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・继续教育园地・
病毒基因分型方法的研究进展及应用
杨银辉
同一种病毒不同分离株(变异株) 之间核苷酸序列及抗原性之间的差异造成了各分离株间血清学反应性、致病性、毒力、对治疗的应答、流行区域及分布等的不同。因此, 进一步研究病毒分型对流行病学调查、病毒毒力强弱的研究、不同亚型病毒特异疫苗的研制、病毒感染的自然历程及其持续感染在发病过程中的作用、病毒的演变过程、病毒与宿主的相互作用及临床治疗效果等有着十分重要的意义。
传统的血清学分型方法包括空斑减少试验(PRNT ) 、血凝抑制试验(H I ) 、放射免疫沉淀、免疫印迹试验、吸附试验(E L I S A ) 等。一般具有简便、行等优点, , , , 。病毒在蛋白质或病毒颗粒水平主要特性不变时, 不同分离株间在核苷酸水平存在不同程度的变异, 这是病毒基因分型的基础。利用分子生物学方法对病毒进行基因分型, 可以区分单个核苷酸的差异, 因此准确率高, 可以区分病毒的不同变异株。因此, 现在病毒分型多采用的是基因分型法。
目前, 用于病毒基因分型的方法除了型和亚型特异性聚合酶链式反应(PCR ) 之外, 还有寡核苷酸指纹图谱技术、核酸序列分析法、限制性片段长度多态性分析法(RF LP ) 、限制性核酸内切酶分析(RE A ) 、异源双链泳动法(HMA ) 、单链构象多态性(SSCF ) 、基因组片段长度多态性、核酸杂交法、基因芯片法等。
一、病毒基因分型方法
11寡核苷酸指纹图谱技术(oligonucleotide finger p rint analysis ) :寡核苷酸指纹图谱技术最早是由De W achter 和Fiers 描述的, 是可用于RNA 病毒分析的一种鉴定方法。其
因稳定性研究, 尤其是在鉴定新出现或重新出现的病毒株上有很重要的应用价值。缺点是无法对差别大的两条来源不同的核酸进行比较。
21核酸序列分析(nucleotide sequencing ) :核酸序列分析
的基础是在变性聚丙烯酰胺凝胶(又称测序胶) 上进行的高分离度的电泳过程, 的。沿用, 但标记, 将这四种不同“颜色”的DNA 片段混合后加入同一样品孔中, 高压电泳使DNA 片段分离而形成阶梯式分布, 最后通过荧光信号检测系统直接确定该阶梯中DNA 片段3’末端终止碱基的特征。
核酸序列分析能准确分辨出一个碱基的差异, 对病毒的精确分类、鉴定及分型有着十分重要的意义。通过对病毒基因组序列进行测定, 并对不同分离株序列进行系统发生学比较, 可以对病毒株进行基因分型。核酸序列分析是病毒基因分型中最精确的方法, 但技术条件要求高、费用昂贵, 需反复比较分析才能得出结论, 难以进行大规模的检测。但在某些病毒中, 可以用部分序列代替基因组全序列进行基因分型, 如在研究HBV 时发现, S 基因序列的变化基本上与全基因序列的变化一致, 单用S 基因序列分析进行分型是可靠的, 基本上可取代全基因分析, 从而简化了HBV 的分型方法。
31限制性片段长度多态性分析(Restricti on Frag ment Length Poly mor phis m, RF LP ) :限制性片段长度多态性的原理
是由于DNA 的多态性, 致使DNA 分子的限制酶切位点及数目发生改变, 用限制酶切割基因组时, 所产生的片段数目和每个片段的长度就不同, 即所谓的限制性片段长度多态性。导致限制片段长度发生改变的酶切位点, 又称为多态性位点。最早应用于病毒基因分型的是Southern B l ot/RFLP 方法, 现在多采用聚合酶链反应(PCR ) 与限制酶酶切相结合的方法, 即PCR 2RF LP 法。
RF LP 敏感性高, 但酶切位点易受基因变异影响, 且遇
原理是将提纯的病毒RNA, 通过T1核糖核酸酶酶切, 产生大小不同的片段, 经放射性核素标记(或在病毒培养时标记) 后, 进行垂直双相电泳, 再经放射自显影得到特征性的图谱, 即寡核苷酸指纹图谱, 借此对不同病毒株的核酸进行分析比较。
寡核苷酸指纹图谱技术敏感性高, 能区别核酸之间微小的差异, 甚至单个核苷酸之间的区别, 并且重复性很好。这对在自然条件下容易出现变异的病毒鉴定是很有价值的。该技术可以将野外分离株和疫苗株区别开并进行疫苗株基
作者单位:100071军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室
混合感染或酶切不完全时, 会出现复杂条带, 影响分型结果判断。另外, RF LP 要求有较大含量的病毒模板DNA, 对纯度要求较高。而且要有一套限制性内切酶。如果病毒基因的变异不在限制性内切酶的酶切位点范围, 或所使用的限制性内切酶的数量不够, 均可造成漏检及分型的不准确。
41限制性核酸内切酶分析(Restricti on Endonuclease
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Analysis, RE A ) :限制性核酸内切酶分析(RE A ) 是将提纯的酸法(Sequence Specific O ligonucleotide, SS O ) 。原理是PCR 基因片段扩增后利用序列特异性寡核苷酸探针, 通过杂交的方法进行扩增片段的分析鉴定。探针与PCR 产物在一定条件下杂交具有高度的特异性, 严格遵循碱基互补的原则。探针可用放射性核素标记, 通过放射自显影的方法检测, 也可以用非放射性标记如地高辛、生物素、过氧化物酶等进行相应的标记物检测。PCR 2SSP 法:SSP 技术即序列特异性引物分析(Sequence Specific p ri m er, SSP ) 。即根据不同病毒型或亚型的核苷酸序列, 设计出一套针对不同基因型或亚型的特异性引物, PCR 扩增产物只能与某一型或亚型的特异性片段的碱基序列互补性结合, 通过PCR 特异性地扩增该基因片段, 从而达到分析基因多态性的目的。这里主要介绍反向杂交法和微板核酸杂交法。
(assay ) :反向核酸iP ) ) 基因组DNA 经合适的限制性内切酶消化后, 形成一系列
DNA 片段, 通过凝胶电泳分离片段, 对这些片段的迁移率及
数量进行分析, 便可了解到遗传物质的一定特性, 在此基础上采用双酶切割或杂交等方法, 则可推测出片段的排列顺序和酶切位点, 以及DNA 间存在的相似性或差异性, 从而判定不同病毒分离株之间的亲缘关系。
RE A 操作简单, 但结果较复杂, 不易分析, 若要克服上
述缺点, 在不影响结果分析的条件下, 可通过适当减少酶切片段数量, 以有利于分析。
51异源双链泳动法(heter odup lex mobility assay , H MA ) :
异源双链泳动法是利用变异了的DNA 单链与探针杂交后不能形成100%的互补而产生尖状突起等结构, 从而改变了杂交产物在电场中的泳动速率, 在电泳谱带中与未变异的杂交分子形成不同的区带, 进而与已知的变异分子所形成的谱带比较位置, 达到鉴别变异株型的目的。
异源双链泳动分析法是由M ullins 析中建立的一种方法, , 的分析, 。MA , 但两者仍存在较高的一致率。因此H MA 作为一个快速、简便、经济、特异的
H I V 亚型分析方法, 可在具备一定实验条件的基层单位开
, 再将聚合酶链反应(PCR ) 扩增的, 以确定其所属的基因型。现市场已有成型的用于检测丙型肝炎病毒基因型的试剂盒
(I nno 2L iP A HC V, I nnogenetics ) 。
这种方法可以一次性筛查多种不同的病毒基因序列, 克服了传统的杂交法一次只能检测一种未知序列的局限性, 而且敏感性高, 每点50～100ng 的探针浓度即可得到满意的金黄色杂交结果。
微板核酸杂交法:微板核酸杂交法是将型特异性探针按照一定的浓度包被于微孔中, 再将聚合酶链反应(PCR ) 扩增的病毒基因片段与微板中的探针杂交, 以确定其所属的基因型。近年来发展起一种将基因扩增、核酸杂交及酶联显色结合起来的方法, 即PCR 微板核酸杂交～E L I S A 法。该方法是将待测核酸经PCR 扩增后, 分别与病毒各型探针杂交, 然后通过酶联显色判断结果。发挥了核酸杂交特异性强、PCR 技术灵敏度高、E L I S A 方法信号检测方便的优点。可大规模进行标本的检测和基因分型。
该方法在临床实验室应用具有以下优点:容易操作, 稳定性好, 试剂容易购得; 无放射性污染及溴化乙啶污染; 仪器读取数据结果客观, 避免主观干扰; 杂交过程短, 便于同时大量样本检测; 敏感性高, 大于琼脂糖凝胶电泳10倍以上; 可实现自动化。缺点是微板核酸杂交E L I S A 法虽然特异性较高, 但杂交后需复杂的显色步骤, 杂交背景也很容易受各种因素的干扰。
81基因芯片法(gene chi p ) :基因芯片, 又称基因微矩阵(m icr oarray ) , 其原理是将大量特定的基因片段或寡核苷酸
展。世界卫生组织曾做过不同方法对不同H I V 亚型的检定对照, H MA 在非序列测定方法中以最高的分辨率分辨出
H I V 的主要亚型。H MA 也可以用作抗药性变异株的检测。
61单链构象多态性(single 2strand confor mati on poly mor phi 2s m analysis, SSCP ) :单链DNA 片段呈复杂的空间折叠构象,
这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的, 当有一个碱基发生改变时, 会或多或少地影响其空间构象, 使构象发生改变, 空间构象有差异的单链DNA 分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同。因此, 通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(P AGE ) , 可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开。这种方法称为SSCP 分析。现在有将
SSCP 用于检查PCR 扩增产物的PCR 2SSCP 技术, 进一步提
高了检测方法的简便性和灵敏性。
该方法简便、快速、灵敏, 不需要特殊的仪器, 适合临床实验的需要。但它也有不足之处。电泳条件要求较严格; 另外, 由于SS CP 是依据点突变引起单链DNA 分子立体构象的改变来实现电泳分离的, 这样就可能会出现当某些位置的点突变对单链DNA 分子立体构象的改变不起作用或作用很小时, 再加上其他条件的影响, 使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检。尽管如此, 该方法和其他方法相比仍有较高的检测率。
71核酸杂交法:现行的核酸分子杂交方法有多种, 用于
片段作为探针有序地和高密度地排列固定于玻璃或硅等载体上, 然后与待测的有荧光标记的样品核酸按碱基配对的原则进行杂交, 通过激光共聚焦系统检测杂交信号强度, 经计算机分析处理数据资料, 获取样品分子的数量和序列信息, 从而可对核酸序列进行大规模、高通量的研究。病毒基因分
病毒基因分型的主要有反向杂交法和微板核酸杂交法。近年来还有在PCR 与核酸杂交基础上发展起来的PCR 2SS O 法和PCR 2SSP 法。PCR 2SS O 法:SS O 技术即是序列特异寡核苷
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型芯片是将型特异探针固定在载玻片上制成。通过将荧光标记的样品与病毒基因分型芯片杂交后某型处的杂交点出现荧光而确定某种病毒的基因类型。
基因芯片信号结果是用荧光扫描仪扫描获得, 灵敏度高, 且杂交洗涤后直接扫描, 操作简便。基因芯片把阴、阳性对照和待检样品的DNA 在同一反应体系中进行杂交, 可以很好的对阴、阳性结果进行监控分析, 更好地确保避免假阴性或假阳性。另外, 基因芯片直接把分型探针固定在玻片上, 可避免由于通用序列变异而出现的假阴性。因此, 基因芯片用于病毒的基因分型检测有很多潜在的优势, 但在实现过程中可能会遇到许多有待解决的问题。主要是由于PCR 产物与芯片上的各种探针杂交时, 需要在同一体系中进行, 而各种探针的长短与G +C 含量都可能不同, 使最佳杂交和洗涤温度不一, 这就需要对反应条件进行同化。
91依赖核酸序列的扩增技术(Nucleic acid sequence 2based a mp lificati on , NAS BA ) :NAS BA 是一项连续、等温H I V 流行株型别的最准确方法, 但由于其技术要求高, 费用
高, 因此不易普及。据H I V 21感染者血清抗体对不同H I V 21毒株V3肽的反应性, 可以推测H I V 21毒株的类型。但血清学分型与基因分型结果不完全一致, 用它进行亚型分析时准确性较低。异源双链泳动分析法是一种简单、快速、经济和高特异的亚型分析方法, 目前已广泛用于H I V 亚型分析。
2. 丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV ) :丙型肝炎病
毒(HCV ) 是丙型肝炎的主要病原, 其转慢性率大于80%, 由于缺乏复制修饰机制, HC V 基因组变异较大, 存在着不同的基因型。Si m monds 等根据病毒基因组核苷酸序列的同源性提出了一个HCV 基因型分类命名系统, 与以往的命名系统有大致的对应关系已广为接受。该系统将HCV 分为6个主要基因型。每型又由若干亚型组成, ～30%, 同一以上。
. HBV ) :乙型肝炎病
于酶反应的核酸扩增技术核糖核酸酶H 、噬菌体T7引物。, , 骤中的EC L 探针ECL 探针形成复合物, 携带该复合物的磁珠被电极的表面磁性捕获。电极上的电压引起电化学发光(EC L ) 反应。已杂交上的钌标磁珠发出的光和扩增反应产生的RNA 扩增产物总量成比例对应。
NAS BA 技术主要用于RNA 的扩增、检测及测序, 具有
毒(HBV ) , 通过对HBV 全基因组的比较, 现将
分为8个基因型, 其标准为不同基因型之间序列的差
异大于8%, 相同基因型之间序列的同源性大于92%。HBV 的基因型具有明显的地理分布特点, 如A 型主要在北欧和非洲, B 型和C 型主要在东亚, D 型在中东、北非和南欧, E 型在非洲, F 型仅在南美。近年研究发现HBV 基因型的类别与HBV 传播方式、临床疾病谱、预后判断及抗病毒治疗的选择都有一定的相关性。
最早Oka mot o 等通过对HBV 全基因序列的测定, 奠定了基因型分型的基础。然后, Nor pmder 等也是通过对HBV 全基因序列的测定, 扩充了HBV 基因型的种类, 其分型标准为基因型之间的全序列核苷酸的差异大于8%。Nor pmder 等在进行HBV DNA 全序列分析的同时, 用HBV DNA 4个
ORP 建立简洁的进化树图, 并同全序列的进化树图比较, 发
高度特异性和敏感性, 最适合分析RNA 样品。在标准的条件下, 这项测试能在4h 左右结束。此外, NAS BA 操作简便, 不需特殊仪器, 不需温度循环, 其扩增效率高于PCR 。与
PCR 技术相比, 其操作更加便利, 操作人员只需要接受最低
限度的培训。NAS BA 检测禽流感病毒(H5N1型) 的敏感性与经典的鸡胚病原分离方法相当, 并具有检测速度快、特异性强、易于操作的特点。
二、几种重要病毒的基因分型
1. 人类免疫缺陷病毒(hu man i m munodeficiency virus , H I V ) :H I V 是一种具有高度变异性的逆转录病毒。RNA 基
现S 基因序列的变化除一些分支顺序上的差异, 基本上与全基因序列的变化一致, 单用S 基因分型是可靠的, 从而简化了HBV DNA 的分型方法。此方法虽较全基因测序简易, 结果准确可靠, 基本上可取代全基因分析来确认新的基因型, 但在序列测定后仍需作繁琐的分子进化分析。此后,
M izoka m i 等建立S 基因PCR ～RF LP 基因型分型法, H ideo 等
因组通过逆转录酶逆转录为DNA 时, 由于逆转录酶缺乏校正能力, 容易发生差错, 同时在机体巨大的免疫压力下, H I V 也需要发生变异以适应其生存。随着H I V 流行时间的延长, 其基因变异程度不断增大并产生许多具有相对独立基因序列特性的亚型(subtype ) , 并在全球范围流行蔓延过程中形成一定的地区性分布特点。H I V 21的流行最为广泛, 根据
gag 和膜蛋白基因(env ) 区的基因序列及系统树分析可将H I V 21分为M 、N 和O 群, 再根据H I V 21基因组中变异性最
通过在HBV 基因组前S 区及S 区选择基因型特异性的引物进行PCR 方法进行基因分型。
4. 人乳头瘤病毒(Hu man pap ill oma virus, HP V ) :人乳头
瘤病毒广泛感染人类皮肤、生殖道、呼吸道等上皮组织, 已被证实与多种良、恶性肿瘤(如尖锐湿疣、外阴癌、阴茎癌、宫颈癌、肺癌等) 的发生有关。其中HP V26, 11型与90%以上尖锐湿疣的发生有关, 宫颈癌的发生以HP V 216, 18等高危型的比重为高。因此快速、准确地检测HP V 及区分型别, 对于生殖区癌前病变及肿瘤的早期发现、预防及预后监测是十分重要的。
(收稿日期:2005204205)
大的env 核苷酸和氨基酸序列特点, 将H I V 21分为至少十种亚型, 即A 2I 和O 亚型。
目前, 用于H I V 分型的方法主要有DNA 序列测定、血清法、核酸探针法及异源双链泳动分析法。序列测定是确定
(本文编辑:唐栋)
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病毒基因分型方法的研究进展及应用
杨银辉
同一种病毒不同分离株(变异株) 之间核苷酸序列及抗原性之间的差异造成了各分离株间血清学反应性、致病性、毒力、对治疗的应答、流行区域及分布等的不同。因此, 进一步研究病毒分型对流行病学调查、病毒毒力强弱的研究、不同亚型病毒特异疫苗的研制、病毒感染的自然历程及其持续感染在发病过程中的作用、病毒的演变过程、病毒与宿主的相互作用及临床治疗效果等有着十分重要的意义。
传统的血清学分型方法包括空斑减少试验(PRNT ) 、血凝抑制试验(H I ) 、放射免疫沉淀、免疫印迹试验、吸附试验(E L I S A ) 等。一般具有简便、行等优点, , , , 。病毒在蛋白质或病毒颗粒水平主要特性不变时, 不同分离株间在核苷酸水平存在不同程度的变异, 这是病毒基因分型的基础。利用分子生物学方法对病毒进行基因分型, 可以区分单个核苷酸的差异, 因此准确率高, 可以区分病毒的不同变异株。因此, 现在病毒分型多采用的是基因分型法。
目前, 用于病毒基因分型的方法除了型和亚型特异性聚合酶链式反应(PCR ) 之外, 还有寡核苷酸指纹图谱技术、核酸序列分析法、限制性片段长度多态性分析法(RF LP ) 、限制性核酸内切酶分析(RE A ) 、异源双链泳动法(HMA ) 、单链构象多态性(SSCF ) 、基因组片段长度多态性、核酸杂交法、基因芯片法等。
一、病毒基因分型方法
11寡核苷酸指纹图谱技术(oligonucleotide finger p rint analysis ) :寡核苷酸指纹图谱技术最早是由De W achter 和Fiers 描述的, 是可用于RNA 病毒分析的一种鉴定方法。其
因稳定性研究, 尤其是在鉴定新出现或重新出现的病毒株上有很重要的应用价值。缺点是无法对差别大的两条来源不同的核酸进行比较。
21核酸序列分析(nucleotide sequencing ) :核酸序列分析
的基础是在变性聚丙烯酰胺凝胶(又称测序胶) 上进行的高分离度的电泳过程, 的。沿用, 但标记, 将这四种不同“颜色”的DNA 片段混合后加入同一样品孔中, 高压电泳使DNA 片段分离而形成阶梯式分布, 最后通过荧光信号检测系统直接确定该阶梯中DNA 片段3’末端终止碱基的特征。
核酸序列分析能准确分辨出一个碱基的差异, 对病毒的精确分类、鉴定及分型有着十分重要的意义。通过对病毒基因组序列进行测定, 并对不同分离株序列进行系统发生学比较, 可以对病毒株进行基因分型。核酸序列分析是病毒基因分型中最精确的方法, 但技术条件要求高、费用昂贵, 需反复比较分析才能得出结论, 难以进行大规模的检测。但在某些病毒中, 可以用部分序列代替基因组全序列进行基因分型, 如在研究HBV 时发现, S 基因序列的变化基本上与全基因序列的变化一致, 单用S 基因序列分析进行分型是可靠的, 基本上可取代全基因分析, 从而简化了HBV 的分型方法。
31限制性片段长度多态性分析(Restricti on Frag ment Length Poly mor phis m, RF LP ) :限制性片段长度多态性的原理
是由于DNA 的多态性, 致使DNA 分子的限制酶切位点及数目发生改变, 用限制酶切割基因组时, 所产生的片段数目和每个片段的长度就不同, 即所谓的限制性片段长度多态性。导致限制片段长度发生改变的酶切位点, 又称为多态性位点。最早应用于病毒基因分型的是Southern B l ot/RFLP 方法, 现在多采用聚合酶链反应(PCR ) 与限制酶酶切相结合的方法, 即PCR 2RF LP 法。
RF LP 敏感性高, 但酶切位点易受基因变异影响, 且遇
原理是将提纯的病毒RNA, 通过T1核糖核酸酶酶切, 产生大小不同的片段, 经放射性核素标记(或在病毒培养时标记) 后, 进行垂直双相电泳, 再经放射自显影得到特征性的图谱, 即寡核苷酸指纹图谱, 借此对不同病毒株的核酸进行分析比较。
寡核苷酸指纹图谱技术敏感性高, 能区别核酸之间微小的差异, 甚至单个核苷酸之间的区别, 并且重复性很好。这对在自然条件下容易出现变异的病毒鉴定是很有价值的。该技术可以将野外分离株和疫苗株区别开并进行疫苗株基
作者单位:100071军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室
混合感染或酶切不完全时, 会出现复杂条带, 影响分型结果判断。另外, RF LP 要求有较大含量的病毒模板DNA, 对纯度要求较高。而且要有一套限制性内切酶。如果病毒基因的变异不在限制性内切酶的酶切位点范围, 或所使用的限制性内切酶的数量不够, 均可造成漏检及分型的不准确。
41限制性核酸内切酶分析(Restricti on Endonuclease
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Analysis, RE A ) :限制性核酸内切酶分析(RE A ) 是将提纯的酸法(Sequence Specific O ligonucleotide, SS O ) 。原理是PCR 基因片段扩增后利用序列特异性寡核苷酸探针, 通过杂交的方法进行扩增片段的分析鉴定。探针与PCR 产物在一定条件下杂交具有高度的特异性, 严格遵循碱基互补的原则。探针可用放射性核素标记, 通过放射自显影的方法检测, 也可以用非放射性标记如地高辛、生物素、过氧化物酶等进行相应的标记物检测。PCR 2SSP 法:SSP 技术即序列特异性引物分析(Sequence Specific p ri m er, SSP ) 。即根据不同病毒型或亚型的核苷酸序列, 设计出一套针对不同基因型或亚型的特异性引物, PCR 扩增产物只能与某一型或亚型的特异性片段的碱基序列互补性结合, 通过PCR 特异性地扩增该基因片段, 从而达到分析基因多态性的目的。这里主要介绍反向杂交法和微板核酸杂交法。
(assay ) :反向核酸iP ) ) 基因组DNA 经合适的限制性内切酶消化后, 形成一系列
DNA 片段, 通过凝胶电泳分离片段, 对这些片段的迁移率及
数量进行分析, 便可了解到遗传物质的一定特性, 在此基础上采用双酶切割或杂交等方法, 则可推测出片段的排列顺序和酶切位点, 以及DNA 间存在的相似性或差异性, 从而判定不同病毒分离株之间的亲缘关系。
RE A 操作简单, 但结果较复杂, 不易分析, 若要克服上
述缺点, 在不影响结果分析的条件下, 可通过适当减少酶切片段数量, 以有利于分析。
51异源双链泳动法(heter odup lex mobility assay , H MA ) :
异源双链泳动法是利用变异了的DNA 单链与探针杂交后不能形成100%的互补而产生尖状突起等结构, 从而改变了杂交产物在电场中的泳动速率, 在电泳谱带中与未变异的杂交分子形成不同的区带, 进而与已知的变异分子所形成的谱带比较位置, 达到鉴别变异株型的目的。
异源双链泳动分析法是由M ullins 析中建立的一种方法, , 的分析, 。MA , 但两者仍存在较高的一致率。因此H MA 作为一个快速、简便、经济、特异的
H I V 亚型分析方法, 可在具备一定实验条件的基层单位开
, 再将聚合酶链反应(PCR ) 扩增的, 以确定其所属的基因型。现市场已有成型的用于检测丙型肝炎病毒基因型的试剂盒
(I nno 2L iP A HC V, I nnogenetics ) 。
这种方法可以一次性筛查多种不同的病毒基因序列, 克服了传统的杂交法一次只能检测一种未知序列的局限性, 而且敏感性高, 每点50～100ng 的探针浓度即可得到满意的金黄色杂交结果。
微板核酸杂交法:微板核酸杂交法是将型特异性探针按照一定的浓度包被于微孔中, 再将聚合酶链反应(PCR ) 扩增的病毒基因片段与微板中的探针杂交, 以确定其所属的基因型。近年来发展起一种将基因扩增、核酸杂交及酶联显色结合起来的方法, 即PCR 微板核酸杂交～E L I S A 法。该方法是将待测核酸经PCR 扩增后, 分别与病毒各型探针杂交, 然后通过酶联显色判断结果。发挥了核酸杂交特异性强、PCR 技术灵敏度高、E L I S A 方法信号检测方便的优点。可大规模进行标本的检测和基因分型。
该方法在临床实验室应用具有以下优点:容易操作, 稳定性好, 试剂容易购得; 无放射性污染及溴化乙啶污染; 仪器读取数据结果客观, 避免主观干扰; 杂交过程短, 便于同时大量样本检测; 敏感性高, 大于琼脂糖凝胶电泳10倍以上; 可实现自动化。缺点是微板核酸杂交E L I S A 法虽然特异性较高, 但杂交后需复杂的显色步骤, 杂交背景也很容易受各种因素的干扰。
81基因芯片法(gene chi p ) :基因芯片, 又称基因微矩阵(m icr oarray ) , 其原理是将大量特定的基因片段或寡核苷酸
展。世界卫生组织曾做过不同方法对不同H I V 亚型的检定对照, H MA 在非序列测定方法中以最高的分辨率分辨出
H I V 的主要亚型。H MA 也可以用作抗药性变异株的检测。
61单链构象多态性(single 2strand confor mati on poly mor phi 2s m analysis, SSCP ) :单链DNA 片段呈复杂的空间折叠构象,
这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的, 当有一个碱基发生改变时, 会或多或少地影响其空间构象, 使构象发生改变, 空间构象有差异的单链DNA 分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同。因此, 通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(P AGE ) , 可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开。这种方法称为SSCP 分析。现在有将
SSCP 用于检查PCR 扩增产物的PCR 2SSCP 技术, 进一步提
高了检测方法的简便性和灵敏性。
该方法简便、快速、灵敏, 不需要特殊的仪器, 适合临床实验的需要。但它也有不足之处。电泳条件要求较严格; 另外, 由于SS CP 是依据点突变引起单链DNA 分子立体构象的改变来实现电泳分离的, 这样就可能会出现当某些位置的点突变对单链DNA 分子立体构象的改变不起作用或作用很小时, 再加上其他条件的影响, 使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检。尽管如此, 该方法和其他方法相比仍有较高的检测率。
71核酸杂交法:现行的核酸分子杂交方法有多种, 用于
片段作为探针有序地和高密度地排列固定于玻璃或硅等载体上, 然后与待测的有荧光标记的样品核酸按碱基配对的原则进行杂交, 通过激光共聚焦系统检测杂交信号强度, 经计算机分析处理数据资料, 获取样品分子的数量和序列信息, 从而可对核酸序列进行大规模、高通量的研究。病毒基因分
病毒基因分型的主要有反向杂交法和微板核酸杂交法。近年来还有在PCR 与核酸杂交基础上发展起来的PCR 2SS O 法和PCR 2SSP 法。PCR 2SS O 法:SS O 技术即是序列特异寡核苷
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型芯片是将型特异探针固定在载玻片上制成。通过将荧光标记的样品与病毒基因分型芯片杂交后某型处的杂交点出现荧光而确定某种病毒的基因类型。
基因芯片信号结果是用荧光扫描仪扫描获得, 灵敏度高, 且杂交洗涤后直接扫描, 操作简便。基因芯片把阴、阳性对照和待检样品的DNA 在同一反应体系中进行杂交, 可以很好的对阴、阳性结果进行监控分析, 更好地确保避免假阴性或假阳性。另外, 基因芯片直接把分型探针固定在玻片上, 可避免由于通用序列变异而出现的假阴性。因此, 基因芯片用于病毒的基因分型检测有很多潜在的优势, 但在实现过程中可能会遇到许多有待解决的问题。主要是由于PCR 产物与芯片上的各种探针杂交时, 需要在同一体系中进行, 而各种探针的长短与G +C 含量都可能不同, 使最佳杂交和洗涤温度不一, 这就需要对反应条件进行同化。
91依赖核酸序列的扩增技术(Nucleic acid sequence 2based a mp lificati on , NAS BA ) :NAS BA 是一项连续、等温H I V 流行株型别的最准确方法, 但由于其技术要求高, 费用
高, 因此不易普及。据H I V 21感染者血清抗体对不同H I V 21毒株V3肽的反应性, 可以推测H I V 21毒株的类型。但血清学分型与基因分型结果不完全一致, 用它进行亚型分析时准确性较低。异源双链泳动分析法是一种简单、快速、经济和高特异的亚型分析方法, 目前已广泛用于H I V 亚型分析。
2. 丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV ) :丙型肝炎病
毒(HCV ) 是丙型肝炎的主要病原, 其转慢性率大于80%, 由于缺乏复制修饰机制, HC V 基因组变异较大, 存在着不同的基因型。Si m monds 等根据病毒基因组核苷酸序列的同源性提出了一个HCV 基因型分类命名系统, 与以往的命名系统有大致的对应关系已广为接受。该系统将HCV 分为6个主要基因型。每型又由若干亚型组成, ～30%, 同一以上。
. HBV ) :乙型肝炎病
于酶反应的核酸扩增技术核糖核酸酶H 、噬菌体T7引物。, , 骤中的EC L 探针ECL 探针形成复合物, 携带该复合物的磁珠被电极的表面磁性捕获。电极上的电压引起电化学发光(EC L ) 反应。已杂交上的钌标磁珠发出的光和扩增反应产生的RNA 扩增产物总量成比例对应。
NAS BA 技术主要用于RNA 的扩增、检测及测序, 具有
毒(HBV ) , 通过对HBV 全基因组的比较, 现将
分为8个基因型, 其标准为不同基因型之间序列的差
异大于8%, 相同基因型之间序列的同源性大于92%。HBV 的基因型具有明显的地理分布特点, 如A 型主要在北欧和非洲, B 型和C 型主要在东亚, D 型在中东、北非和南欧, E 型在非洲, F 型仅在南美。近年研究发现HBV 基因型的类别与HBV 传播方式、临床疾病谱、预后判断及抗病毒治疗的选择都有一定的相关性。
最早Oka mot o 等通过对HBV 全基因序列的测定, 奠定了基因型分型的基础。然后, Nor pmder 等也是通过对HBV 全基因序列的测定, 扩充了HBV 基因型的种类, 其分型标准为基因型之间的全序列核苷酸的差异大于8%。Nor pmder 等在进行HBV DNA 全序列分析的同时, 用HBV DNA 4个
ORP 建立简洁的进化树图, 并同全序列的进化树图比较, 发
高度特异性和敏感性, 最适合分析RNA 样品。在标准的条件下, 这项测试能在4h 左右结束。此外, NAS BA 操作简便, 不需特殊仪器, 不需温度循环, 其扩增效率高于PCR 。与
PCR 技术相比, 其操作更加便利, 操作人员只需要接受最低
限度的培训。NAS BA 检测禽流感病毒(H5N1型) 的敏感性与经典的鸡胚病原分离方法相当, 并具有检测速度快、特异性强、易于操作的特点。
二、几种重要病毒的基因分型
1. 人类免疫缺陷病毒(hu man i m munodeficiency virus , H I V ) :H I V 是一种具有高度变异性的逆转录病毒。RNA 基
现S 基因序列的变化除一些分支顺序上的差异, 基本上与全基因序列的变化一致, 单用S 基因分型是可靠的, 从而简化了HBV DNA 的分型方法。此方法虽较全基因测序简易, 结果准确可靠, 基本上可取代全基因分析来确认新的基因型, 但在序列测定后仍需作繁琐的分子进化分析。此后,
M izoka m i 等建立S 基因PCR ～RF LP 基因型分型法, H ideo 等
因组通过逆转录酶逆转录为DNA 时, 由于逆转录酶缺乏校正能力, 容易发生差错, 同时在机体巨大的免疫压力下, H I V 也需要发生变异以适应其生存。随着H I V 流行时间的延长, 其基因变异程度不断增大并产生许多具有相对独立基因序列特性的亚型(subtype ) , 并在全球范围流行蔓延过程中形成一定的地区性分布特点。H I V 21的流行最为广泛, 根据
gag 和膜蛋白基因(env ) 区的基因序列及系统树分析可将H I V 21分为M 、N 和O 群, 再根据H I V 21基因组中变异性最
通过在HBV 基因组前S 区及S 区选择基因型特异性的引物进行PCR 方法进行基因分型。
4. 人乳头瘤病毒(Hu man pap ill oma virus, HP V ) :人乳头
瘤病毒广泛感染人类皮肤、生殖道、呼吸道等上皮组织, 已被证实与多种良、恶性肿瘤(如尖锐湿疣、外阴癌、阴茎癌、宫颈癌、肺癌等) 的发生有关。其中HP V26, 11型与90%以上尖锐湿疣的发生有关, 宫颈癌的发生以HP V 216, 18等高危型的比重为高。因此快速、准确地检测HP V 及区分型别, 对于生殖区癌前病变及肿瘤的早期发现、预防及预后监测是十分重要的。
(收稿日期:2005204205)
大的env 核苷酸和氨基酸序列特点, 将H I V 21分为至少十种亚型, 即A 2I 和O 亚型。
目前, 用于H I V 分型的方法主要有DNA 序列测定、血清法、核酸探针法及异源双链泳动分析法。序列测定是确定
(本文编辑:唐栋)