验规范－实验操作
1) 详细记录和分析实验结果并按时提交实验报告
2) 实验中一定要处处用心、勤动手，多问为什么
3) 仔细操作和观察
4) 保留好每一步的实验样品，在确准的情况下才能当废液扔掉
4 实验准备
4.1 清点和熟悉常用玻璃器皿、耗材等
4.2 洗涤本学期实验用玻璃器皿
4.3 配制试剂
1) 0.1 mol/L CaCl2 100 mL
2) 5 mol/L NaOH 100 mL 胶塞
3) LB 液体培养基 100 mL
胰蛋白胨（typtone) 1g
酵母提取物（yeast extract) 0.5g
NaCl 1g
加部分水溶解后加20μL 5 mol/L NaOH，定容到100 mL（40 mL到两个250mL 锥形瓶，3 mL分别到大试管中，用于预培养及复苏）
4) 10%(w/v)SDS储液 50 mL，室温保存
5) 1 mol/L Tris 200 mL
6) 2 mol/L HCL 100 mL
7) 0.5 mol/L EDTA 100 mL
80 mL水中加18.61g EDTA-Na2H 2O ，用NaOH 调 pH 8（约需2g NaOH），后定容至100 mL
8) 5xTAE 1000 mL
9) 70%乙醇 500 mL
10) Amp ：100 mg/ mL 20ml ，分装每管 1 mL，－20℃保存
注意：先将所需烧杯、量筒、玻棒、双蒸水、微量离心管灭菌待温度降到室温后，在超净台中配制，再用一次性滤器过滤分装于1.5 mL无菌微量离心管中，－20℃保存
4.4 高温灭菌
1) LB 液体培养基
2) 1.5mL 离心管 2瓶/组
3) 枪头/1组 ： 1mL 1盒，200uL 1盒
4) 培养皿 12套/组
5) 无菌水 100 mL /班
6) 0.1 mol/L CaCl2
实验二 大肠杆菌感受态细胞的制备
实验目的 制备出感受态细胞。
实验原理 感受态就是细菌吸收转化因子的生理状态，只有发展为感受态的细胞才能稳定摄取外来
的DNA 分子。受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl 2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许带有外源DNA 的载体分子进入的感受态细胞。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl 2 法，简便易行，且其转化效率完全可以满
足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年) ，因此CaCl 2法为使用更广泛。
一、材料
大肠杆菌 E.coli DH5α，100ml 三角瓶，1.5ml 离心管(又称eppendorf 管), 离心管架，1000 ul 、200ul 枪头，大量冰块，
二、设备
微量移液器(200μl,1000μl)，高压蒸汽消毒器(灭菌锅) ，恒温摇床、冷冻离心机, 超净工作台, 紫外光度计，双蒸水器，冰箱等。
三、试剂准备
1、LB 液体培养基：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5g，NaCl 10 g，溶于800ml 蒸馏水中，用NaOH 调pH 至7.5, 加水至总体积1升，高压下蒸气灭菌15分钟。
2、LB 固体培养基：液体培养基中每升加12g 琼脂粉，高压灭菌。
3、高压灭菌的0.1mo1／L CaCl2：母液1M CaCl2 147 g CaCl2 2H2O ，加水到1L
4、高压灭菌过的30％甘油
四 操作步骤
大肠杆菌感受态细胞的制备
（1） （已预先准备好）从新活化的E.coli DH5α菌平板上挑取一单菌落（超净工作台操作），接种
于3～5ml LB液体培养中，37℃振荡培养12h 左右，直至对数生长期。将该菌悬液以1：100～1：50转接于20ml LB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～30min 测一次OD600nm ，至OD600nm≤0.5时停止培养；
（2） 取培养液1.5ml 转入微量离心管中，在冰上冷却10min ，于4℃，5000r ／min 离心10min （从
这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）。
（3） 倒净上清培养液，用1ml 冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴，0～4℃，5000r
／min 离心10min ；
（4） 弃去上清液，加入500µl 冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞。0～4℃，5000r ／min
离心10min ；
（5） 弃去上清液，加入100µl 冰冷的0.1mo1／L CaCl 2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，
即制成了感受态细胞悬液；
（6） 制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，也可加入占总体积15％左右高压灭菌过的甘
油，混匀后在超净工作台分装到Eppendorf 微量离心管中，液氮速冻后，置于-70℃条件下，可保存半年至一年。
实验三 质粒DNA 的转化
实验目的 把DNA 引入感受态受体细胞，使受体菌具有新遗传性，并从中选择出转化子。
实验原理 受体细胞经过一些特殊方法如化学试剂法的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改
变，成为能允许外源DNA 分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的DNA 分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(即带有异源DNA 分子的受体细胞) 。
CaCl 2法的基本原理：细菌处于0℃，CaCl 2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，外源DNA 形成抗DNA
酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面，经短时间42℃热激处理，促进细胞吸收DNA 复合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如氨苄青霉素耐药（Amp r ）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含Amp 的选择性培养基上，倒置培养过夜，可获得细菌菌落。
转化(Transformation)是将外源DNA 分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
一、材料
IL-18质粒，大肠杆菌感受态，1.5ml 塑料离心管，离心管架，
1000 ul、200ul 、20ul 枪头，9cm 培养皿，一次性滤膜（0.22um ），大量碎冰
二、设备
微量移液器(2μl,200μl,1000μl)，高压蒸汽消毒器(灭菌锅) ，培养箱，恒温水浴锅，恒温摇床，离心机 超净工作台，双蒸水器，冰箱等。
三、试剂准备
LB 固体培养基
LB 液体培养基
氨苄青霉素（apm ）：无菌水配置成100mg/ml溶液，用滤膜抽滤，-20℃保存
灭菌双蒸水ddH2O
四 实验操作
（1） 平板的制备：LB 固体培养基中加入Amp (100μg/ml)，转化反应前一天，倒置平板，保存。
（2） 分别用2个100µl 感受态细胞悬液(如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面操作：
第一组，质粒DNA 组：2 µl IL-18质粒DNA +100 µl 感受态细胞悬液
第二组，空白对照组，2ul 无菌水＋100µl 感受态细胞悬液
（3） 将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置15 min，于42℃水浴中保温90s ，然后迅速冰上冷却2-5 min
（4） 立即向上述管中分别加入0.9ml LB液体培养基（在超净工作台操作，不需要在冰上），使总
体积到1ml ，摇匀后于37℃振荡培养约60min ，使受体菌恢复正常生长状态，并使转化体表达抗生素基因产物(Ampr ) 。
（5） 在超净工作台取各样品培养液0.1ml 在平板上涂布，分别接种于含抗菌素LB 平板培养基上
（做好标记，日期），涂匀。
（6） 培养皿正置于37℃培养箱中2h ，待菌液完全被培养基吸收后，倒置过夜(12-16小时) 。
（7） 观察转化子出现的情况，待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培养， 置于4℃条件保存待
用。
注意事项
1. 加入质粒后要轻轻混匀，动作一定要轻柔。
2. 42℃热激时间一定不能超过90s 。
思考题
1、制备感受态细胞的原理是什么？
2、可将外源基因转化受体细胞的方法有哪些？
实验四 碱裂解法提取质粒DNA
实验目的 1、掌握最常用的提取质粒DNA 的方法和检测方法；
2、了解制备原理及各种试剂的作用。
实验原理 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA 的方法，碱变性抽提质粒DNA 是基于染
色体DNA 与质粒DNA 的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH 值高达12.6的碱性
条件下，染色体DNA 的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA 的大部分氢键也
断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高
盐缓冲液去调节其pH 值至中性时，变性的质粒DNA 又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA 不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA 与不稳定的大
分子RNA 、蛋白质－SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去。
（简明原理：碱裂解法是基于DNA 的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质
粒DNA 变性，再将pH 值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA ，而染色体DNA 不会
复性，缠结成网状物质，通过离心除去。）
细菌质粒是一类双链、闭环的DNA ，大小范围从1kb 至200kb 以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA 分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA 的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA 。
一、材料
含IL-18质粒的大肠杆菌，1.5ml 塑料离心管, 离心管架，枪头及盒、吸水纸。
二、设备
微量移液器(20μl,200μl,1000μl)， 台式高速离心机，恒温振荡摇床， 高压蒸汽消毒器(灭菌锅) ， 涡旋振荡器，恒温水浴锅，双蒸水器，冰箱，等。
三、试剂准备
1、 LB 液体培养基：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5g，NaCl 10g，溶于800ml
蒸馏水中，用NaOH 调pH 至7.5，加水至总体积1升，高压下蒸气灭菌15分钟。
2. 氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成 100mg/ml水溶液，-20℃保存备用。
3. 溶液Ⅰ：50mM 葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。
配制方法：1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml ，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml ，葡萄糖4.730g ，加ddH 2O 至500ml 。在121℃高压灭菌15min ，贮存于4℃。
4. 溶液Ⅱ：0.2M NaOH，1% SDS。
配制方法：2M NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH 2O 至10ml 。使用前临时配置。
5. 溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc ）缓冲液，pH 4.8。
配制方法：5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml ，加ddH 2O 至500ml 。4℃保存备用。
6. 苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可
起消除抽提过程中出现的泡沫。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。
7. 无水乙醇；
8. 70%乙醇；
9. TE ：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。
配制方法：1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml ，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml ，加ddH 2O 至100ml 。121℃高压湿热灭菌20min ，4℃保存备用。
1M Tris Cl（Tris(三羟甲基) 氨基甲烷）：800ml H2O 中溶解 121g Tris碱，用浓盐酸调pH 值，混匀后加水到1L ；
0.5M EDTA （乙二胺四乙酸）：700ml H 2O 中溶解186.1g Na 2EDTA.2H 2O ，用10M NaOH 调 pH8.0(需约50ml) ， 补H 2O 到 1L 。
10. RNA 酶A 母液：将RNA 酶A 溶于10mmol/L Tris·Cl(pH7.5), 15mmol/L NaCl 中，配成10mg/ml
的溶液，于100℃加热15分钟，使混有的DNA 酶失活。冷却后用1.5ml eppendorf管分装成小份保存于-20℃。
四、操作步骤
1． 用灭菌牙签挑取LB 固体培养基上生长的单菌落，接种于5ml LB（含Amp 100ug/ml）液体培养基中，37℃、200rmp 振荡培养过夜（约12-14hr ）。
2． 取1.5ml 菌液置于1.5ml EP管中，15,000rpm 离心30秒，弃上清，将离心管倒置于吸水纸上，使液体尽可能流尽。
3． 加入100ul 溶液Ⅰ，震荡悬菌，室温放置5分钟。
4． 加入200ul 溶液Ⅱ，轻轻颠倒混匀5次，置冰浴5分钟。
5． 加入150ul 溶液Ⅲ，颠倒混匀，置冰浴10分钟。此时，可见大量白色沉淀。
6． 15,000rpm 离心5分钟，将上清400ul 转移至另一干净的EP 管中，弃沉淀。
7． 加入240ul 异丙醇（0.6体积），混匀，置室温10分钟。
8． 15,000rpm 离心10分钟，弃上清，控干。
9． 50ul TE溶解沉淀，加入50ul 冰预冷的5M LiCl，混匀，置冰浴10分钟。
10． 15,000rpm 离心10分钟，将上清100ul 转移至另一干净的EP 管中。
11． 等体积酚:氯仿:异戊醇抽提一次，氯仿:异戊醇抽提一次。（可不做）
12． 2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，混匀，置-20℃沉淀10分钟。
13． 15,000rpm 离心10分钟，弃上清。
14． 待乙醇挥发干净后，将沉淀溶于20ul TE(pH8.0，含20μg /ml RnaseA，约4μl)中，37℃水浴30min 以降解RNA 分子，储于-20℃冰箱中待用。
注意事项
1. 溶液II 必需新鲜配制。
2. 严格控制碱变性的时间（即步骤4）的时间，使其不超过5分钟。因为，如质粒处于强碱性环境中时间过长，可发生不可逆变性。
3. 在加入溶液III 后，要充分混匀并迅速置于冰上。如未见大量白色沉淀，说明实验失败，立即重做。
4. 弃上清时，必须控干，即除尽管内的液体。在做最后一步时，应尽量将乙醇挥发干净，可用滤纸条小心吸净离心管壁上的乙醇液滴以节省时间。
5. 提取过程应尽量保持低温。
思考题
1、 裂解细菌时需注意的事项有哪些？
2、 碱裂解法提取质粒DNA 中溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的作用是什么？
3、 简要说明作为基因工程的载体，质粒必须具备哪些特点。
4、 简要说明质粒提取的3个步骤及其原理。
实验五 PCR 基因扩增
实验目的 1、掌握PCR 基因扩增的方法；
2、了解制备原理及应用。
实验原理PCR 反应（Polymerase Chain Reaction, 多聚合酶链式反应）：模仿细胞内发生的DNA 复制
过程，在体外有酶催化合成特异性DNA 片段，为最常用的分子生物学技术之一。其原理
是通过高温变性模板、引物与模板退火、引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多
次循环反应，使目的DNA 得以几何级数倍增。
其主要步骤是：
1）将待扩增的模板DNA 置高温下（通常为93℃-94℃）使其变性解成单链；
2）人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；
3）耐热的DNA 聚合酶（Taq 酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA 的新互补链。
PCR 反应体系组成包括：DNA 模板，4种dNTP ，两条引物，Taq 酶和Taq 酶的缓冲液。
PCR 能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA 片段，并能轻易在皮克（pg ）水平起始DNA 混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA 片段。PCR 技术具有操作简便、省时、灵敏度高、对原始材料的质和量要求低的特点，使得PCR 技术一经问世就被迅速而广泛地用于各个领域：
1) 基因克隆及定量、扩增特异性片段用于探针、体外获得突变体、提供大量DNA 用于测序等；
2) 遗传病的产前诊断；
3) 致病病原体的检测；
4) 癌基因的检测和诊断；
5) DNA 指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证；
6) 动、植物检疫；
7) 在转基因动植物中检查植入基因的存在。
一、试剂准备
根据目的基因序列，合成两条（10μM）的引物：
引物1(正向序列) ：
引物2(反向序列) ：
10-100ng/ul DNA模板
10×PCR Buffer
20mM dNTPmix：含dATP 、dCTP 、dGTP 、dTTP 各20mM
Taq 酶 1U/ul
灭菌双蒸水ddH2O
琼脂糖
二 设备
PCR 仪，灭菌锅，双蒸水器，离心机，冰箱，紫外分析仪，移液器(2ul, 20μ)，枪头200ul ，20ul ，一次性手套， 0.2ml 离心管及架，冰块，
三、操作步骤
1．取0.2 ml灭菌PCR 管1只。
2．如下建立20 ul PCR反应体系，依次加入各组分，分别点在PCR 管壁的不同部位：
灭菌双蒸馏水
15 µl 10× Taq DNA聚合酶缓冲液 dNTP (2.5 mM /each) Primer1（10 mM） Primer2（10 mM） 模板 2 µl 1 µl 0.3 µl 0.3 µl 1 µl
轻弹管壁以混匀各组分，离心数秒
Taq DNA聚合酶 0.5 µl
轻弹管壁以混匀，再离心数秒，
3．如下进行PCR 扩增反应：
94 ℃，5 min
94 ℃，30 sec
60 ℃，30 sec 72 ℃，1 min
72 ℃，10 min 1 cycle
4．扩增产物保存于4℃待用。
四、注意事项
1．聚合酶缓冲液从低温取出后要充分溶解并混匀，冷冻会使缓冲液形成浓度梯度。
1 cycle 25 cycles
2．Mg 2+浓度过高，产物特异性差；过低，产物得率低。
3．dNTP 浓度过高，反应速度快，但碱基错配率高，成本也高；过低则反应速度慢。
4．引物浓度若过高，会引起错配和非特异性产物的扩增及二聚体的产生。
5．为防止污染，应设阴性对照（除无模板外，其它同样品管）。
6．退火温度一般在40 ℃~60 ℃之间，退火时间在30 sec左右。引物长度为15~25 bp时，退火温度T m = 4×(G+C) +2×(A+T)；允许范围内，T m 越高，特异性也越高。
7．扩增片段大小1 kb，则需适当延长时间。8．扩增反应结束后，一般需在72 ℃下再延伸10 min。
9．循环次数理论上进行20~25次即可，但实际操作中进行25~30个循环较佳。
思考题
1、PCR 的原理是什么？
2、PCR 反应体系包括哪些组分？
1. 简述PCR 的基本原理和注意事项。
2. 如何预防PCR 出现假阳性结果?
实验六 DNA 的限制性核酸内切酶消化
实验目的 1. 熟记限制性核酸内切酶在基因工程中的应用。
2. 掌握利用限制性核酸内切酶切割DNA 的基本方法。
实验原理
限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA 中特定核苷酸序列，并能在识别位点或其附近切割DNA 双链的一类核酸水解酶。其种类繁多、主要从原核生物中分离得到。此类酶的发现及应用，对现代分子生物学的发展起到了重大的推动作用。
限制性核酸内切酶可分为I 、II 、III 三类。其中，I 类和III 类限制酶在同一蛋白质分子中兼有修饰（甲基化）作用和依赖于ATP 的限制（切割）活性。III 类限制酶只在识别位点上切割DNA ，然后从底物上解离；而I 类限制酶结合位点与切割部位不一致，没有固定的切割位点，故I 类和III 类限制酶在分子生物学实验中不常用。II 类限制酶是由两种酶分子组成的二元系统：一是限制性内切酶，它能识别双链DNA 的特异序列并在这个序列内进行切割，产生特异的DNA 片断；另一类是独立的甲基化酶，它和同类限制酶识别相同序列，但发挥不同作用（甲基化作用），如：EcoR I限制酶和EcoR I 甲基化酶可识别同一序列，但作用各不相同（前者切割，后者甲基化）。II 类限制酶的识别序列为反向重复序列（回文结构或二重对称结构），具有180°旋转对称性，长度约为4、5、6个碱基（少数酶识别更长的序列或兼并序列），富含GC 。
限制性核酸内切酶切割DNA 双链后，可产生3种切口。平端切口：限制酶在二重对称轴上同时切割DNA 的两条链产生的末端；5´突出的粘端切口：限制酶在二重对称轴的5´端切割DNA 每条链，使双链DNA 交错断开而产生的末端；3´突出的粘端切口：限制酶在二重对称轴的3´端切割DNA 每条链，使双链DNA 交错断开而产生的末端。
限制性内切酶的活性单位U 为：特定条件下，1小时内在50 ul 体系中酶解1ug DNA(λ噬菌体DNA) 所需要的酶量。
通常，利用质粒的大小和限制性酶切位点来鉴定质粒。具体做法是：首先，选用一种或两种限制性核酸内切酶切割质粒；然后，进行琼脂糖凝胶电泳；最后，根据DNA 片断的电泳迁移率和酶切图谱对质粒进行鉴定。
一、试剂
1、 限制性核酸内切酶EcoR I，Hind III及其相应的缓冲液
2、 灭菌蒸馏水
3、 实验八提取的高纯度质粒
二、设备
微量移液器(20μl,200μl,1000μl)， 台式高速离心机，高压蒸汽消毒器(灭菌锅) ，恒温水浴锅，双蒸水器，冰箱，等。
三、操作步骤
1．取1.5ml 灭菌EP 管1只。
2．建立15ul 酶切反应体系，分别加入：
灭菌蒸馏水： 10ul
10*Buffer R： 1.5ul ；
质粒DNA ： 3ul
EcoR I： 0.3ul ；
Hind III： 0.3ul
混匀，6000rpm ，离心10秒。
3．37℃ 水浴2小时。
四、注意事项
1．内切酶：内切酶从冰箱取出后应置于冰上，用后迅速放回冰箱。一般最后加内切酶，每次取酶须更换新的吸头。
2．DNA ：要有一定的纯度（不能含有迹量酚、氯仿、EDTA 、SDS 等）。
3．酶解温度和时间：酶解温度一般为37℃。酶解时间可根据加入酶量而定，酶量多则时间可较短；相反酶量少可通过延长时间来达到完全酶解DNA 的目的。
4．酶解容积：一般50ul ，可随需酶切的DNA 量的多少而增减；一般加入内切酶的容积不能超过总体积的1/10，否则，甘油浓度过高会抑制内切酶的活性。
5．混匀：可用移液枪吹打或手指轻弹管壁混匀，对于大分子DNA 则操作必须轻柔，混匀后作短暂离心。
6．反应终止：①若以后不再进行酶促反应，则加入EDTA 至终浓度为10mmol/L。②若以后还要进行酶促反应（如连接），则可于65℃保温20min ，但此法灭活可能并不完全。③用酚:氯仿抽提，乙醇沉淀。
7．酶解结果鉴定：酶解完成后，不必立即终止反应，可先取出适量反应液进行琼脂糖凝胶电泳，观察结果后再决定是否终止反应。
五、思考题
1．限制性核酸内切酶切割DNA 双链后，可产生哪些切口，各有何特点？
2．简述限制性核酸内切酶消化DNA 时的注意事项。
实验七 琼脂糖凝胶电泳检测DNA
实验目的 本实验旨在学习水平式琼脂糖凝胶电泳，检测DNA 含量与分子量。
实验原理 根据DNA 分子量不同，采用外加电场使其分开，用EB 嵌入DNA 分子后在紫外下显色。
琼脂糖凝胶电泳是利用琼脂糖溶化再凝固后能形成带有一定孔隙的固体基质的特性。DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。
1） 在电场的作用下及中性pH 的缓冲条件下，带负电的核酸分子向正极迁移。由于糖一磷酸骨架在
结构上的重复性质，相同数量的双链DNA 几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。
2） 在一定的电场强度下，DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA 分子本身的大小和构型。
具有不同的相对分子质量和不同构型的DNA 片段泳动速度不一样，可进行分离。
3） 溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，当DNA 样品在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动时，溴化
乙锭从正极向负极移动，这样溴化乙锭分子就会嵌入DNA 分子中形成络合物，使DNA 在紫外光下发射很强的荧光。在溴化乙锭足够的情况下，荧光的强度正比于DNA 的含量，这样就可以检测DNA 的浓度。
不同构型的DNA 分子，其电泳迁移率也是不同的。我们所提取的质粒往往有三种构型：超螺旋环状、线状和带切口环状。电泳时，由于三者的空间构象紧密程度不同，所以，它们的迁移率并不相同。一般情况下，具有超螺旋构型的质粒，由于其结构最为紧密，所以它的迁移率也就最大，跑在最前面；其次为具有线性构型的质粒，具有带切口环状构型的质粒跑在最后。质粒经限制性核酸内切酶切割后，其构型均为线性，其电泳迁移率主要取决于分子量大小。
质粒DNA 样品中如果还有染色体DNA 或RNA ，在凝胶电泳上也可以分别观察到电泳区带，由此可分析样品的纯度。（见图1）
图1 核酸的琼脂糖凝胶电泳
一、材料
质粒，1.5ml 塑料离心管，离心管架，透明胶带，防护眼镜
二、设备
微量移液器(20μl)，高压灭菌锅，电泳仪，琼脂糖平板电泳装置，微波炉，紫外透射仪等。
三、试剂准备
1. TAE 电泳缓冲液：50X 储存液，pH8.5：242gTris 碱，57.1ml 冰醋酸，37.2 g Na 2EDTA.2H 2O ，加
水至1L ；
1X 工作液： 40mmol/L Tri Ac，2mmol/L EDTA
2．溴化乙锭（EB ）：10mg/ml，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可。
（注意：EB 为强诱变剂，操作时带手套）
3. DNA loading buffer（上样缓冲液）：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF ，40%（W/V）蔗糖水溶液，
贮存于 4℃。(作用：增加样品密度以保证DNA 沉入加样孔内；使样品带有颜色便于简化上样过程；其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。 在0.5 ×TBE 琼脂糖凝胶电泳中溴酚蓝的迁移率约与300bp 的线状双链DNA 相同，而二甲苯氰FF 约与4000bp 的DNA 相同。) 4 DNA Maker标准分子量： λDNA/EcoR I+ Hind III Maker
5. 1% 琼脂糖凝胶：称取1g 琼脂糖于三角烧瓶中，加100ml 1×TAE ，微波炉加热至完全溶化，
冷却至60℃左右，缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min 以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液1×TAE ），即可上样。
6. 无菌水
四 实验操作
1、 琼脂糖凝胶的制备
1．制备1%琼脂糖凝胶：用胶布封住制胶板两侧，插入适当梳子。150ml 三角烧瓶中加入1×TAE 20ml ，称取琼脂糖200mg 倒入其中，混匀，电炉上煮沸，冷却至60℃（不烫手）时，加入10mg/ml EB 2ul ，混匀，全部倒入制胶板中，静置待凝胶凝固。轻轻将两侧胶布撕去，梳子拨起，往电泳槽中注入1×TAE 缓冲液直至刚没过凝胶1mm 。
2．点样：于一洁净塑料薄膜上混匀5ul 待电泳样品和5ul 上样缓冲液，10ul/孔点样，记住点样位置。
3．电泳：将加样一端接上负极，另一端接上正级，电压为60V 恒压电泳。待溴酚蓝移动到接近正级一端3cm 时，停止电泳。
4．戴手套将凝胶移至凝胶成像系统内观察电泳结果。
[注意]
1. EB见光易分解，故应装在棕色瓶中，并于4℃ 条件下保存。
2. EB是强诱变剂并有中等毒性，配制和使用时都应戴手套，并且不要把EB 洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB 的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。
3. 溴酚蓝为常用电泳指示剂，呈蓝紫色。在1%、1.4%、2%的琼脂糖凝胶电泳中，溴酚蓝的迁移率分别与600bp 、200bp 、150bp 的双链线性DNA 片段大致相同。
思考题
1、论述EB 显色的原理。
2、DNA 的分子大小及构型与迁移速率的关系如何？
3、凝胶上样缓冲液的作用是什么？
1．试分析如何通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定DNA 的浓度、纯度和分子量。