【摘 要】采取三血管阻断法（3-VO法），建立C57BL/6小鼠全脑缺血再灌注模型，从形态学组织切片上观察海马CA1区神经元变化，用于进一步研究脑缺血疾病的发生机制及临床防治。经统计学分析，3-VO法能引起实验动物海马CA1区神经元形态变化，减少正常神经元的数量，且颈总动脉结扎的时长为决定动物死亡率和神经元损伤的重要因素，证实3-VO法能诱导实验动物海马CA1区神经元的病理学改变，为相关脑血管病的深入研究提供操作简便的动物模型制作途径。 【关键词】全脑缺血再灌注 3-VO法 缺血性脑血管病 【中图分类号】G642 【文献标识码】A 【文章编号】1674-4810（2014）21-0095-02 缺血性脑血管病是仅次于缺血性心脏病的导致人类死亡的第二大疾病。因此，全脑缺血动物模型的制作在缺血性脑血管病的研究领域成为近年研究的热点。该动物模型的特点是可模拟脑血流中断的状态，引起主要集中于海马CA1区、小脑的迟发性、选择性神经元损伤，尤其在海马易损性等方面的应用较为广泛。桂林医学院用C57BL/6小鼠三血管阻断法（3 vessel occlusion，3-VO法），即结扎延髓腹侧面的基底动脉后短暂性阻断双侧颈总动脉，从形态学组织切片上观察海马CA1区神经元变化，为进一步研究全脑缺血再灌注损伤提供依据和手段。 一 材料与方法 1.实验动物及其分组与模型制作 取26～35g雄性C57BL/6小鼠40只，随机分为假手术组以及Ⅰ～Ⅲ组。4%水合氯醛对实验动物进行麻醉，给药容积为10ml/kg。实施麻醉后，将动物仰卧位固定，颈正中切口，剪去枕骨腹侧面部分颅骨，用5-0缝线（上海浦东区金环医疗用品股份有限公司生产）结扎延髓腹侧面上的基底动脉。分离双侧颈总动脉，穿线备用。依次缝合肌肉及皮肤，将动物放置于38℃恒温加热板保持2小时，以维持正常体温。24小时后，拆线打开原手术伤口，同时结扎双侧颈总动脉。Ⅰ～Ⅲ组分别于结扎后10、12、14分钟后，小心取下结扎于双侧颈总动脉的缝线，恢复灌注。假手术组动物进行以上除结扎基底动脉以及双侧颈总动脉之外的步骤。 2.脑组织标本的取材、染色和观察 手术7天后，将各动物以4%水合氯醛10ml/kg腹腔注射麻醉，暴露心脏，先用生理盐水灌注30分钟，待肝脏变白后，换成4%多聚甲醛灌流，直至动物肝脏变硬，尾巴僵硬后，剪下头部并开颅取脑，再浸入4%多聚甲醛中1天。取出固定好的脑组织，经冲洗、脱水、透明、包埋等步骤后，制成4μm厚连续切片，每隔10张切片取连续2张进行尼氏染色，于高倍镜下观察拍照并对尼氏染色阳性神经元进行计数。 3.数据分析与处理 如无特殊说明，实验结果均用均数±标准差表示。采用SPSS17.0统计软件，各组尼氏染色阳性神经元数用Wilcoxon Mann-Whitney秩和检验进行组间统计，并用Bonferroni法进行两两比较。 二 实验结果 1.死亡率 基底动脉结扎后的死亡率为85%。死亡原因考虑为：（1）麻醉后的自主呼吸丧失；（2）不可避免的技术性失败，导致基底动脉破裂或致死性出血。 双侧颈总动脉结扎后的动物死亡无技术性死亡，均为缺血引起。第Ⅰ组无动物死亡，然而随着缺血时间的延长，死亡率升高，如第Ⅱ组的死亡率上升到了27%，第Ⅲ组的死亡率达36%。死亡的时间多集中在全脑缺血后的3～5天（65%）。 2.脑组织切片观察 假手术组细胞3～4层，排列整齐紧密，细胞核大而圆、核仁清晰；尼氏小体染色浓密规则（图A）。Ⅰ～Ⅲ组细胞排列散乱、部分丢失、胞核固缩，尼氏小体染色呈现不同程度的变淡或消散，且胞浆出现嗜酸性变化（图B～D）。 全脑缺血后海马CA1区神经元尼氏染色情况（放大倍数200×）。（A）假手术组动物无CA1区海马神经元损伤。3-VO法全脑缺血10min（B）、12min（C）以及14min（D）后，可观察到明显的CA1区神经元损伤。 每张尼氏染色切片高倍镜下（200×）随机选取大叔脑组织海马双侧CA1区各5个不重叠的视野进行尼氏染色阳性神经元计数：假手术组128±6，Ⅰ组53±3，Ⅱ组45±6，Ⅲ组32±5，Ⅰ～Ⅲ组与假手术组相比，P 三 讨论 我们采取3-VO法制作小鼠全脑缺血模型，主要是通过基底动脉和颈总动脉结扎，阻断脊髓血流与脑血流之间的通路，从而引起短暂性的全脑缺血，引起海马神经元的迟发性死亡。从实验结果来看，病理性损伤的程度取决于颈总动脉的结扎时长，且结扎10分钟是较为理想的缺血时间，因为能引起CA1区细胞50%左右的缺失，同时死亡率低。 但此种方法同样存在个体差异大的问题，同时，术后存活率较低，被烧灼阻断的椎动脉不可再通，改变了正常的解剖结构，影响再灌注的脑血流量，造成再灌注不完全。我们所采取的3-VO法操作简便，因为在C57BL/6小鼠体内，基底动脉位于枕骨大孔和第一颈椎之间，位置明显，因而可提高实验成功率，为相关脑血管病动物模型的制作提供更易于操作的方法和思路。 针对建立全脑缺血再灌注模型的实验方法有很多种。Eklof等在1972年就提出了双侧颈总动脉结扎的全脑缺血再灌注模型，然而这种方法个体差异大，造成的病理损伤不稳定。当前更流行的是四血管阻断法（4-VO），即在电凝双侧椎动脉造成其永久性闭塞的情况下，结扎双侧颈总动脉，松开结扎线后可实施再灌注研究。 〔责任编辑：李锦雯〕
【摘 要】采取三血管阻断法（3-VO法），建立C57BL/6小鼠全脑缺血再灌注模型，从形态学组织切片上观察海马CA1区神经元变化，用于进一步研究脑缺血疾病的发生机制及临床防治。经统计学分析，3-VO法能引起实验动物海马CA1区神经元形态变化，减少正常神经元的数量，且颈总动脉结扎的时长为决定动物死亡率和神经元损伤的重要因素，证实3-VO法能诱导实验动物海马CA1区神经元的病理学改变，为相关脑血管病的深入研究提供操作简便的动物模型制作途径。 【关键词】全脑缺血再灌注 3-VO法 缺血性脑血管病 【中图分类号】G642 【文献标识码】A 【文章编号】1674-4810（2014）21-0095-02 缺血性脑血管病是仅次于缺血性心脏病的导致人类死亡的第二大疾病。因此，全脑缺血动物模型的制作在缺血性脑血管病的研究领域成为近年研究的热点。该动物模型的特点是可模拟脑血流中断的状态，引起主要集中于海马CA1区、小脑的迟发性、选择性神经元损伤，尤其在海马易损性等方面的应用较为广泛。桂林医学院用C57BL/6小鼠三血管阻断法（3 vessel occlusion，3-VO法），即结扎延髓腹侧面的基底动脉后短暂性阻断双侧颈总动脉，从形态学组织切片上观察海马CA1区神经元变化，为进一步研究全脑缺血再灌注损伤提供依据和手段。 一 材料与方法 1.实验动物及其分组与模型制作 取26～35g雄性C57BL/6小鼠40只，随机分为假手术组以及Ⅰ～Ⅲ组。4%水合氯醛对实验动物进行麻醉，给药容积为10ml/kg。实施麻醉后，将动物仰卧位固定，颈正中切口，剪去枕骨腹侧面部分颅骨，用5-0缝线（上海浦东区金环医疗用品股份有限公司生产）结扎延髓腹侧面上的基底动脉。分离双侧颈总动脉，穿线备用。依次缝合肌肉及皮肤，将动物放置于38℃恒温加热板保持2小时，以维持正常体温。24小时后，拆线打开原手术伤口，同时结扎双侧颈总动脉。Ⅰ～Ⅲ组分别于结扎后10、12、14分钟后，小心取下结扎于双侧颈总动脉的缝线，恢复灌注。假手术组动物进行以上除结扎基底动脉以及双侧颈总动脉之外的步骤。 2.脑组织标本的取材、染色和观察 手术7天后，将各动物以4%水合氯醛10ml/kg腹腔注射麻醉，暴露心脏，先用生理盐水灌注30分钟，待肝脏变白后，换成4%多聚甲醛灌流，直至动物肝脏变硬，尾巴僵硬后，剪下头部并开颅取脑，再浸入4%多聚甲醛中1天。取出固定好的脑组织，经冲洗、脱水、透明、包埋等步骤后，制成4μm厚连续切片，每隔10张切片取连续2张进行尼氏染色，于高倍镜下观察拍照并对尼氏染色阳性神经元进行计数。 3.数据分析与处理 如无特殊说明，实验结果均用均数±标准差表示。采用SPSS17.0统计软件，各组尼氏染色阳性神经元数用Wilcoxon Mann-Whitney秩和检验进行组间统计，并用Bonferroni法进行两两比较。 二 实验结果 1.死亡率 基底动脉结扎后的死亡率为85%。死亡原因考虑为：（1）麻醉后的自主呼吸丧失；（2）不可避免的技术性失败，导致基底动脉破裂或致死性出血。 双侧颈总动脉结扎后的动物死亡无技术性死亡，均为缺血引起。第Ⅰ组无动物死亡，然而随着缺血时间的延长，死亡率升高，如第Ⅱ组的死亡率上升到了27%，第Ⅲ组的死亡率达36%。死亡的时间多集中在全脑缺血后的3～5天（65%）。 2.脑组织切片观察 假手术组细胞3～4层，排列整齐紧密，细胞核大而圆、核仁清晰；尼氏小体染色浓密规则（图A）。Ⅰ～Ⅲ组细胞排列散乱、部分丢失、胞核固缩，尼氏小体染色呈现不同程度的变淡或消散，且胞浆出现嗜酸性变化（图B～D）。 全脑缺血后海马CA1区神经元尼氏染色情况（放大倍数200×）。（A）假手术组动物无CA1区海马神经元损伤。3-VO法全脑缺血10min（B）、12min（C）以及14min（D）后，可观察到明显的CA1区神经元损伤。 每张尼氏染色切片高倍镜下（200×）随机选取大叔脑组织海马双侧CA1区各5个不重叠的视野进行尼氏染色阳性神经元计数：假手术组128±6，Ⅰ组53±3，Ⅱ组45±6，Ⅲ组32±5，Ⅰ～Ⅲ组与假手术组相比，P 三 讨论 我们采取3-VO法制作小鼠全脑缺血模型，主要是通过基底动脉和颈总动脉结扎，阻断脊髓血流与脑血流之间的通路，从而引起短暂性的全脑缺血，引起海马神经元的迟发性死亡。从实验结果来看，病理性损伤的程度取决于颈总动脉的结扎时长，且结扎10分钟是较为理想的缺血时间，因为能引起CA1区细胞50%左右的缺失，同时死亡率低。 但此种方法同样存在个体差异大的问题，同时，术后存活率较低，被烧灼阻断的椎动脉不可再通，改变了正常的解剖结构，影响再灌注的脑血流量，造成再灌注不完全。我们所采取的3-VO法操作简便，因为在C57BL/6小鼠体内，基底动脉位于枕骨大孔和第一颈椎之间，位置明显，因而可提高实验成功率，为相关脑血管病动物模型的制作提供更易于操作的方法和思路。 针对建立全脑缺血再灌注模型的实验方法有很多种。Eklof等在1972年就提出了双侧颈总动脉结扎的全脑缺血再灌注模型，然而这种方法个体差异大，造成的病理损伤不稳定。当前更流行的是四血管阻断法（4-VO），即在电凝双侧椎动脉造成其永久性闭塞的情况下，结扎双侧颈总动脉，松开结扎线后可实施再灌注研究。 〔责任编辑：李锦雯〕