细胞总蛋白的提取及裂解液
一.悬浮细胞计数107重悬于0.5mlPBS(0.01M)中,加入饱和浓度一抗(1/10)或 (10ug/ml)4℃15-30min后,短暂离心4000 转×3分,用PBS 0.4-0.5ml重悬(室 温),加入饱和浓度二抗(1/100)或 (20ug/ml),迅速置于37℃水浴中2-5分后 (迅速加入终止液0.5ml(冷pbs中含有400uM Na3VO4
,5mM EDTA,10mM NaF)),
离心4000 转×3分,弃上清,置于冰浴中,加入裂解液0.2-0.3ml(裂解浓度
108/ml?)吸管轻轻混匀,冰点缓慢震摇孵育30分钟后加入10ul浓度为10mg/ml 的PMSF储存液,冰点孵育30分钟。4度离心15000g 20min。上清液即为全部细 胞溶解成分。
二.裂解缓冲液:
50mM Tris-HCl pH7.6 或20mM Hepes pH7.4
150-300mM NaCl
1%(w/w)NP-40 (0.5%Triton-X100) 5mM EDTA(现加1ml加10ul)
临用前加入蛋白酶抑制剂:
Na3VO4
钒酸钠 1mM (75mM—13.3ul/ml)
(用0.2mol/L储存液配制)
PMSF苯甲酰氟 1mM (10mg/ml PMSF 用量:10ul/ml)
或10-20ug/ml Soybean Trypsin inhibitor (加10-20ul)
Aprotinin 抑肽酶 10ug/ml(10ul/ml)
(Leupeptin 亮肽素 10ug/ml 未加) Western blotting
三.给你介绍一个裂解液:
50mM Tris-HCl (PH8.0)缓冲液,含:
NaCl 150mM
叠氮钠 0.02%
SDS 0.1%
NP-40 1%
PMSF 100ug/ml(使用前临时加入)(10mg/ml PMSF 用量:10ul/ml)
尽量用少的裂解液裂解细胞,取上清电泳,最好用6xSDS 上样buffer。
四.我的样品蛋白是这样制备的:
1.将与腺病毒转染液共培养24小时的细胞消化下来
2.离心收集细胞
3.向离心管里加入40微升1×PBS 缓冲液,随后再加入40微升2×Lamily buffer (由tris碱和SDS 组成)裂解细胞
4.将细胞裂解液放入沸水中加热五分钟,放冷后离心.
5.测定蛋白浓度,加样电泳
我所说的前沿有蛋白是指胶的底端,不是指加样孔下面有蛋白.胶的浓度应该没 问题。
五.碧云天公司技术支持
Western 及IP 细胞裂解液的主要成分为20mM Tris(pH 7.5),150mM NaCl,1% Triton X-100,以及焦磷酸钠, β-glycerophosphate,EDTA,Na3VO4,leupeptin
等多种抑制剂。可以有效抑制蛋白的降解,并维持原有的蛋白间相互作用。(-20 ℃保存,一年有效。)
如果是贴壁细胞,按照6孔板每孔加入100微升裂解液的比例(即细胞培养液量 的1/20)加入裂解液。
六.军科院技术支持
裂解液(50mmol/L Tris?HCl pH8.0,150mmol/L NaCl,1%TritonX-100,100ug/ml PMSF):
1mol/L Tris?HCl(pH8.0) 2.5ml
NaCl 0.438g
TritonX-100 0.5ml
蒸馏水至 50ml
混匀后, 4℃保存。使用时,加入PMSF 至终浓度为100ug/ml(0.87ml 裂解液 加入1.74mg/ml PMSF50μl)。
七.操作方法:
蛋白样品制备:
(1) 单层贴壁细胞总蛋白的提取:
1、倒掉培养液,并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液(或将瓶直立放置 一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走)。
2、每瓶细胞加 3ml 4 度预冷的PBS(0.01M pH7.2~7.3)。平放轻轻摇动1min 洗涤细胞,然后弃去洗液。重复以上操作两次,共洗细胞三次以洗去培养液。将 PBS 弃净后把培养瓶置于冰上。
3、按 1ml 裂解液加10 ul PMSF(100mM),摇匀置于冰上。(PMSF要摇匀至无 结晶时才可与裂解液混合。)
4、每瓶细胞加400 ul 含PMSF的裂解液,于冰上裂解30min,为使细胞充分裂 解培养瓶要经常来回摇动。
5、裂解完后,用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧(动作要快),然后用枪 将细胞碎片和裂解液移至1.5ml 离心管中。(整个操作尽量在冰上进行。)
6、于 4度下12000rpm 离心5min。(提前开离心机预冷)
7、将离心后的上清分装转移倒0.5min 的离心管中放于-20 度保存。
细胞全蛋白提取步骤
①吸取培养基,预冷PBS清洗细胞三次,细胞刮刮脱细胞,收集至离心管,1000rpm离心5分钟。洗涤后的细胞转移至洁净EP管,
②冰上操作,配制细胞裂解液,1ml Lysis,Buffer中加入10 μl磷酸酶抑制剂、1 μl蛋白酶抑制剂、5μl 100mM的PMSF。混匀后冰上保存数分钟待用。
③在洗涤好的细胞中按照每107个细胞加入1ml细胞裂解液的比例,加入细胞裂解液。200μl移液器反复吹打,至蛋白析出。
④4℃摇床,温和振摇15分钟。
⑤14000rpm,4℃离心15分钟,上清即为细胞全蛋白提取物。
⑥BCA法测蛋白浓度。蛋白分装后保存于-70℃冰箱,避免反复冻融。
提取细胞全蛋白整个过程中所有使用的物品及试剂均需预冷,防止蛋白降解。
细胞总蛋白的提取及裂解液
一.悬浮细胞计数107重悬于0.5mlPBS(0.01M)中,加入饱和浓度一抗(1/10)或 (10ug/ml)4℃15-30min后,短暂离心4000 转×3分,用PBS 0.4-0.5ml重悬(室 温),加入饱和浓度二抗(1/100)或 (20ug/ml),迅速置于37℃水浴中2-5分后 (迅速加入终止液0.5ml(冷pbs中含有400uM Na3VO4
,5mM EDTA,10mM NaF)),
离心4000 转×3分,弃上清,置于冰浴中,加入裂解液0.2-0.3ml(裂解浓度
108/ml?)吸管轻轻混匀,冰点缓慢震摇孵育30分钟后加入10ul浓度为10mg/ml 的PMSF储存液,冰点孵育30分钟。4度离心15000g 20min。上清液即为全部细 胞溶解成分。
二.裂解缓冲液:
50mM Tris-HCl pH7.6 或20mM Hepes pH7.4
150-300mM NaCl
1%(w/w)NP-40 (0.5%Triton-X100) 5mM EDTA(现加1ml加10ul)
临用前加入蛋白酶抑制剂:
Na3VO4
钒酸钠 1mM (75mM—13.3ul/ml)
(用0.2mol/L储存液配制)
PMSF苯甲酰氟 1mM (10mg/ml PMSF 用量:10ul/ml)
或10-20ug/ml Soybean Trypsin inhibitor (加10-20ul)
Aprotinin 抑肽酶 10ug/ml(10ul/ml)
(Leupeptin 亮肽素 10ug/ml 未加) Western blotting
三.给你介绍一个裂解液:
50mM Tris-HCl (PH8.0)缓冲液,含:
NaCl 150mM
叠氮钠 0.02%
SDS 0.1%
NP-40 1%
PMSF 100ug/ml(使用前临时加入)(10mg/ml PMSF 用量:10ul/ml)
尽量用少的裂解液裂解细胞,取上清电泳,最好用6xSDS 上样buffer。
四.我的样品蛋白是这样制备的:
1.将与腺病毒转染液共培养24小时的细胞消化下来
2.离心收集细胞
3.向离心管里加入40微升1×PBS 缓冲液,随后再加入40微升2×Lamily buffer (由tris碱和SDS 组成)裂解细胞
4.将细胞裂解液放入沸水中加热五分钟,放冷后离心.
5.测定蛋白浓度,加样电泳
我所说的前沿有蛋白是指胶的底端,不是指加样孔下面有蛋白.胶的浓度应该没 问题。
五.碧云天公司技术支持
Western 及IP 细胞裂解液的主要成分为20mM Tris(pH 7.5),150mM NaCl,1% Triton X-100,以及焦磷酸钠, β-glycerophosphate,EDTA,Na3VO4,leupeptin
等多种抑制剂。可以有效抑制蛋白的降解,并维持原有的蛋白间相互作用。(-20 ℃保存,一年有效。)
如果是贴壁细胞,按照6孔板每孔加入100微升裂解液的比例(即细胞培养液量 的1/20)加入裂解液。
六.军科院技术支持
裂解液(50mmol/L Tris?HCl pH8.0,150mmol/L NaCl,1%TritonX-100,100ug/ml PMSF):
1mol/L Tris?HCl(pH8.0) 2.5ml
NaCl 0.438g
TritonX-100 0.5ml
蒸馏水至 50ml
混匀后, 4℃保存。使用时,加入PMSF 至终浓度为100ug/ml(0.87ml 裂解液 加入1.74mg/ml PMSF50μl)。
七.操作方法:
蛋白样品制备:
(1) 单层贴壁细胞总蛋白的提取:
1、倒掉培养液,并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液(或将瓶直立放置 一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走)。
2、每瓶细胞加 3ml 4 度预冷的PBS(0.01M pH7.2~7.3)。平放轻轻摇动1min 洗涤细胞,然后弃去洗液。重复以上操作两次,共洗细胞三次以洗去培养液。将 PBS 弃净后把培养瓶置于冰上。
3、按 1ml 裂解液加10 ul PMSF(100mM),摇匀置于冰上。(PMSF要摇匀至无 结晶时才可与裂解液混合。)
4、每瓶细胞加400 ul 含PMSF的裂解液,于冰上裂解30min,为使细胞充分裂 解培养瓶要经常来回摇动。
5、裂解完后,用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧(动作要快),然后用枪 将细胞碎片和裂解液移至1.5ml 离心管中。(整个操作尽量在冰上进行。)
6、于 4度下12000rpm 离心5min。(提前开离心机预冷)
7、将离心后的上清分装转移倒0.5min 的离心管中放于-20 度保存。
细胞全蛋白提取步骤
①吸取培养基,预冷PBS清洗细胞三次,细胞刮刮脱细胞,收集至离心管,1000rpm离心5分钟。洗涤后的细胞转移至洁净EP管,
②冰上操作,配制细胞裂解液,1ml Lysis,Buffer中加入10 μl磷酸酶抑制剂、1 μl蛋白酶抑制剂、5μl 100mM的PMSF。混匀后冰上保存数分钟待用。
③在洗涤好的细胞中按照每107个细胞加入1ml细胞裂解液的比例,加入细胞裂解液。200μl移液器反复吹打,至蛋白析出。
④4℃摇床,温和振摇15分钟。
⑤14000rpm,4℃离心15分钟,上清即为细胞全蛋白提取物。
⑥BCA法测蛋白浓度。蛋白分装后保存于-70℃冰箱,避免反复冻融。
提取细胞全蛋白整个过程中所有使用的物品及试剂均需预冷,防止蛋白降解。