人TR基因真核表达载体的构建_营孙阳

人TＲ基因真核表达载体的构建

营孙阳，熊加秀，麦洪旭，林佳佳，姜丽娜，程

［摘要］目的

龙，叶棋浓

以人

构建人端粒酶ＲNA组分（hTＲ）的真核表达载体，并对其生物学功能进行初步检测。方法

胚肾293T 细胞ＲNA逆转录得到的cDNA 为模板，采用PCＲ技术扩增出hTＲ编码序列，将其插入到pCDNA 3．0载time quantitative PCＲ，qＲT-PCＲ）检测其表体中；将重组质粒与空载体分别转染293T 细胞，实时荧光定量PCＲ（real-PCＲ检测其效果，达情况，在HepG2细胞中构建此基因的稳定细胞系并用qＲT-通过ＲNA结合免疫共沉淀（ＲIP）实验验证其和人端粒酶逆转录酶（hTEＲT）及角化不良蛋白（dyskerin ）的相互作用，通过端粒酶重复序列扩增技术（telomerase repeat amplification protocol ，TＲAP）检测过表达hTＲ后HepG2细胞的端粒酶活性。结果

双酶切和测

pCDNA3．0-hTＲ的真核表达载体构建成功；转染293T 细胞用qＲT-PCＲ证明成功表达；qＲT-PCＲ证实序结果表明，

HepG2pCDNA3．0-hTＲ稳定细胞系筛选成功；ＲIP实验证实了hTＲ与hTEＲT和角化不良蛋白之间存在相互作用；TＲAP实验发现过表达hTＲ并不影响HepG2细胞的端粒酶活性。结论体，为进一步研究以针对hTＲ为靶标的癌症治疗奠定了基础。［关键词］端粒酶；hTＲ；基因克隆；真核表达［中图分类号］Q78

［文献标志码］A

DOI ：10．7644/j．issn．1674-9960．2016．02．015

［9960（2016）02-0137-06文章编号］1674-hTＲ真核表达载成功构建了pCDNA 3．0-

Construction of eukaryotic expression vector of human telomerase ＲNAcomponent

and its function

YING Sun-yang ，XIONG Jia-xiu ，MAI Hong-xu ，LIN Jia-jia ，JIANG Li-na ，CHENG Long *，YE Qi-nong *

（Institute of Biotechnology ，Academy of Military Medical Sciences ，Beijing 100850，China ）

*Co-corresponding authors ，YE Qi-nong ，Tel ：010-66931830，E-mail ：yeqn66@yahoo．com ；CHENG Long ，Tel ：010-66931830，E-mail ：flonic@163．com

［Abstract ］Objective To construct the eukaryotic expression vector of human telomerase ＲNAcomponent （hTＲ）and

hTＲGene was obtained by PCＲfrom cDNA template ，which was reverse

study its biological function tentatively．Methods

transcribed from 293T mＲNAand cloned into pCDNA3．0vector．The recombinant plasmid and empty vector were trans-fected into 293T cells ，and hTＲexpression was identified by qＲT-PCＲ．HepG2cells that stably transfected with pCDNA3．0-hTＲwere constructed and identified by qＲT-PCＲ．These cells were used to assess the interaction of hTＲwith human telomerase revese transcriptase （hTEＲT）and dyskerin．Telomerase activity was also detected in HepG2cells transfected with pCDNA3．0-hTＲ．Ｒesults

pCDNA3．0-hTＲeukaryotic expression vector was successfully constructed by

double digestion identification．The inserted fragment was confirmed by sequencing．The expression of hTＲin human 293T cells and HepG2pCDNA3．0-hTＲstable cell line was identified．In addition ，qＲT-PCＲand Western blotting results showed that hTＲcould interact with hTEＲTand dyskerin ，while hTＲoverexpression could not regulate the telomerase activity in HepG2cells．Conclusion

The eukaryotic expression vector of pCDNA3．0-hTＲis successfully constructed and

expressed．This study will contribute to the further study of cancer therapy targeting hTＲ．［Key words ］telomerase ；hTＲ；gene cloning ；eukaryotic expression

人端粒酶ＲNA组分（TEＲC）又名人端粒酶

［基金项目］国家自然科学基金资助项目（81330053）；北京市科技

新星计划资助项目（Z[**************]）［作者简介］营孙阳，E-mail ：男，硕士研究生，研究方向：遗传学，929661078@qq．com

［作者单位］军事医学科学院生物工程研究所，北京100850［Tel ：010-66931830，E-mail ：yeqn66@yahoo．com ；通讯作者］叶棋浓，

Tel ：010-66931830，E-mail ：flonic@163．com 程龙，

ＲNA（human telomerase ＲNA，hTＲ），定位于人染色

体3q26，具有1个外显子而无内含子，其基因转录coding ＲNA，ncＲNA）。端粒物为非编码ＲNA（non-酶是一个核糖核酸蛋白聚合酶，功能是添加端粒重复序列TTAGGG 到端粒末端而维持端粒长度，端粒酶的表达在细胞衰老过程中具有至关重要的作［1］

用。端粒酶全酶至少包含3个组分：人端粒酶逆

转录酶（human telomerase reverse transcriptase ，

hTEＲT）、hTＲ和角化不良蛋白（dyskerin ）。其中，端粒酶ＲNA组分是一个端粒酶的必要组分，其功能是作为端粒延伸的模板，其结构里含有一个H /ACA这个结构域对端粒酶的生物发生非常重结构域，要。除此之外，其他保守的ＲNA结构元件对端粒酶的定位、成熟和装配也具有重要作用。端粒酶ＲNA的突变会导致常染色体显性遗传病———先天性角化不良综合征

［4］

［3］

［2］

NCBI 网站查到的hTＲ的CDS 序列设计并合成引

CGGGATCCGGGTTGCGGAGGGT-物，上游引物：5'-GGGC-3' ，下游引物：5'-CGGA-ATTCGCATGTGT-GAGCCGAGTCCT-3' 。利用PCＲ扩增人TＲ编码序列，按以下条件用pfu 酶进行片段的扩增：95ħ 预变

95ħ 变性30s ，58ħ 退火30s ，72ħ 延伸性5min ，

45s ，72ħ 7min 再进行延长，共进行35个循环，最

后用胶回收试剂盒回收PCＲ产物。用Bam H Ⅰ和Eco ＲⅠ双酶切pCDNA 3．0载体，10g /L琼脂糖凝胶电泳后，胶回收载体大片段；将PCＲ片段回收后再用Bam H Ⅰ和Eco ＲⅠ酶切，形成带有黏端的双链，用T4DNA 连接酶连接入pCDNA 3．0载体中。转化大肠杆菌DH5α，挑选克隆，摇菌并提质粒，用Bam H Ⅰ和Eco ＲⅠ双酶切鉴定。酶切鉴定正确的克隆送北京奥科生物公司测序。1．4哺乳动物细胞转染

按照VigoFect 说明书操作方法进行转染，用普通DMEM 培养基将293T 细胞接种于35mm 皿中，接种量以转染时细胞密度达到60% 70%为宜，培养24h 后进行转染，转染前1h 换液。将2μl Vigo-Fect 与100μl NaCl 混合，再将总量为5μg 的重组质粒与100μl NaCl 混合，将二者温和混匀，室温静置15min ，混匀加入35mm 皿中，以此法转染空载4 6h 37ħ 、50ml /LCO 2常规培养，体作为对照，后换液。1．5

IP ）免疫共沉淀（immunoprecipitation ，

1ml PBS 洗，倒培养基，再用1ml PBS 刮细胞

2000r /min离心10min ，并收获细胞，吹匀，吸干

。近期研究表明，端粒酶ＲNA

的功能以及端粒酶的发生对于理解端粒酶相关疾病

［5］

具有重要意义。

本实验拟构建hTＲ的真核表达载体，并验证其与hTEＲT、角化不良蛋白的相互作用，以及测定过表达hTＲ后在HepG2细胞中的端粒酶活性，为进一

［6］

步研究端粒酶与相关基因的功能奠定基础。11．1

材料与方法材料

人胚肾293T 细胞为本室保存并传代培养，pCDNA 3．0载体为本室保存；VigoFect （威格拉斯生DNA 连接酶、物技术有限公司）；限制性内切酶、

PCＲ试剂（均TaKaＲa公司）；质粒提取、胶回收、PCＲ回收试剂盒（Promega 公司）；DMEM 及小牛血清（均Gibco 公司）；ＲNA酶抑制剂（赛百盛公司，浓度为40U /μl ）；BM 2000为最大2000bp 的DNA 标志物（Biomed 公司）；TＲAP-PCＲ试剂盒（Millipore 公司）。

测序由北京奥科生物技术有限责任公司完成。1．2

总ＲNA提取、逆转录

1．2．1ＲNA提取293T 细胞培养于6cm 皿中，待1ˑ PBS 洗，1ml TＲIzol融合度达100%时弃培养基，溶液吹下细胞，加0．2ml 氯仿提取蛋白混匀，室温放置10min 。4ħ 12000r /min离心10min ，小心取上清液0．4ml ，加等量异丙醇混匀，－20ħ 冷冻10min 。4ħ 12000r /min离心10min ，1弃上清，ml 75%乙醇（DEPC 水稀释）洗1次，4ħ 12000r /min 离心5min 后弃上清，无水乙醇洗1次，高速离心后去上清，自然干燥ＲNA约30min ，加入20μl DEPC 水溶解沉淀，即为提取的总ＲNA。1．2．2

取总ＲNA2μg ，与1μl 50μmol /L

70ħ 解链5min ，的随机引物混匀，补水至15．9μl ，

逆转录

PBS ，加入IP 低盐缓冲液300 500μl 作为裂解液

（裂解液里按DTTʒ 蛋白酶抑制剂ʒ 裂解液=1ʒ 1ʒ 1000补充加入DTT 和蛋白酶抑制剂），尽量保证细胞量相同，冰浴30min 。平衡磁珠，用IP 裂解液500μl ，4ħ 离心，3000r /min离心2min ，重复3次；超声2s 停2s ，每次探头放入液体液面下1/3处即可，不碰管壁，超声4次，超声前探头需冰浴；4ħ 离

12000r /min，15min 。将上清仔细吸出加入新心，

的EP 管中，切勿触动沉淀，同时吸出磁珠上清。将EP 管中的上清吸出30μl 至另外新的EP 管中，加入30μl SDS ，留作对照，－70ħ 保存，待IP 完成后蛋白印迹检测。用作IP 的EP 管中，加入磁珠，每管约30μl 磁珠，先用与磁珠等量IP 裂解液加入磁珠中稀释，吹吸。然后将混合液均分加入EP 管中。4h 至过夜。4ħ ，3000r /将IP 加入展示柜中摇匀，min ，离心2min ，冰上1min ，静置下沉；吸干上清不要吸到磁珠，尽量吸净。700μl IP 裂解液洗3次，4ħ 3000r /min离心2min ，冰上操作，振荡，每洗1

dNTP 、ＲNA酶抑制自然冷却至室温，加入逆转录酶、

42ħ 剂及逆转录缓冲液，剩余补水至终体积25μl ，95ħ 灭活5min ，得到逆转录的cDNA 第反应1h ，

一链。将得到的cDNA 按1ʒ 20稀释。1．3

pCDNA 3．0-hTＲ重组质粒的构建与测序以1．2步骤中所提取的cDNA 为模板，根据

次，在展示柜中摇10min ，离心。重复上一步。去上

清IP 裂解液，剩余磁珠进行后续实验。1．6

Western 印迹检测

质粒转染293T 细胞24h 后收集细胞蛋白，加入2ˑ SDS 加样缓冲液，煮沸10min ，高速离心2min

PAGE 后，取上清液进行SDS-电转移至硝酸纤维素膜上；用5%脱脂奶粉于4ħ 封闭过夜，加入用5%

脱脂奶粉以1ʒ 5000稀释且HＲP标记的抗IP 标签TBST 洗膜3次，鼠单克隆抗体，室温轻摇1h ，每次

5min ；用化学发光法显色5min ，压片显影。1．7

ＲNA结合免疫共沉淀（ＲNAbinding protein

immunoprecipitation ，ＲIP）

22．1

结果

pCDNA 3．0-hTＲ重组质粒的构建与鉴定

以所提取293T 细胞的ＲNA逆转录得到的cDNA

PCＲ扩增人hTＲ的序列，58ħ 、为模板，选取55ħ 、61ħ 、63ħ4 个退火温度扩增目的片段。结果显示，4

个退火温度均能扩增出加上酶切位点大小约467bp 的片段，与估计的片段相一致（图1）。用Bam H Ⅰ和Eco ＲⅠ酶切后的hTＲ片段和pCDNA 3．0载体连接，转化DH5α感受态，选取部分菌落进行菌液PCＲ鉴定，得到与预期大小相一致的条带，初步确定此条带为阳性重组子（图2）。将此阳性克隆提取质粒后进行酶切鉴定，得到两条长度分别约5000和500bp 的条带，空载体用同样的酶酶切后只见一条约5000bp 的条带，与预期相一致（图3）。DNA 测序结果表明，构建的质粒在MCS 插入的基因大小与NCBI 查到的hTＲ编码序列一致（测序结果略）

。

将所有试剂用DEPC 水配置，实验用器械、枪头等用DEPC 处理水处理并高压灭菌。在IP 低盐裂解液中加入终浓度为300U /ml的ＲNA酶抑制剂、1mmol /LDTT ，与1/1000的蛋白酶抑制剂。按IP 步骤裂解细胞后，取10%的裂解液作为提取ＲNA的对照，并取少量裂解液作为Western 印迹的对照，继续至IP 实验结束后，将洗脱的磁珠取一部分与Western 印迹对照一起作Western 印迹检测IP 效果，并将剩余的磁珠与10%的ＲNA对照用TＲIzol试剂盒共同提取ＲNA、逆转录，最终使用实时定量荧光PCＲ（real time quantity PCＲ，qＲT-PCＲ）检测蛋白与ＲNA结合情况。1．8

端粒酶重复序列扩增技术（telomerase repeat amplification protocol ，TＲAP）-PCＲ

图1

PCＲ

产物

PCＲ扩增得到的hTＲ序列

细胞提前24h 接种至6孔板，转染相应质粒，4h 后换液，24h 后胰酶消化细胞，离心沉淀后，用PBS 洗1次，4ħ 2000r /min离心5min ，仔细去除所有PBS 。然后将细胞冻存在－75 －80ħ 条件下，冻存细胞端粒酶可稳定保存至少1年时间。若要继续实验或细胞冻融后，须将细胞立刻重悬在200μl 1ˑ CHAPS lysis 裂解液中（105 106个细胞）。将此混合物冰浴至少30min 。4ħ 12000r /min离心20min 。取出160μl 上清于新的EP 管中，用Broadford 法测定蛋白浓度后进行PCＲ操作，蛋白最终使用量为20ng 。PCＲ体系为：10ˑ TＲAP反应液5．0μl ；50ˑ dNTP 混合物1．0ml ；TS 引物1．0μl ；TＲAP引物混合物1．0μl ；Taq 聚合酶（5U /μl ）0．4μl （2U ）；dH 2O 39．1μl ；ＲNase抑制剂0．5μl ；蛋白10ng /μl 加入2μl ；总体系共50μl 。PCＲ程序为：30ħ 30min ，94ħ 3min ，94ħ 30s ，59ħ 30s ，72ħ 1min ，72ħ 7min ，4ħ 2h 。将所得进行30个循环，

PCＲ产物利用0．5ˑ TBE 配置10%PAGE 胶进行垂直电泳，样品上样使用5ˑ 预染DNA 上样缓冲液，电泳后利用凝胶成像仪拍照。

M．BM 2000；1 4．退火温度分别为55ħ 、58ħ 、61ħ 和63ħ 的

图2hTＲ的菌液PCＲ结果电泳图谱重组质粒pCDNA 3．0-

M．BM 2000；1 5．pCDNA 3．0-hTＲ的1 5号克隆的菌液PCＲ结果；6．阳性对照（以293T 提取的ＲNA逆转录得到的cDNA 为模板扩增的阳性对照）；7．阴性对照（模板为氨苄青霉素抗性的LB 培养基）

2．2qＲT-PCＲ法检测pCDNA 3．0-hTＲ表达效果

hTＲ重组质粒和空将成功构建的pCDNA 3．0-48h 后收集细胞提取载体分别转染HEK 293T 细胞，ＲNA并逆转录，PCＲ检测hTＲ的表达情最后通过qＲT-GGTGGT-况，定量PCＲ引物选用上游引物（sense ）：5'-GGCCATTTTTTGTC-3' ，CTA-下游引物（antisense ）：5'-GAATGAACG-GTGGAAGGC-3' ［7］。结果表明，转染重

图3hTＲ的Eco ＲⅠ/Bam H Ⅰ的双酶重组质粒pCDNA 3．0-切电泳

图6过表达hTＲ不改变内源性hTEＲT与角化不良蛋白的表达

M．BM2000DNA 相对分子质量标志物；－．空载体pCDNA 3．0；1．重组质粒pCDNA 3．0-hTＲ酶切

2．5ＲIP实验验证hTＲ与hTEＲT和角化不良蛋白的结合

hTＲ与转染空载体相比组质粒后，转pCDNA 3．0-hTＲ的相对量约升高了500倍（图4）。这说明较，

hTＲ真核表达载体能在293T 细胞中正确转录

。

hTＲ与hTEＲT和为检测所构建的pCDNA 3．0-角化不良蛋白是否存在相互作用，在HepG2pCDNA 3．0-hTＲ稳定细胞系分别转染Flag 、Flag-角化不良

hTEＲT，48h 后收集细胞进行ＲIP实蛋白和Flag-Flag-hTEＲT的表达效果及验，角化不良蛋白和Flag-IP 效果用Flag-HＲP抗体检测，hTＲ用qＲT-PCＲ检hTＲ能与hTEＲT以及角化不良蛋白测，结果显示，8）

。结合（图7，

图4qＲT-PCＲ检测重组质粒的转录效果

2．3pCDNA 3．0-hTＲ稳定细胞系构建

在HepG2细胞中利用VigoFect 转染试剂分别

hTＲ，转染pCDNA 3．0和pCDNA 3．0-转染48h 后，加入浓度为500μg /mlG418，筛选1个月，筛选完成

PCＲ检测稳定细胞系的效果，后利用qＲT-结果显示所筛选的细胞系能稳定表达hTＲ（图5）

。

图7

ＲIP实验中蛋白的表达效果及IP

效果鉴定

图5hTＲ稳定细胞系的鉴定HepG2过表达pCDNA 3．0-

图8hTＲ可与角化不良蛋白以及hTEＲT结合

2．4过表达hTＲ不改变内源性hTEＲT与角化不良

2．6

蛋白的表达

利用2．3中构建的HepG2稳定转染pCDNA 3．0-hTＲ的细胞系，检测过表达hTＲ对内源性hTEＲT与角化不良蛋白的影响，继而通过Western 印迹发现过表达hTＲ后hTEＲT与角化不良蛋白的内

actin 为内参对照（图6）

。源表达量并未发生改变，

过表达hTＲ不改变HepG2细胞的端粒酶活性

在HepG2细胞内过表达空载体和pCDNA 3．0-

hTＲ，24h 后收取细胞，测量蛋白浓度，在体系中终

PCＲ实验检测细胞浓度为20ng 的蛋白利用TＲAP-内的端粒酶活性。结果显示，过表达hTＲ并不能增

10）。加端粒酶活性（图9，

表明了hTＲ和hTEＲT任何一方的量都是端粒酶装

配的限制因素。但是，在另一些细胞，如白细胞中，

［18 21］

，过表达hTＲ则不能增加端粒酶活性究其原

因可能是hTＲ基因的表达在数量和空间效应上同

细胞内的端粒酶ＲNA组分产生竞争，一定程度上也阻碍了端粒酶ＲNA模板区与端粒DNA 的结合。本研究在肝癌HepG2细胞中过表达hTＲ，探讨hTＲ基因在HepG2细胞中所起的作用，结果表明，虽然hTＲ的表达量增加，但是肝癌细胞的端粒酶活性并没有增加，说明hTＲ过表达并不能提高肝癌细

图9

过表达hTＲ并不能增加HepG2

细胞中的端粒酶活性

胞的端粒酶活性。可能的原因是hTＲ和hTEＲT在肝癌中表达量均很高，但是hTＲ的表达量更是高于hTEＲT，故即使hTＲ表达量增高但不增高hTEＲT的量，端粒酶活性还是会保持不变，并且这一结果与Wright 研究小组证实的端粒酶活性主要和hTEＲT

［22，23］

。的表达调控相关的结论相符

端粒酶ＲNA作为端粒酶逆转录酶逆转录的模

图10pCDNA 3．0-hTＲ过表达效果鉴定

板，在端粒酶相关疾病中扮演着极其重要的角色。编码端粒酶ＲNA的基因突变可导致一种常染色体，这表明

端粒的延伸障碍是导致此疾病的重要原因。除了先天性角化不良外，端粒酶ＲNA的突变也会导致以骨

［25］

髓衰竭为特点的再生障碍性贫血。目前越来越多的端粒酶ＲNA结合蛋白逐渐被发现，但我们对理解端粒酶功能的组织特异性调控方式也只是刚刚起［26］步，我们为了对这些调控方式进行进一步研究，hTＲ，构建了在真核细胞中全长表达的pCDNA3．0-并初步研究了一些相关功能，这对于我们深刻理解先天性角化不良疾病的发生以及寻求有效的治疗方法具有重要意义。

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ACA box of telomerase ＲNAcomponent gene （TEＲC）in a young patient with myelodysplastic syndrome ［J ］．BMC Med Genet ，2014，15（68）：1－8．

——先天性角化不良综合征显性遗传病—

［24］

3讨论

hTＲ与端粒酶复合体最基本的单位是hTEＲT、

角化不良蛋白。hTEＲT与hTＲ直接结合，是维持端

［8］粒酶活性所需的两个最基本的催化核心，而角化不良蛋白是一个能识别含有H /ACA模体ＲNA［此模体为hTＲ以及涉及ＲNA修饰的非编码ＲNA：小核

snoＲNA）与小卡哈尔小仁ＲNA（small nucleolar ＲNA，

scaＲNA）体相关ＲNA（small cajalbody associated ＲNA，

［9，10］

，共有］的ＲNA结合蛋白其与TEＲT的相互作

用为hTＲ所介导，角化不良蛋白的生物学功能主要

是与hTＲ结合维持hTＲ的稳定性以及促进端粒酶

12］

ＲNP的装配［11，。近年研究认为，端粒酶的3个主要成分中占主导作用的是hTEＲT，它的表达与端粒酶活性密切相关，而hTＲ的表达并不总与端粒酶活性一致，但hTＲ作为合成端粒DNA 的模板是组成

［13 16］

，弄清hTＲ和hTEＲT因此，端粒酶的必要成分

的表达调控与端粒酶活性间的关系对于了解肿瘤的

发生、发展以及延长细胞寿命等都具有重要意义

［17］

。

研究表明，在细胞中游离的hTＲ与hTEＲT的量

hTＲＲNP复合体，要多于hTEＲT-并且游离的hTＲ与hTEＲT装配成活性复合体是一个平衡的过程。

293T 或HeLa 细胞遵循L'Chatelier 原则（即化学平衡移动规律，较高的浓度及压力有利于化学平衡向

增加hTＲ或hTEＲT任何一个亚另一个方向移动），

hTＲＲNP的装配，基的量都会促进hTEＲT-这种原则

（下转第165页）

染病之一，主要通过患者的粪便经水传播。由于当地基础设施差，没有洁净的饮用水，患者的排泄物如未进行妥善处理，易引起痢疾的流行，中国工兵胃肠道疾病虽不全是痢疾病例，但仍不能掉以轻心。需配备水质纯化系统，加强饮用水的消毒，不喝生水，注意饮食卫生。疟疾是任务区最为严重的传染病，发病率居当地传染病之首

［3］

套和口罩。对派遣人员要加强教育，洁身自好，一定不要与当地人有性接触。中国二级医院对发热病例除疟疾能明确诊断外，对其他不明原因发热病例不能准确诊断，对其是否具有传染性也不得而知，只能对症治疗，应引起足够重视，要按照具有传染性进行诊治。

本研究表明，在西非执行维和与援助任务的工作人员不仅要加强对皮肤病和上呼吸道感染的防治，同时对不明原因发热、胃肠道疾病、疟疾应重点进行防控；该研究为今后驻利比里亚维和、医疗援助及商业活动的人员提供了基本的医学信息，对后续的医疗和疾病的防控、卫生资源的配置等具有一定的指导意义。【参考文献】

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J ］．白求恩军医学院学报，2011，9（1）：31－33．疾情况分析［

（孙承媛

编辑

2015－01－08

收稿）

玲，谭志胜，唐

斌，等．2012年下半年中国驻黎巴嫩维和

J ］．军事医学，2014，38（7）：565－二级医院门诊皮肤病例分析［

。当地的按蚊携带疟

原虫的比例可高达92%，而且当地疟疾患者中90%为恶性疟。5岁以下儿童的死亡50%是由疟疾引起的。利比里亚属热带季风气候，对蚊虫孳生繁殖有利。虽采取了一定的防治措施，但是蚊虫无孔不入。应加强和重视对疟疾的防治工作，部队驻地通过平整地面，除去杂草等方法尽可能消灭蚊虫的孳生地；宿舍应配备蚊帐、灭蝇灯、蚊香等物品；人员户外作业应着长袖衣裤，暴露部位涂抹驱虫剂，宿舍每周进行一次药物喷洒。

当地的流行病种类繁多，由于气候环境特点，不分季节，常年流行。任务区流行病除疟疾和痢疾外，还有性病、埃博拉病毒病、拉沙热、登革热、黄热病、百日咳、流行性脑脊髓膜炎及血吸虫病等，因此有必要进行针对性的预防接种工作。艾滋病在任务区蔓延迅猛，形势也非常严峻，利比里亚全国350万人口中有40万人携带艾滋病病毒，约占总人口的12%。医务人员在诊疗时应加强防范，接触患者一定要戴手

（上接第141页）

［7］Gardano L ，Holland L ，Oulton Ｒ，et al ．Native gel electrophore-sis of human telomerase distinguishes active complexes with or without dyskerin ［J ］．Nucleic Acids Ｒes，2012，40（5）：1－12．［8］Collins K．The biogenesis and regulation of telomerase holoen-zymes ［J ］．Nat ＲevMol Cell Biol ，2006，7（7）：484－494．［9］Matera AG ，Terns ＲM，Terns MP．Non-coding ＲNAs：lessons

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（孙承媛

编辑

2015－08－13

收稿）

人TＲ基因真核表达载体的构建

营孙阳，熊加秀，麦洪旭，林佳佳，姜丽娜，程

［摘要］目的

龙，叶棋浓

以人

构建人端粒酶ＲNA组分（hTＲ）的真核表达载体，并对其生物学功能进行初步检测。方法

胚肾293T 细胞ＲNA逆转录得到的cDNA 为模板，采用PCＲ技术扩增出hTＲ编码序列，将其插入到pCDNA 3．0载time quantitative PCＲ，qＲT-PCＲ）检测其表体中；将重组质粒与空载体分别转染293T 细胞，实时荧光定量PCＲ（real-PCＲ检测其效果，达情况，在HepG2细胞中构建此基因的稳定细胞系并用qＲT-通过ＲNA结合免疫共沉淀（ＲIP）实验验证其和人端粒酶逆转录酶（hTEＲT）及角化不良蛋白（dyskerin ）的相互作用，通过端粒酶重复序列扩增技术（telomerase repeat amplification protocol ，TＲAP）检测过表达hTＲ后HepG2细胞的端粒酶活性。结果

双酶切和测

pCDNA3．0-hTＲ的真核表达载体构建成功；转染293T 细胞用qＲT-PCＲ证明成功表达；qＲT-PCＲ证实序结果表明，

HepG2pCDNA3．0-hTＲ稳定细胞系筛选成功；ＲIP实验证实了hTＲ与hTEＲT和角化不良蛋白之间存在相互作用；TＲAP实验发现过表达hTＲ并不影响HepG2细胞的端粒酶活性。结论体，为进一步研究以针对hTＲ为靶标的癌症治疗奠定了基础。［关键词］端粒酶；hTＲ；基因克隆；真核表达［中图分类号］Q78

［文献标志码］A

DOI ：10．7644/j．issn．1674-9960．2016．02．015

［9960（2016）02-0137-06文章编号］1674-hTＲ真核表达载成功构建了pCDNA 3．0-

Construction of eukaryotic expression vector of human telomerase ＲNAcomponent

and its function

YING Sun-yang ，XIONG Jia-xiu ，MAI Hong-xu ，LIN Jia-jia ，JIANG Li-na ，CHENG Long *，YE Qi-nong *

（Institute of Biotechnology ，Academy of Military Medical Sciences ，Beijing 100850，China ）

*Co-corresponding authors ，YE Qi-nong ，Tel ：010-66931830，E-mail ：yeqn66@yahoo．com ；CHENG Long ，Tel ：010-66931830，E-mail ：flonic@163．com

［Abstract ］Objective To construct the eukaryotic expression vector of human telomerase ＲNAcomponent （hTＲ）and

hTＲGene was obtained by PCＲfrom cDNA template ，which was reverse

study its biological function tentatively．Methods

transcribed from 293T mＲNAand cloned into pCDNA3．0vector．The recombinant plasmid and empty vector were trans-fected into 293T cells ，and hTＲexpression was identified by qＲT-PCＲ．HepG2cells that stably transfected with pCDNA3．0-hTＲwere constructed and identified by qＲT-PCＲ．These cells were used to assess the interaction of hTＲwith human telomerase revese transcriptase （hTEＲT）and dyskerin．Telomerase activity was also detected in HepG2cells transfected with pCDNA3．0-hTＲ．Ｒesults

pCDNA3．0-hTＲeukaryotic expression vector was successfully constructed by

double digestion identification．The inserted fragment was confirmed by sequencing．The expression of hTＲin human 293T cells and HepG2pCDNA3．0-hTＲstable cell line was identified．In addition ，qＲT-PCＲand Western blotting results showed that hTＲcould interact with hTEＲTand dyskerin ，while hTＲoverexpression could not regulate the telomerase activity in HepG2cells．Conclusion

The eukaryotic expression vector of pCDNA3．0-hTＲis successfully constructed and

expressed．This study will contribute to the further study of cancer therapy targeting hTＲ．［Key words ］telomerase ；hTＲ；gene cloning ；eukaryotic expression

人端粒酶ＲNA组分（TEＲC）又名人端粒酶

［基金项目］国家自然科学基金资助项目（81330053）；北京市科技

新星计划资助项目（Z[**************]）［作者简介］营孙阳，E-mail ：男，硕士研究生，研究方向：遗传学，929661078@qq．com

［作者单位］军事医学科学院生物工程研究所，北京100850［Tel ：010-66931830，E-mail ：yeqn66@yahoo．com ；通讯作者］叶棋浓，

Tel ：010-66931830，E-mail ：flonic@163．com 程龙，

ＲNA（human telomerase ＲNA，hTＲ），定位于人染色

体3q26，具有1个外显子而无内含子，其基因转录coding ＲNA，ncＲNA）。端粒物为非编码ＲNA（non-酶是一个核糖核酸蛋白聚合酶，功能是添加端粒重复序列TTAGGG 到端粒末端而维持端粒长度，端粒酶的表达在细胞衰老过程中具有至关重要的作［1］

用。端粒酶全酶至少包含3个组分：人端粒酶逆

转录酶（human telomerase reverse transcriptase ，

hTEＲT）、hTＲ和角化不良蛋白（dyskerin ）。其中，端粒酶ＲNA组分是一个端粒酶的必要组分，其功能是作为端粒延伸的模板，其结构里含有一个H /ACA这个结构域对端粒酶的生物发生非常重结构域，要。除此之外，其他保守的ＲNA结构元件对端粒酶的定位、成熟和装配也具有重要作用。端粒酶ＲNA的突变会导致常染色体显性遗传病———先天性角化不良综合征

［4］

［3］

［2］

NCBI 网站查到的hTＲ的CDS 序列设计并合成引

CGGGATCCGGGTTGCGGAGGGT-物，上游引物：5'-GGGC-3' ，下游引物：5'-CGGA-ATTCGCATGTGT-GAGCCGAGTCCT-3' 。利用PCＲ扩增人TＲ编码序列，按以下条件用pfu 酶进行片段的扩增：95ħ 预变

95ħ 变性30s ，58ħ 退火30s ，72ħ 延伸性5min ，

45s ，72ħ 7min 再进行延长，共进行35个循环，最

后用胶回收试剂盒回收PCＲ产物。用Bam H Ⅰ和Eco ＲⅠ双酶切pCDNA 3．0载体，10g /L琼脂糖凝胶电泳后，胶回收载体大片段；将PCＲ片段回收后再用Bam H Ⅰ和Eco ＲⅠ酶切，形成带有黏端的双链，用T4DNA 连接酶连接入pCDNA 3．0载体中。转化大肠杆菌DH5α，挑选克隆，摇菌并提质粒，用Bam H Ⅰ和Eco ＲⅠ双酶切鉴定。酶切鉴定正确的克隆送北京奥科生物公司测序。1．4哺乳动物细胞转染

按照VigoFect 说明书操作方法进行转染，用普通DMEM 培养基将293T 细胞接种于35mm 皿中，接种量以转染时细胞密度达到60% 70%为宜，培养24h 后进行转染，转染前1h 换液。将2μl Vigo-Fect 与100μl NaCl 混合，再将总量为5μg 的重组质粒与100μl NaCl 混合，将二者温和混匀，室温静置15min ，混匀加入35mm 皿中，以此法转染空载4 6h 37ħ 、50ml /LCO 2常规培养，体作为对照，后换液。1．5

IP ）免疫共沉淀（immunoprecipitation ，

1ml PBS 洗，倒培养基，再用1ml PBS 刮细胞

2000r /min离心10min ，并收获细胞，吹匀，吸干

。近期研究表明，端粒酶ＲNA

的功能以及端粒酶的发生对于理解端粒酶相关疾病

［5］

具有重要意义。

本实验拟构建hTＲ的真核表达载体，并验证其与hTEＲT、角化不良蛋白的相互作用，以及测定过表达hTＲ后在HepG2细胞中的端粒酶活性，为进一

［6］

步研究端粒酶与相关基因的功能奠定基础。11．1

材料与方法材料

人胚肾293T 细胞为本室保存并传代培养，pCDNA 3．0载体为本室保存；VigoFect （威格拉斯生DNA 连接酶、物技术有限公司）；限制性内切酶、

PCＲ试剂（均TaKaＲa公司）；质粒提取、胶回收、PCＲ回收试剂盒（Promega 公司）；DMEM 及小牛血清（均Gibco 公司）；ＲNA酶抑制剂（赛百盛公司，浓度为40U /μl ）；BM 2000为最大2000bp 的DNA 标志物（Biomed 公司）；TＲAP-PCＲ试剂盒（Millipore 公司）。

测序由北京奥科生物技术有限责任公司完成。1．2

总ＲNA提取、逆转录

1．2．1ＲNA提取293T 细胞培养于6cm 皿中，待1ˑ PBS 洗，1ml TＲIzol融合度达100%时弃培养基，溶液吹下细胞，加0．2ml 氯仿提取蛋白混匀，室温放置10min 。4ħ 12000r /min离心10min ，小心取上清液0．4ml ，加等量异丙醇混匀，－20ħ 冷冻10min 。4ħ 12000r /min离心10min ，1弃上清，ml 75%乙醇（DEPC 水稀释）洗1次，4ħ 12000r /min 离心5min 后弃上清，无水乙醇洗1次，高速离心后去上清，自然干燥ＲNA约30min ，加入20μl DEPC 水溶解沉淀，即为提取的总ＲNA。1．2．2

取总ＲNA2μg ，与1μl 50μmol /L

70ħ 解链5min ，的随机引物混匀，补水至15．9μl ，

逆转录

PBS ，加入IP 低盐缓冲液300 500μl 作为裂解液

（裂解液里按DTTʒ 蛋白酶抑制剂ʒ 裂解液=1ʒ 1ʒ 1000补充加入DTT 和蛋白酶抑制剂），尽量保证细胞量相同，冰浴30min 。平衡磁珠，用IP 裂解液500μl ，4ħ 离心，3000r /min离心2min ，重复3次；超声2s 停2s ，每次探头放入液体液面下1/3处即可，不碰管壁，超声4次，超声前探头需冰浴；4ħ 离

12000r /min，15min 。将上清仔细吸出加入新心，

的EP 管中，切勿触动沉淀，同时吸出磁珠上清。将EP 管中的上清吸出30μl 至另外新的EP 管中，加入30μl SDS ，留作对照，－70ħ 保存，待IP 完成后蛋白印迹检测。用作IP 的EP 管中，加入磁珠，每管约30μl 磁珠，先用与磁珠等量IP 裂解液加入磁珠中稀释，吹吸。然后将混合液均分加入EP 管中。4h 至过夜。4ħ ，3000r /将IP 加入展示柜中摇匀，min ，离心2min ，冰上1min ，静置下沉；吸干上清不要吸到磁珠，尽量吸净。700μl IP 裂解液洗3次，4ħ 3000r /min离心2min ，冰上操作，振荡，每洗1

dNTP 、ＲNA酶抑制自然冷却至室温，加入逆转录酶、

42ħ 剂及逆转录缓冲液，剩余补水至终体积25μl ，95ħ 灭活5min ，得到逆转录的cDNA 第反应1h ，

一链。将得到的cDNA 按1ʒ 20稀释。1．3

pCDNA 3．0-hTＲ重组质粒的构建与测序以1．2步骤中所提取的cDNA 为模板，根据

次，在展示柜中摇10min ，离心。重复上一步。去上

清IP 裂解液，剩余磁珠进行后续实验。1．6

Western 印迹检测

质粒转染293T 细胞24h 后收集细胞蛋白，加入2ˑ SDS 加样缓冲液，煮沸10min ，高速离心2min

PAGE 后，取上清液进行SDS-电转移至硝酸纤维素膜上；用5%脱脂奶粉于4ħ 封闭过夜，加入用5%

脱脂奶粉以1ʒ 5000稀释且HＲP标记的抗IP 标签TBST 洗膜3次，鼠单克隆抗体，室温轻摇1h ，每次

5min ；用化学发光法显色5min ，压片显影。1．7

ＲNA结合免疫共沉淀（ＲNAbinding protein

immunoprecipitation ，ＲIP）

22．1

结果

pCDNA 3．0-hTＲ重组质粒的构建与鉴定

以所提取293T 细胞的ＲNA逆转录得到的cDNA

PCＲ扩增人hTＲ的序列，58ħ 、为模板，选取55ħ 、61ħ 、63ħ4 个退火温度扩增目的片段。结果显示，4

个退火温度均能扩增出加上酶切位点大小约467bp 的片段，与估计的片段相一致（图1）。用Bam H Ⅰ和Eco ＲⅠ酶切后的hTＲ片段和pCDNA 3．0载体连接，转化DH5α感受态，选取部分菌落进行菌液PCＲ鉴定，得到与预期大小相一致的条带，初步确定此条带为阳性重组子（图2）。将此阳性克隆提取质粒后进行酶切鉴定，得到两条长度分别约5000和500bp 的条带，空载体用同样的酶酶切后只见一条约5000bp 的条带，与预期相一致（图3）。DNA 测序结果表明，构建的质粒在MCS 插入的基因大小与NCBI 查到的hTＲ编码序列一致（测序结果略）

。

将所有试剂用DEPC 水配置，实验用器械、枪头等用DEPC 处理水处理并高压灭菌。在IP 低盐裂解液中加入终浓度为300U /ml的ＲNA酶抑制剂、1mmol /LDTT ，与1/1000的蛋白酶抑制剂。按IP 步骤裂解细胞后，取10%的裂解液作为提取ＲNA的对照，并取少量裂解液作为Western 印迹的对照，继续至IP 实验结束后，将洗脱的磁珠取一部分与Western 印迹对照一起作Western 印迹检测IP 效果，并将剩余的磁珠与10%的ＲNA对照用TＲIzol试剂盒共同提取ＲNA、逆转录，最终使用实时定量荧光PCＲ（real time quantity PCＲ，qＲT-PCＲ）检测蛋白与ＲNA结合情况。1．8

端粒酶重复序列扩增技术（telomerase repeat amplification protocol ，TＲAP）-PCＲ

图1

PCＲ

产物

PCＲ扩增得到的hTＲ序列

细胞提前24h 接种至6孔板，转染相应质粒，4h 后换液，24h 后胰酶消化细胞，离心沉淀后，用PBS 洗1次，4ħ 2000r /min离心5min ，仔细去除所有PBS 。然后将细胞冻存在－75 －80ħ 条件下，冻存细胞端粒酶可稳定保存至少1年时间。若要继续实验或细胞冻融后，须将细胞立刻重悬在200μl 1ˑ CHAPS lysis 裂解液中（105 106个细胞）。将此混合物冰浴至少30min 。4ħ 12000r /min离心20min 。取出160μl 上清于新的EP 管中，用Broadford 法测定蛋白浓度后进行PCＲ操作，蛋白最终使用量为20ng 。PCＲ体系为：10ˑ TＲAP反应液5．0μl ；50ˑ dNTP 混合物1．0ml ；TS 引物1．0μl ；TＲAP引物混合物1．0μl ；Taq 聚合酶（5U /μl ）0．4μl （2U ）；dH 2O 39．1μl ；ＲNase抑制剂0．5μl ；蛋白10ng /μl 加入2μl ；总体系共50μl 。PCＲ程序为：30ħ 30min ，94ħ 3min ，94ħ 30s ，59ħ 30s ，72ħ 1min ，72ħ 7min ，4ħ 2h 。将所得进行30个循环，

PCＲ产物利用0．5ˑ TBE 配置10%PAGE 胶进行垂直电泳，样品上样使用5ˑ 预染DNA 上样缓冲液，电泳后利用凝胶成像仪拍照。

M．BM 2000；1 4．退火温度分别为55ħ 、58ħ 、61ħ 和63ħ 的

图2hTＲ的菌液PCＲ结果电泳图谱重组质粒pCDNA 3．0-

M．BM 2000；1 5．pCDNA 3．0-hTＲ的1 5号克隆的菌液PCＲ结果；6．阳性对照（以293T 提取的ＲNA逆转录得到的cDNA 为模板扩增的阳性对照）；7．阴性对照（模板为氨苄青霉素抗性的LB 培养基）

2．2qＲT-PCＲ法检测pCDNA 3．0-hTＲ表达效果

hTＲ重组质粒和空将成功构建的pCDNA 3．0-48h 后收集细胞提取载体分别转染HEK 293T 细胞，ＲNA并逆转录，PCＲ检测hTＲ的表达情最后通过qＲT-GGTGGT-况，定量PCＲ引物选用上游引物（sense ）：5'-GGCCATTTTTTGTC-3' ，CTA-下游引物（antisense ）：5'-GAATGAACG-GTGGAAGGC-3' ［7］。结果表明，转染重

图3hTＲ的Eco ＲⅠ/Bam H Ⅰ的双酶重组质粒pCDNA 3．0-切电泳

图6过表达hTＲ不改变内源性hTEＲT与角化不良蛋白的表达

M．BM2000DNA 相对分子质量标志物；－．空载体pCDNA 3．0；1．重组质粒pCDNA 3．0-hTＲ酶切

2．5ＲIP实验验证hTＲ与hTEＲT和角化不良蛋白的结合

hTＲ与转染空载体相比组质粒后，转pCDNA 3．0-hTＲ的相对量约升高了500倍（图4）。这说明较，

hTＲ真核表达载体能在293T 细胞中正确转录

。

hTＲ与hTEＲT和为检测所构建的pCDNA 3．0-角化不良蛋白是否存在相互作用，在HepG2pCDNA 3．0-hTＲ稳定细胞系分别转染Flag 、Flag-角化不良

hTEＲT，48h 后收集细胞进行ＲIP实蛋白和Flag-Flag-hTEＲT的表达效果及验，角化不良蛋白和Flag-IP 效果用Flag-HＲP抗体检测，hTＲ用qＲT-PCＲ检hTＲ能与hTEＲT以及角化不良蛋白测，结果显示，8）

。结合（图7，

图4qＲT-PCＲ检测重组质粒的转录效果

2．3pCDNA 3．0-hTＲ稳定细胞系构建

在HepG2细胞中利用VigoFect 转染试剂分别

hTＲ，转染pCDNA 3．0和pCDNA 3．0-转染48h 后，加入浓度为500μg /mlG418，筛选1个月，筛选完成

PCＲ检测稳定细胞系的效果，后利用qＲT-结果显示所筛选的细胞系能稳定表达hTＲ（图5）

。

图7

ＲIP实验中蛋白的表达效果及IP

效果鉴定

图5hTＲ稳定细胞系的鉴定HepG2过表达pCDNA 3．0-

图8hTＲ可与角化不良蛋白以及hTEＲT结合

2．4过表达hTＲ不改变内源性hTEＲT与角化不良

2．6

蛋白的表达

利用2．3中构建的HepG2稳定转染pCDNA 3．0-hTＲ的细胞系，检测过表达hTＲ对内源性hTEＲT与角化不良蛋白的影响，继而通过Western 印迹发现过表达hTＲ后hTEＲT与角化不良蛋白的内

actin 为内参对照（图6）

。源表达量并未发生改变，

过表达hTＲ不改变HepG2细胞的端粒酶活性

在HepG2细胞内过表达空载体和pCDNA 3．0-

hTＲ，24h 后收取细胞，测量蛋白浓度，在体系中终

PCＲ实验检测细胞浓度为20ng 的蛋白利用TＲAP-内的端粒酶活性。结果显示，过表达hTＲ并不能增

10）。加端粒酶活性（图9，

表明了hTＲ和hTEＲT任何一方的量都是端粒酶装

配的限制因素。但是，在另一些细胞，如白细胞中，

［18 21］

，过表达hTＲ则不能增加端粒酶活性究其原

因可能是hTＲ基因的表达在数量和空间效应上同

细胞内的端粒酶ＲNA组分产生竞争，一定程度上也阻碍了端粒酶ＲNA模板区与端粒DNA 的结合。本研究在肝癌HepG2细胞中过表达hTＲ，探讨hTＲ基因在HepG2细胞中所起的作用，结果表明，虽然hTＲ的表达量增加，但是肝癌细胞的端粒酶活性并没有增加，说明hTＲ过表达并不能提高肝癌细

图9

过表达hTＲ并不能增加HepG2

细胞中的端粒酶活性

胞的端粒酶活性。可能的原因是hTＲ和hTEＲT在肝癌中表达量均很高，但是hTＲ的表达量更是高于hTEＲT，故即使hTＲ表达量增高但不增高hTEＲT的量，端粒酶活性还是会保持不变，并且这一结果与Wright 研究小组证实的端粒酶活性主要和hTEＲT

［22，23］

。的表达调控相关的结论相符

端粒酶ＲNA作为端粒酶逆转录酶逆转录的模

图10pCDNA 3．0-hTＲ过表达效果鉴定

板，在端粒酶相关疾病中扮演着极其重要的角色。编码端粒酶ＲNA的基因突变可导致一种常染色体，这表明

端粒的延伸障碍是导致此疾病的重要原因。除了先天性角化不良外，端粒酶ＲNA的突变也会导致以骨

［25］

髓衰竭为特点的再生障碍性贫血。目前越来越多的端粒酶ＲNA结合蛋白逐渐被发现，但我们对理解端粒酶功能的组织特异性调控方式也只是刚刚起［26］步，我们为了对这些调控方式进行进一步研究，hTＲ，构建了在真核细胞中全长表达的pCDNA3．0-并初步研究了一些相关功能，这对于我们深刻理解先天性角化不良疾病的发生以及寻求有效的治疗方法具有重要意义。

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——先天性角化不良综合征显性遗传病—

［24］

3讨论

hTＲ与端粒酶复合体最基本的单位是hTEＲT、

角化不良蛋白。hTEＲT与hTＲ直接结合，是维持端

［8］粒酶活性所需的两个最基本的催化核心，而角化不良蛋白是一个能识别含有H /ACA模体ＲNA［此模体为hTＲ以及涉及ＲNA修饰的非编码ＲNA：小核

snoＲNA）与小卡哈尔小仁ＲNA（small nucleolar ＲNA，

scaＲNA）体相关ＲNA（small cajalbody associated ＲNA，

［9，10］

，共有］的ＲNA结合蛋白其与TEＲT的相互作

用为hTＲ所介导，角化不良蛋白的生物学功能主要

是与hTＲ结合维持hTＲ的稳定性以及促进端粒酶

12］

ＲNP的装配［11，。近年研究认为，端粒酶的3个主要成分中占主导作用的是hTEＲT，它的表达与端粒酶活性密切相关，而hTＲ的表达并不总与端粒酶活性一致，但hTＲ作为合成端粒DNA 的模板是组成

［13 16］

，弄清hTＲ和hTEＲT因此，端粒酶的必要成分

的表达调控与端粒酶活性间的关系对于了解肿瘤的

发生、发展以及延长细胞寿命等都具有重要意义

［17］

。

研究表明，在细胞中游离的hTＲ与hTEＲT的量

hTＲＲNP复合体，要多于hTEＲT-并且游离的hTＲ与hTEＲT装配成活性复合体是一个平衡的过程。

293T 或HeLa 细胞遵循L'Chatelier 原则（即化学平衡移动规律，较高的浓度及压力有利于化学平衡向

增加hTＲ或hTEＲT任何一个亚另一个方向移动），

hTＲＲNP的装配，基的量都会促进hTEＲT-这种原则

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染病之一，主要通过患者的粪便经水传播。由于当地基础设施差，没有洁净的饮用水，患者的排泄物如未进行妥善处理，易引起痢疾的流行，中国工兵胃肠道疾病虽不全是痢疾病例，但仍不能掉以轻心。需配备水质纯化系统，加强饮用水的消毒，不喝生水，注意饮食卫生。疟疾是任务区最为严重的传染病，发病率居当地传染病之首

［3］

套和口罩。对派遣人员要加强教育，洁身自好，一定不要与当地人有性接触。中国二级医院对发热病例除疟疾能明确诊断外，对其他不明原因发热病例不能准确诊断，对其是否具有传染性也不得而知，只能对症治疗，应引起足够重视，要按照具有传染性进行诊治。

本研究表明，在西非执行维和与援助任务的工作人员不仅要加强对皮肤病和上呼吸道感染的防治，同时对不明原因发热、胃肠道疾病、疟疾应重点进行防控；该研究为今后驻利比里亚维和、医疗援助及商业活动的人员提供了基本的医学信息，对后续的医疗和疾病的防控、卫生资源的配置等具有一定的指导意义。【参考文献】

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（孙承媛

编辑

2015－01－08

收稿）

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。当地的按蚊携带疟

原虫的比例可高达92%，而且当地疟疾患者中90%为恶性疟。5岁以下儿童的死亡50%是由疟疾引起的。利比里亚属热带季风气候，对蚊虫孳生繁殖有利。虽采取了一定的防治措施，但是蚊虫无孔不入。应加强和重视对疟疾的防治工作，部队驻地通过平整地面，除去杂草等方法尽可能消灭蚊虫的孳生地；宿舍应配备蚊帐、灭蝇灯、蚊香等物品；人员户外作业应着长袖衣裤，暴露部位涂抹驱虫剂，宿舍每周进行一次药物喷洒。

当地的流行病种类繁多，由于气候环境特点，不分季节，常年流行。任务区流行病除疟疾和痢疾外，还有性病、埃博拉病毒病、拉沙热、登革热、黄热病、百日咳、流行性脑脊髓膜炎及血吸虫病等，因此有必要进行针对性的预防接种工作。艾滋病在任务区蔓延迅猛，形势也非常严峻，利比里亚全国350万人口中有40万人携带艾滋病病毒，约占总人口的12%。医务人员在诊疗时应加强防范，接触患者一定要戴手

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（孙承媛

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2015－08－13

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