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中国生化药物杂志Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics 2011年第32卷第5期
常用病毒载体的基础研究及临床应用
潘志敏，马
勇，程细高
（南昌大学第一附属医院，江西南昌330006）
摘
要：分子生物学的发展已引领现代医学进入分子医学时代，其中病毒载体的研制成功从根本上推动了基
腺病毒载体、慢病毒载体、腺相关病毒载体近年的基础研究、临床应因治疗的发展。本文浅析了逆转录病毒载体、
用及前景。随着载体学研究的深入，病毒载体的应用范畴将不断拓展。
关键词：病毒载体；基因治疗；结构；功能中图分类号：R944．9
文献标识码：A
1678（2011）05-0408-04文章编号：1005-
Viral vectors used for basic research and clinical application
PAN Zhi-min ，MA Yong ，CHENG Xi-gao
（The No．1Affiliated Hospital of Nanchang University ，Nanchang 330006，China ）
基因治疗是指能将外源基因导入靶细胞并有效表达从低毒、靶向性而实现治疗疾病的一种疗法。如何选择高效、
强的载体，以协助目的基因进入靶细胞并正确表达，是基因治疗过程中必须解决的问题两类
［3］
［1-2］
合，从而引导病毒趋向特异性靶细胞。为提高Rv 载体的转染率，也有人提出多次重复感染，用水泡性口炎病毒包膜G 蛋白替代原病毒蛋白包装Rv 。1．3
Rv 载体的应用
以Rv 为载体的基因转移技术在基因治疗、外源基因表达和RNA 干扰等方面均有广泛应用。世界上第一例基因治疗病例就是应用Rv 携正常的腺苷脱氨酶（ADA ）基因成功治愈了ADA 缺乏症患者。随后英国奥蒙德大街医院也运用Rv 作为治疗载体根治了一名患X 染色体连锁重症免疫缺陷病儿童。
王韫芳等
［6］
，也是基因治疗研究领域的
核心技术之一。基因载体主要分为病毒载体和非病毒载体
。病毒载体具备传送其携带的基因组进入其他细胞
［4］
并进行感染的分子机制，包括逆转录病毒（Retrovirus ，
Rv ）、Lv ）、腺病毒（Adenovirus ）、慢病毒（Lentivirus ，腺相关病AAV ）及杆状病毒（Baculovirus ）等。毒（Adeno associated virus ，11．1
Rv 载体
Rv 及其载体的结构
Rv 在逆转录酶的作用下能将RNA 转变成cDNA 的单链RNA 。其产物cDNA 可进入细胞核并整合在染色体中随宿主细胞的增殖而转录翻译。Rv 的RNA 基因组核心部分PoL-含三个开放读码区：gag-编码病毒核心蛋白，编码逆转录
［5］
env-酶，编码病毒被膜蛋白。利用这些结构可将Rv 设计
利用复制缺陷型Rv 和pMSCVneo 成功构建
［7］
HGF 。为进一步应用HGF 基因进行干细胞工程、了pMSCV-组织工程的研究奠定了基础。还有顾红祥等
将凋亡素基
构建出重组Rv 凋亡素载体，用其感染因（VP3）与Rv 连接，
人肝癌细胞系HepG 。发现它可在四环素调控下表达VP3并诱导HepG2凋亡。此理论为肿瘤的可控性基因治疗提供了依据。此外Rv 载体在治疗艾滋病等方面同样具备巨大的应用潜力。22．1
腺病毒载体腺病毒的结构
腺病毒是无包膜的线状双链DNA 病毒，由壳粒呈二十面体排列构成。衣壳内的五联体及纤毛顶端形成的头节区能与细胞表面的病毒受体结合。腺病毒基因组中的蛋白VI 与病毒衣壳连接在一起，在两条链的5' 端各结合DNA 蛋白其与腺病毒复制密切相关。基因组编码区分为复合物结构，
早期基因区和晚期基因区，前者主要编码病毒的调节蛋白，后者编码病毒的结构蛋白。第三代腺病毒载体去除了所有只保留了5' 和3' 末端反向末端重复序列及包装信编码基因，
kb 2．［8］
［9-10］
、神经系统疾病
成一种复制缺陷性病毒，使其能携带某些目的基因。1．2
Rv 载体的优缺点及改良
Rv 载体的优点有：（1）宿主范围广，对细胞感染率可高达100%；（2）能持久表达目的基因；（3）有强启动子，能高效稳定表达外源基因；（4）感染细胞不产生病变。Rv 载体也有不足：（1）只能整合至分裂期细胞；（2）插入诱变，引起机体免疫反应；（3）双嗜性Rv 载体也不能解决感染特异性靶细胞问题。针对这些问题，研究者们不断寻找解决方案：Roux 等曾提出用双特异性分子桥来解决感染特异性靶细胞问题。此分子桥既可与病毒颗粒结合，也可与特异细胞表面受体结
06-02收稿日期：2011-基金项目：国家自然科学基金（81060147）
：onpum@sina．com 。
中国生化药物杂志Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics 2011年第32卷第5期
腺病毒载体不整合入宿主细胞染色体，插入诱变的潜在还可感染分裂期和静止期细胞，且能高效表达风险比Lv 小，
其基因产物。其缺点是难以持续表达，还可能诱发宿主体内细胞免疫和体液免疫反应而导致组织损伤和转基因表达
［11］
409
ITR ）是复制、整合和包装所必需的顺式作用元件，具有转录启动子活性。基因组中Rep 蛋白与位点特异性整合相关。cap 基因编码的3种衣壳蛋白与感染性病毒颗粒相关。重组AAV 载体即由野生型AAV 以目的基因取代病毒编码序列（rep 和cap ）构建而成。4．2
AAV 的优缺点
AAV 系统免疫原性低，能转染分裂期和非分裂期细胞，有整合到特殊位置的潜能。其广泛的趋向性，能完成多种器官的有效转导
［18］
。对此人们研制出删除了所有编码区基因的辅助依赖
型腺病毒载体，其免疫原性、炎性反应和细胞毒性均明显降低。2．3
腺病毒载体的应用
腺病毒载体宿主范围广，包装容量大，安全性好。因腺病毒能高效转染多种细胞所以常作为基因转移的载体
［2］
。然而重组AAV 载体的包装容量不足仍
。是限制其应用的一个主要因素。不过有专家指出解决之道：共表达多基因的几种策略中，合编入核糖体内部进位点是扩容更为有效的策略4．3
［19-20］
在基因治疗和疫苗载体等方面获得广泛应用：孙士敏等
［12］
以脂质体为介导将AdMax 腺病毒包装系统的骨架质粒pB-3Cre 和穿梭质粒pDC316-NS5B 共转染293细胞HGIoxAEl 、
NS5B 。成功构建了表进行同源重组产生了重组腺病毒pAd-达HCV NS5B 基因的重组腺病毒载体，为进一步探索HCV 基因免疫和治疗做了铺垫。
Takeshi 等［13］构建的腺病毒载体包含RNA 聚合酶-Ⅰ依赖的表达盒和四环素调控系统。依据四环素应答元件和RNA 聚合酶-Ⅰ启动子制备了杂合启动子，后者能促进HCV 复制子进行扩增。可作为HCV 复制的一个评估系统。33．1
Lv 载体Lv 的结构
Lv 属逆转录病毒科，I 为基础构建。Lv 其载体以HIV-vpr 、nef 和vpu 及2个调节基因载体还有4个辅助基因vif 、
Tat 和rev 。其宿主范围比Rv 更广，对难转细胞其基因转染率也较高。3．2
Lv 载体的构建
Lv 载体构建的关键是将HIV-I 基因组中的顺式作用元件和编码反式作用蛋白序列进行分离
［14］
。
AAV 载体的应用
人群中AAV 感染率很高但尚未发现该病毒是疾病的致
［21］
病因素。Gorbatyuk 等于P23H 基因突变鼠的视网膜下注
12周后检测到视网射携带核酶Rz525的重组AAV2/5载体，
膜电图a 波和b 波的振幅。视网膜结构分析也表明基因转移能阻止视网膜外核层的变性。此外，重组AAV 也是很有潜力的提高某些骨科疾病疗效的基因转移工具等等
［23］［2］
［22］
。Larsen
成功应用重组AAV 载体转染骨髓基质细胞。Zhang
利用重组AAV 携带血管内皮因子和骨形态发生蛋白基
因共转染至兔骨髓间充质干细胞获得高表达，并且体内试验证实八周后能促使缺血患肢明显成骨。FDA 也证实一系列临床实验表明AAV2在治疗某些人类疾病有效，包括炎症性关节炎、癫痫、血友病B 和肌营养不良等55．1
。包装成分与载体
杆状病毒杆状病毒的结构
杆状病毒是有囊膜的双链环状DNA 病毒，基因组大小为80 180kb 。其结构特征是病毒粒子包埋于蛋白质基质的包涵体内。病毒粒子形态分两种：其一为出芽型病毒粒子，介导细胞与细胞间的感染；其二是包埋型病毒粒子，入侵肠上皮细胞。病毒DNA 分子以超螺旋存在于杆状核衣壳中。核衣壳又包括衣壳蛋白和髓核：前者是杆状病毒粒子结后者含病毒DNA 和碱性蛋白。构蛋白，5．2
杆状病毒的改良
杆状病毒可被血清中的补体成分灭活，抑制了其转导效率。很多人正在探索改良之道：通过对其进行伪型杆状病毒修饰，可抵抗补体的灭活作用，或在杆状病毒多角体基因和重组载体上置入loxP 位点也能提高转导效率。据λ噬菌体位点特异重组原理
［25］
［24］
。
I 顺式作用序列。包装成分可分别成分均含逆转录和HIV-构建在两质粒上：其一表达gag 和pol ，另一个表达env 。3．3
Lv 载体的优点及应用
Lv 载体以其高效、稳定的基因转移效率成为研究者的新宠。其优点是：（1）对分裂期和非分裂期细胞均能感染；（2）可整合入宿主细胞染色体实现长期而稳定的表达；（3）可兼容多个转录启动子
［15］
。
Lv 载体为AIDS 的基因治疗带来了福音，在其他系统疾Nyhan 综合征因编码次黄嘌病的治疗中也显现希望：Lesch-呤核糖转移酶（HPRT ）的基因缺陷而引起遗传代谢性脑病。若能将携带HPRT 基因的Lv 注入体内神经元，很可能对此病产生良好疗效。又如用Lv 将多药耐药基因导入造血干细胞可使其耐受较大剂量化疗，对治疗白血病及其它恶性肿瘤的疗效有促进作用44．1
AAV
AAV 的结构
AAV 是无被膜的线状单链DNA 病毒。现已分离出11［17］
［16］
，将attR 位点置入杆状病毒基因组可
TM TM TM
获得BaculoDirect 线性DNA 。在含Gateway LR Clonase
酶的情况下，此基因组与外源基因重组后得到的系统速度快、效率高。5．3
杆状病毒优点及应用
杆状病毒载体具有多项优势：（1）基因组载量大，可达38kb 。可同时表达多基因，甚至携带整个病毒基因组；（2）；（3）真核表达。
基因组所含的末端倒转重复序列（inverted terminal repeat ，
410
表达。
中国生化药物杂志Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics 2011年第32卷第5期
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杆状病毒表达载体现已成为基因工程四大表达系统之一
［26］
。并且很快被用于医学领域：（1）单抗研制。以杆状病
得到单克隆抗体。不用纯毒的颗粒表面病原体为抗原蛋白，
化抗原就能直接免疫动物；（2）新型疫苗研制。将外源蛋白与杆状病毒的囊膜蛋白融合，可作为疫苗诱导动物产生保护性免疫。Xu 等
［27］
将猪瘟病毒E2糖蛋白与gp64蛋白融合
发现能够诱导其产生E2中和性抗体；之后用其免疫小鼠，
（3）可作为哺乳动物的基因转移载体。Kim 等［28］发现杆状病毒携带端粒逆转录酶能抑制小鼠神经胶质瘤的生长。刘正山等
［29］
用重组杆状病毒（BacVCMV-EGFP ）对小鼠、猪、
EGFP 对恒恒河猴及人的BMSCs 进行转导，发现BacVCMV-河猴及人的BMSCs 转导率明显高于前两者。表明重组杆状病毒可作为灵长类动物BMSCs 基因修饰的理想载体。6
展
望
病毒载体的应用促进了很多领域的科研工作及临床治疗，其优势有利用病毒天然的感染性进入细胞，转导效率高；复杂的装配过程由细胞完成；不同病毒载体有不同表达特点。其缺点包括病毒应用的安全性（细胞毒性、染色体毒性、免疫毒性等）、基因转移中的靶向性（转导靶向性、转录靶向基因表达水平、持性等）以及基因转移的有效性（转导效率、续时间及表达的可调控性等）等问题。
Rv 载体用于体内治疗时仍存在安全性及基因在宿主细胞中的调控等问题。如何提高病毒的感染效力并稳定表达目的基因是今后研究逆转录载体的一大内容；第三代腺病毒载体已广泛用于多种动物实验模型，但临床应用进展较缓。其中AdF35是改进的了腺病毒亚型，因它能感染某些特殊细胞而日益受关注
［30］
；找出对靶细胞有亲嗜性的重组AAV
血清型，设计出组织特异性启动子来提高重组AAV 载体的转染率和安全性可为基因治疗带来新希望；重组获得可调控靶向性强的Lv 载体是今后应用的方向；杆状外源基因表达、
病毒在研制非复制型基因治疗载体及疫苗方面极具应用前景。今后将从提高转染效率和表达水平及减少宿主对杆状病毒的灭活作用等方面增强其在体内存活力和稳定性。随着高效、安全的基因传递体系不断被改良和研发，基因治疗必将得到更广泛的应用。参考文献：
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411
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仙人掌多糖研究进展与开发利用前景
1，21，22
曾富华，赵龙岩，饶力群
（1．湛江师范学院生命科学与技术学院，广东湛江524048；2．湖南农业大学生物科学技术学院，
湖南长沙410128）
摘
要：仙人掌多糖（OP ）具有调节免疫、抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老、促伤口愈合等生物学活
性。本文综述了OP 的提取、分离纯化、结构及生物学活性的国内外研究进展和OP 的应用现状，总结了OP 研究过程中存在的一些问题，为OP 的研究提供参考。
关键词：仙人掌；多糖；结构；生物学活性；开发利用中图分类号：R284．2；R285
文献标识码：A
1678（2011）05-0411-04文章编号：1005-
Progress and prospect of study and utilization of Opuntia polysaccharides
22
ZENG Fu-hua 1，，ZHAO Long-yan 1，，RAO Li-qun 2
（1．School of Life Science and Technology ，Zhanjiang Normal University ，Zhanjiang 524048，China ；2．School of Biological Science and Technology ，Hunan Agricultural University ，Changsha 410128，China ）
仙人掌可分为食用和药用两类，喜干热和光照，原产于南北美洲热带、亚热带干旱地区，现世界温带地区均有分布，尤以墨西哥分布的种类和数量最多，常作为营养食物广泛栽培
［1-2］
polysaccharides ，OP ）是仙人掌重要有效成分之一。本文就OP 的提取、分离纯化、结构及生物学活性等方面的研究动态以期为OP 的研究与开发利用提供参考。进行综述，11．1
OP 的制备仙人掌的预处理
仙人掌的预处理包括采集、挖刺、去皮、洗涤、切碎、匀去脂类物质、烘干、粉碎、过筛等。采摘时，一般都是在下浆、
茎片的嫩度、季节、采摘时间午采集生长15 40d 的嫩片，等因素都会影响仙人掌的化学成分
［1］
。我国仙人掌资源相当丰富，主要分布在南方大部分
北方亦可大棚栽培。据报道，仙人掌属植物主要化学省市，
氨基酸、维生素、脂肪酸、牛磺酸、黄酮类化合成分为多糖、
物、类胡萝卜素、有机酸、仙人掌醇、胡萝卜苷、对羟基苯甲酸、仙人掌苷、酚类物质以及多种矿物质元素等，具有抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老、促伤口愈合、护肝、提高免疫力等功效，极具开发前景
［3-6］
，因此，要根据用途选
。仙人掌多糖（Opuntia
择采摘条件。OP 提取前一般都是先挖刺去皮以去掉大部分有机酸和一些毒性物质，再洗涤、切碎、匀浆，的黄酮类物质、
用乙醇等有机溶剂浸泡去除脂溶性物质。不同粉碎粒度对多糖提取效果及产率有很大影响，以40 60目为佳。1．2
OP 的提取
、、。过酸、OP 的结构。热水提
06-09收稿日期：2010-基金项目：广东省自然科学基金（No．[**************]1）；广东省教育厅基金（No．Z03062）
，E-mail ：zengfuhua@gmail．com 。物的开发与利用，
408
中国生化药物杂志Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics 2011年第32卷第5期
常用病毒载体的基础研究及临床应用
潘志敏，马
勇，程细高
（南昌大学第一附属医院，江西南昌330006）
摘
要：分子生物学的发展已引领现代医学进入分子医学时代，其中病毒载体的研制成功从根本上推动了基
腺病毒载体、慢病毒载体、腺相关病毒载体近年的基础研究、临床应因治疗的发展。本文浅析了逆转录病毒载体、
用及前景。随着载体学研究的深入，病毒载体的应用范畴将不断拓展。
关键词：病毒载体；基因治疗；结构；功能中图分类号：R944．9
文献标识码：A
1678（2011）05-0408-04文章编号：1005-
Viral vectors used for basic research and clinical application
PAN Zhi-min ，MA Yong ，CHENG Xi-gao
（The No．1Affiliated Hospital of Nanchang University ，Nanchang 330006，China ）
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强的载体，以协助目的基因进入靶细胞并正确表达，是基因治疗过程中必须解决的问题两类
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［1-2］
合，从而引导病毒趋向特异性靶细胞。为提高Rv 载体的转染率，也有人提出多次重复感染，用水泡性口炎病毒包膜G 蛋白替代原病毒蛋白包装Rv 。1．3
Rv 载体的应用
以Rv 为载体的基因转移技术在基因治疗、外源基因表达和RNA 干扰等方面均有广泛应用。世界上第一例基因治疗病例就是应用Rv 携正常的腺苷脱氨酶（ADA ）基因成功治愈了ADA 缺乏症患者。随后英国奥蒙德大街医院也运用Rv 作为治疗载体根治了一名患X 染色体连锁重症免疫缺陷病儿童。
王韫芳等
［6］
，也是基因治疗研究领域的
核心技术之一。基因载体主要分为病毒载体和非病毒载体
。病毒载体具备传送其携带的基因组进入其他细胞
［4］
并进行感染的分子机制，包括逆转录病毒（Retrovirus ，
Rv ）、Lv ）、腺病毒（Adenovirus ）、慢病毒（Lentivirus ，腺相关病AAV ）及杆状病毒（Baculovirus ）等。毒（Adeno associated virus ，11．1
Rv 载体
Rv 及其载体的结构
Rv 在逆转录酶的作用下能将RNA 转变成cDNA 的单链RNA 。其产物cDNA 可进入细胞核并整合在染色体中随宿主细胞的增殖而转录翻译。Rv 的RNA 基因组核心部分PoL-含三个开放读码区：gag-编码病毒核心蛋白，编码逆转录
［5］
env-酶，编码病毒被膜蛋白。利用这些结构可将Rv 设计
利用复制缺陷型Rv 和pMSCVneo 成功构建
［7］
HGF 。为进一步应用HGF 基因进行干细胞工程、了pMSCV-组织工程的研究奠定了基础。还有顾红祥等
将凋亡素基
构建出重组Rv 凋亡素载体，用其感染因（VP3）与Rv 连接，
人肝癌细胞系HepG 。发现它可在四环素调控下表达VP3并诱导HepG2凋亡。此理论为肿瘤的可控性基因治疗提供了依据。此外Rv 载体在治疗艾滋病等方面同样具备巨大的应用潜力。22．1
腺病毒载体腺病毒的结构
腺病毒是无包膜的线状双链DNA 病毒，由壳粒呈二十面体排列构成。衣壳内的五联体及纤毛顶端形成的头节区能与细胞表面的病毒受体结合。腺病毒基因组中的蛋白VI 与病毒衣壳连接在一起，在两条链的5' 端各结合DNA 蛋白其与腺病毒复制密切相关。基因组编码区分为复合物结构，
早期基因区和晚期基因区，前者主要编码病毒的调节蛋白，后者编码病毒的结构蛋白。第三代腺病毒载体去除了所有只保留了5' 和3' 末端反向末端重复序列及包装信编码基因，
kb 2．［8］
［9-10］
、神经系统疾病
成一种复制缺陷性病毒，使其能携带某些目的基因。1．2
Rv 载体的优缺点及改良
Rv 载体的优点有：（1）宿主范围广，对细胞感染率可高达100%；（2）能持久表达目的基因；（3）有强启动子，能高效稳定表达外源基因；（4）感染细胞不产生病变。Rv 载体也有不足：（1）只能整合至分裂期细胞；（2）插入诱变，引起机体免疫反应；（3）双嗜性Rv 载体也不能解决感染特异性靶细胞问题。针对这些问题，研究者们不断寻找解决方案：Roux 等曾提出用双特异性分子桥来解决感染特异性靶细胞问题。此分子桥既可与病毒颗粒结合，也可与特异细胞表面受体结
06-02收稿日期：2011-基金项目：国家自然科学基金（81060147）
：onpum@sina．com 。
中国生化药物杂志Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics 2011年第32卷第5期
腺病毒载体不整合入宿主细胞染色体，插入诱变的潜在还可感染分裂期和静止期细胞，且能高效表达风险比Lv 小，
其基因产物。其缺点是难以持续表达，还可能诱发宿主体内细胞免疫和体液免疫反应而导致组织损伤和转基因表达
［11］
409
ITR ）是复制、整合和包装所必需的顺式作用元件，具有转录启动子活性。基因组中Rep 蛋白与位点特异性整合相关。cap 基因编码的3种衣壳蛋白与感染性病毒颗粒相关。重组AAV 载体即由野生型AAV 以目的基因取代病毒编码序列（rep 和cap ）构建而成。4．2
AAV 的优缺点
AAV 系统免疫原性低，能转染分裂期和非分裂期细胞，有整合到特殊位置的潜能。其广泛的趋向性，能完成多种器官的有效转导
［18］
。对此人们研制出删除了所有编码区基因的辅助依赖
型腺病毒载体，其免疫原性、炎性反应和细胞毒性均明显降低。2．3
腺病毒载体的应用
腺病毒载体宿主范围广，包装容量大，安全性好。因腺病毒能高效转染多种细胞所以常作为基因转移的载体
［2］
。然而重组AAV 载体的包装容量不足仍
。是限制其应用的一个主要因素。不过有专家指出解决之道：共表达多基因的几种策略中，合编入核糖体内部进位点是扩容更为有效的策略4．3
［19-20］
在基因治疗和疫苗载体等方面获得广泛应用：孙士敏等
［12］
以脂质体为介导将AdMax 腺病毒包装系统的骨架质粒pB-3Cre 和穿梭质粒pDC316-NS5B 共转染293细胞HGIoxAEl 、
NS5B 。成功构建了表进行同源重组产生了重组腺病毒pAd-达HCV NS5B 基因的重组腺病毒载体，为进一步探索HCV 基因免疫和治疗做了铺垫。
Takeshi 等［13］构建的腺病毒载体包含RNA 聚合酶-Ⅰ依赖的表达盒和四环素调控系统。依据四环素应答元件和RNA 聚合酶-Ⅰ启动子制备了杂合启动子，后者能促进HCV 复制子进行扩增。可作为HCV 复制的一个评估系统。33．1
Lv 载体Lv 的结构
Lv 属逆转录病毒科，I 为基础构建。Lv 其载体以HIV-vpr 、nef 和vpu 及2个调节基因载体还有4个辅助基因vif 、
Tat 和rev 。其宿主范围比Rv 更广，对难转细胞其基因转染率也较高。3．2
Lv 载体的构建
Lv 载体构建的关键是将HIV-I 基因组中的顺式作用元件和编码反式作用蛋白序列进行分离
［14］
。
AAV 载体的应用
人群中AAV 感染率很高但尚未发现该病毒是疾病的致
［21］
病因素。Gorbatyuk 等于P23H 基因突变鼠的视网膜下注
12周后检测到视网射携带核酶Rz525的重组AAV2/5载体，
膜电图a 波和b 波的振幅。视网膜结构分析也表明基因转移能阻止视网膜外核层的变性。此外，重组AAV 也是很有潜力的提高某些骨科疾病疗效的基因转移工具等等
［23］［2］
［22］
。Larsen
成功应用重组AAV 载体转染骨髓基质细胞。Zhang
利用重组AAV 携带血管内皮因子和骨形态发生蛋白基
因共转染至兔骨髓间充质干细胞获得高表达，并且体内试验证实八周后能促使缺血患肢明显成骨。FDA 也证实一系列临床实验表明AAV2在治疗某些人类疾病有效，包括炎症性关节炎、癫痫、血友病B 和肌营养不良等55．1
。包装成分与载体
杆状病毒杆状病毒的结构
杆状病毒是有囊膜的双链环状DNA 病毒，基因组大小为80 180kb 。其结构特征是病毒粒子包埋于蛋白质基质的包涵体内。病毒粒子形态分两种：其一为出芽型病毒粒子，介导细胞与细胞间的感染；其二是包埋型病毒粒子，入侵肠上皮细胞。病毒DNA 分子以超螺旋存在于杆状核衣壳中。核衣壳又包括衣壳蛋白和髓核：前者是杆状病毒粒子结后者含病毒DNA 和碱性蛋白。构蛋白，5．2
杆状病毒的改良
杆状病毒可被血清中的补体成分灭活，抑制了其转导效率。很多人正在探索改良之道：通过对其进行伪型杆状病毒修饰，可抵抗补体的灭活作用，或在杆状病毒多角体基因和重组载体上置入loxP 位点也能提高转导效率。据λ噬菌体位点特异重组原理
［25］
［24］
。
I 顺式作用序列。包装成分可分别成分均含逆转录和HIV-构建在两质粒上：其一表达gag 和pol ，另一个表达env 。3．3
Lv 载体的优点及应用
Lv 载体以其高效、稳定的基因转移效率成为研究者的新宠。其优点是：（1）对分裂期和非分裂期细胞均能感染；（2）可整合入宿主细胞染色体实现长期而稳定的表达；（3）可兼容多个转录启动子
［15］
。
Lv 载体为AIDS 的基因治疗带来了福音，在其他系统疾Nyhan 综合征因编码次黄嘌病的治疗中也显现希望：Lesch-呤核糖转移酶（HPRT ）的基因缺陷而引起遗传代谢性脑病。若能将携带HPRT 基因的Lv 注入体内神经元，很可能对此病产生良好疗效。又如用Lv 将多药耐药基因导入造血干细胞可使其耐受较大剂量化疗，对治疗白血病及其它恶性肿瘤的疗效有促进作用44．1
AAV
AAV 的结构
AAV 是无被膜的线状单链DNA 病毒。现已分离出11［17］
［16］
，将attR 位点置入杆状病毒基因组可
TM TM TM
获得BaculoDirect 线性DNA 。在含Gateway LR Clonase
酶的情况下，此基因组与外源基因重组后得到的系统速度快、效率高。5．3
杆状病毒优点及应用
杆状病毒载体具有多项优势：（1）基因组载量大，可达38kb 。可同时表达多基因，甚至携带整个病毒基因组；（2）；（3）真核表达。
基因组所含的末端倒转重复序列（inverted terminal repeat ，
410
表达。
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杆状病毒表达载体现已成为基因工程四大表达系统之一
［26］
。并且很快被用于医学领域：（1）单抗研制。以杆状病
得到单克隆抗体。不用纯毒的颗粒表面病原体为抗原蛋白，
化抗原就能直接免疫动物；（2）新型疫苗研制。将外源蛋白与杆状病毒的囊膜蛋白融合，可作为疫苗诱导动物产生保护性免疫。Xu 等
［27］
将猪瘟病毒E2糖蛋白与gp64蛋白融合
发现能够诱导其产生E2中和性抗体；之后用其免疫小鼠，
（3）可作为哺乳动物的基因转移载体。Kim 等［28］发现杆状病毒携带端粒逆转录酶能抑制小鼠神经胶质瘤的生长。刘正山等
［29］
用重组杆状病毒（BacVCMV-EGFP ）对小鼠、猪、
EGFP 对恒恒河猴及人的BMSCs 进行转导，发现BacVCMV-河猴及人的BMSCs 转导率明显高于前两者。表明重组杆状病毒可作为灵长类动物BMSCs 基因修饰的理想载体。6
展
望
病毒载体的应用促进了很多领域的科研工作及临床治疗，其优势有利用病毒天然的感染性进入细胞，转导效率高；复杂的装配过程由细胞完成；不同病毒载体有不同表达特点。其缺点包括病毒应用的安全性（细胞毒性、染色体毒性、免疫毒性等）、基因转移中的靶向性（转导靶向性、转录靶向基因表达水平、持性等）以及基因转移的有效性（转导效率、续时间及表达的可调控性等）等问题。
Rv 载体用于体内治疗时仍存在安全性及基因在宿主细胞中的调控等问题。如何提高病毒的感染效力并稳定表达目的基因是今后研究逆转录载体的一大内容；第三代腺病毒载体已广泛用于多种动物实验模型，但临床应用进展较缓。其中AdF35是改进的了腺病毒亚型，因它能感染某些特殊细胞而日益受关注
［30］
；找出对靶细胞有亲嗜性的重组AAV
血清型，设计出组织特异性启动子来提高重组AAV 载体的转染率和安全性可为基因治疗带来新希望；重组获得可调控靶向性强的Lv 载体是今后应用的方向；杆状外源基因表达、
病毒在研制非复制型基因治疗载体及疫苗方面极具应用前景。今后将从提高转染效率和表达水平及减少宿主对杆状病毒的灭活作用等方面增强其在体内存活力和稳定性。随着高效、安全的基因传递体系不断被改良和研发，基因治疗必将得到更广泛的应用。参考文献：
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仙人掌多糖研究进展与开发利用前景
1，21，22
曾富华，赵龙岩，饶力群
（1．湛江师范学院生命科学与技术学院，广东湛江524048；2．湖南农业大学生物科学技术学院，
湖南长沙410128）
摘
要：仙人掌多糖（OP ）具有调节免疫、抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老、促伤口愈合等生物学活
性。本文综述了OP 的提取、分离纯化、结构及生物学活性的国内外研究进展和OP 的应用现状，总结了OP 研究过程中存在的一些问题，为OP 的研究提供参考。
关键词：仙人掌；多糖；结构；生物学活性；开发利用中图分类号：R284．2；R285
文献标识码：A
1678（2011）05-0411-04文章编号：1005-
Progress and prospect of study and utilization of Opuntia polysaccharides
22
ZENG Fu-hua 1，，ZHAO Long-yan 1，，RAO Li-qun 2
（1．School of Life Science and Technology ，Zhanjiang Normal University ，Zhanjiang 524048，China ；2．School of Biological Science and Technology ，Hunan Agricultural University ，Changsha 410128，China ）
仙人掌可分为食用和药用两类，喜干热和光照，原产于南北美洲热带、亚热带干旱地区，现世界温带地区均有分布，尤以墨西哥分布的种类和数量最多，常作为营养食物广泛栽培
［1-2］
polysaccharides ，OP ）是仙人掌重要有效成分之一。本文就OP 的提取、分离纯化、结构及生物学活性等方面的研究动态以期为OP 的研究与开发利用提供参考。进行综述，11．1
OP 的制备仙人掌的预处理
仙人掌的预处理包括采集、挖刺、去皮、洗涤、切碎、匀去脂类物质、烘干、粉碎、过筛等。采摘时，一般都是在下浆、
茎片的嫩度、季节、采摘时间午采集生长15 40d 的嫩片，等因素都会影响仙人掌的化学成分
［1］
。我国仙人掌资源相当丰富，主要分布在南方大部分
北方亦可大棚栽培。据报道，仙人掌属植物主要化学省市，
氨基酸、维生素、脂肪酸、牛磺酸、黄酮类化合成分为多糖、
物、类胡萝卜素、有机酸、仙人掌醇、胡萝卜苷、对羟基苯甲酸、仙人掌苷、酚类物质以及多种矿物质元素等，具有抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老、促伤口愈合、护肝、提高免疫力等功效，极具开发前景
［3-6］
，因此，要根据用途选
。仙人掌多糖（Opuntia
择采摘条件。OP 提取前一般都是先挖刺去皮以去掉大部分有机酸和一些毒性物质，再洗涤、切碎、匀浆，的黄酮类物质、
用乙醇等有机溶剂浸泡去除脂溶性物质。不同粉碎粒度对多糖提取效果及产率有很大影响，以40 60目为佳。1．2
OP 的提取
、、。过酸、OP 的结构。热水提
06-09收稿日期：2010-基金项目：广东省自然科学基金（No．[**************]1）；广东省教育厅基金（No．Z03062）
，E-mail ：zengfuhua@gmail．com 。物的开发与利用，