石蜡切片制备基本步骤
一、准备工作
（一）洗涤实验所需器皿：（玻璃器皿的清洗）
1、 用洗衣粉将玻璃器皿表里擦洗干净反复洗刷
2、 将器皿在自来水下冲洗干净
3、 将器皿倒扣在铺有吸水纸或纱布的桌子上控干
注：一般情况下，经以上步骤后，用蒸馏水洗过1~3次即可烘干备用，如果做特殊染色还需浸泡在酸性清洁液内12~24小时，再经自来水彻底冲洗，再用蒸馏水过洗1~3次 烘干备用。
（二）配制： 硫酸洗液的配制
清洁液（洗液）的配制：
成分 强酸液 次强酸液 弱酸液
浓硫酸（ml） 1000 200 100
重铬酸钾（mg） 63 120 100
蒸馏水 （ml） 200 200 1000
重铬酸钾 1200g
蒸馏水 2000ml
将2000ml浓硫酸缓缓倒入上述溶液中，边倒边用木棒轻轻搅拌
（三）载玻片与盖玻片的处理
1. 将所需载玻片与盖玻片清洗后，放入硫酸重铬酸钾溶液中浸泡24小时
2. 流水冲洗，再用蒸馏水冲洗3遍
3. 95%~100%酒精浸泡24小时，用绸布擦干备用
注：在将载玻片与盖玻片放入清洁液中时，要一片片地投入，使其不致重叠。
二、常用液体的配制
（一）缓冲溶液：
1．磷酸盐缓冲液
A液：0.1mol/L磷酸二氢钠
B液：0.1mol/L磷酸氢二钠
A液与B液按比例混合调整到所需的PH值（3：7≈PH7.0）
2．枸椽酸缓冲溶液
A液：0.1mol/L枸椽酸
B液：0.1mol/L枸椽酸钠
A液与B液按比例混合调整到所需的PH值（6.2：42.8≈PH6.2）
（二）固定剂：
1．甲醛：10%甲醛
福尔马林 100ml
蒸馏水 900ml
注：实际甲醛含量只有3.6~4.0%但习惯上都将其视为10%。
2．10％中性福尔马林钙固定液
甲醛液 10ml
蒸馏水 90ml
加碳酸钙至过饱和(以容器底部碳酸钙沉淀1~2cm厚为适度)充分振荡混合后，放置24小时取上清液使用。
3．4%多聚甲醛：
8%多聚甲醛
多聚甲醛 8g
蒸馏水 100ml
加温至60℃左右，不时搅拌，成为乳白色溶液。滴加1N NaOH，并不停搅动至液体清明。 1N NaOH
lN等于1L溶液中某种物质1mol除以该物质的氢当量价所得数值的量
氧化钠(NaOH )；分子量＝40．005，当量价＝1
1N Na0H的配制方法为：m＝40．005／1＝40．005g。取40．005gNaOH溶解于1L蒸馏水中
4%多聚甲醛
8%多聚甲醛 50ml
0.1M磷酸盐缓冲液 50ml
PH7.2
先取50 ml 8%多聚甲醛，用0.1M磷酸二氢钠和0.1M磷酸氢二钠将PH值调至7.2
4．Bouin液：
苦味酸饱和水溶液 75ml
36％~40％福尔马林液 25ml
冰醋酸 5m1
5．改良Bouin氏固定液
苦味酸饱和水溶液 45ml
95%酒精 45ml
36％~40％福尔马林液 5ml
冰醋酸 5m1
6．Carnoy液：
冰醋酸 10 m1
氯仿 30 m1
无水乙醇 60 m1
以上三者临用前混合，预冷至4℃后使用。24小时后固定液失效。
（三）染色液
1．Harris苏木精液
A液：
苏木精 1g
无水酒精 10ml
B液：
铵矾或钾矾 20g
蒸馏水 200ml
氧化汞 0.5ml
冰醋酸 8ml
将矾溶于水，加热溶解（B液），稍冷后将苏木精酒精液（A液）混入B液，加热，稍冷却，加氧化汞，再继续加热1分钟，染液变为紫色，注意在加氧化汞时宜逐渐少量加入，防止染液溅出。全冷后呈深紫色，将烧杯口用纱布盖好，隔夜过滤，在过滤液内每96 ml中加4 ml冰醋酸，放置1周后成熟，即可用于染色，保存期1~2个月。此染液在加醋酸后，对核染色特具选择性，故很适于脱落细胞的核染色。由于染液内已加有氧化剂，故不能长期储存，但利于配后即用。
2．Mayer苏木精掖
苏木精 1g
钾矾或铵矾 50g
碘酸钠 0.2g
蒸馏水 1000ml
水合氯醛 50g
枸橼酸 1g
将苏木精，钾矾及碘酸钠依次加入水内，略加热并搅拌，此时液体呈蓝色，待全溶后过夜。再加入水合氯醛及枸橼酸并加热至煮沸5分钟，冷后过滤备用。如不急用可不煮沸而在室温待其成熟，染液可较长期贮存使用。核染色鲜明，染色时间5—10分钟。用该染液染色后，不需分化，充分水洗蓝化后即可，伊红复染细胞质，使用一段时间后就要换新溶液。
3．Hasnsen甲矾苏木精的配制
A液：苏木精 1g
无水乙醇 10ml
B液：钾矾 20g
蒸馏水 200ml
C液：高锰酸钾 1g
蒸馏水 16ml
三液分别溶化后，将A液倒入B液，再加入C液3ml，充分搅拌均匀后加热至沸腾，1分钟左右，将容器置于冷水中使其迅速冷却，此液配后即可使用，染后无需碱化，细胞核即为蓝色，效果较好，高锰酸钾可以迅速氧化苏木精（每1g苏木精需0.177g高锰酸钾氧化）。
4．伊红
0.5~1%水溶液或酒精溶液。
1．水溶性伊红
伊红 5~10g
蒸馏水 1000ml
冰醋酸 10滴
先将水溶性伊红加入蒸馏水中，用玻璃棒搅起泡沫后过滤，再加冰醋酸。
2．醇溶性伊红
伊红 5~10g
70%~90%酒精 1000ml
冰醋酸 10滴
（四）其它
1．麻醉剂：
2~4%戊巴比妥钠，1ml/kg体重（45mg/kg）。
2．各级浓度酒精的配制
75%；85%；95%；100%酒精。75%和85%酒精用95%酒精配制；（取75ml95%酒精，加水至95ml，即为75%酒精）
3．盐酸洒精
多用于多种染色过程中的分色，如苏木精染色后分色。配法是在100ml的70％酒精内加0.5~1ml的浓盐酸(Hcl)。用盐酸酒精分色后要经自来水充分冲洗组织切片，去除所含的酸再作其他处理。
4．碘酒
取碘5g，溶于95％酒精80ml，再加入20ml蒸溜水即成
5．生理盐水
以氯化纳0.85~0.90g溶于100m1蒸馏水配成的生理盐水适用哺乳动物
石蜡切片制备基本步骤 之二
三、取材，固定
（一） 实验动物的抓取及固定
1．小白鼠、大白鼠的抓取及固定方法
要点：（1）动作要轻缓；（2）不要突然袭击；（3）如发现动物的毛发竖起来时，最好停一会后再抓；（4）将四肢打开，固定在木板或方形蜡板上。
2．实验家兔的抓取及固定方法
要点：（1）随时抚摩其头部；（2）防止被其脚爪抓伤；（3）根据实验要求选择固定方法。
3．豚鼠的抓取及固定方法
要点：先用一只手扣住豚鼠背部，然后抓紧两耳间头颈部的皮肤，用另一只手托起臀部送到动物固定台上。
（二） 实验动物的编号、标记、分组和被毛去除方法
1．编号和标记方法
（1）染色法
标记溶液：3%~5%苦味酸 黄色
2%硝酸银 咖啡色（涂后光照10分钟）
0.5%中性红或品红 红色
龙胆紫 紫色
编号原则：先左后右，从前到后
左前脚为1，左侧腹为2，左后腿为3，头顶为4，腰背部为5，尾基为6，右前脚为7，右侧腹为8，右后腿为9。超过10可用不同的染色的标记液，一种染色为个位，另一种为十位数。
（2）挂牌法
（3）耳孔法
一般来说，小型动物适宜用耳孔法和染色法，中型动物适用于挂牌法。
2．实验动物的随机分组方法
动物实验时，常常需要将选择好的实验动物，按研究需要分成若干个组，分组时为了避免人为因素的影响，常应用随机数字表进行完全随机化的分组。
3．实验动物被毛去除方法
剪毛法
拔毛法
剃毛法
脱毛法：系用化学脱毛剂将实验动物被毛脱去，适用于无菌手术野的准备以及观察动物皮肤血液循环和病理变化。方法：将需脱毛部位的被毛先用弯头剪刀剪去，尽量剪短，勿剪破皮肤。然后用温水将该部位润湿，再用纱布包扎棉球的小棒蘸脱毛剂，在需脱毛部位涂一层，经2~3min后，用温水洗去该部位脱下的毛，自然晾干备用，切勿用纱布去擦，以免损伤皮肤。
脱毛剂配方：
（1）硫化钠3g
肥皂粉1g
淀粉7 g
加水适量调成糊状
（2）硫化钠8g
溶于100ml水中
（3）硫化钠8g
淀粉7 g
糖4 g
甘油5 g
硼砂1 g
加水75ml
（三） 实验动物处死
处死动物的方法很多，无论是采用哪种方法，都要尽力避免使动物长时间陷于痛苦和濒于死亡状态。热爱生命，珍爱动物。
1．空气栓塞致死法
要点：（1）常用于大的动物（如：兔、猫、狗和猴等）；（2）用50~100ml注射器一只；（3）此方法迅速、方便，但各脏器淤血明显。
2．麻醉后处死法
注：采用此方法，取材后一定要确定动物是否已死亡，最好再行断颈。
（1）吸入麻醉法
要点：（1）适用于较小的动物（小白鼠、大白鼠、豚鼠和兔等）；（2）用乙醚浸泡过的脱脂棉；（3）时间大约1~2分钟；（4）注意防火
（2）注射麻醉法
要点：（1）适用范围较广；（2）注射方式可采用静脉、腹腔、皮下和肌内注射，最常用的是腹腔注射；（3）注射致死量一般视动物大小而定。
3．脑、脊破坏法
要点：（1）常用于蛙类；（2）用金属针经枕骨大孔进入，破坏大脑和脊髓。
4．断头处死法
要点：（1）常用于小动物；（2）用剪刀剪断颈椎；（3）如果没有特殊要求，最好不要使头和躯干分离。
5．断椎法
要点：（1）常用于大白鼠和小白鼠；（2）一手固定头部，一手拽住实验动物的尾部，轻轻一拉扯断其颈椎，使其脱位，椎管内急性损伤瘫痪或死亡后取材；（3）此方法处死动物组织结构保存较好。
（四） 实验动物解剖
解剖步骤
1．实验动物被麻醉或处死后，将其；固定在动物解剖台上，用纱布蘸取生理盐水湿润被毛；
2．从下颌至耻骨联合沿正中线切开皮肤；
3．打开腹腔：沿肋骨下缘腹正中，用镊子提起腹壁切开腹壁肌肉，至耻骨联合，从肋骨下端向脊柱方向，将两侧腹壁剪开，充分暴露腹腔内脏器；
4．打开胸腔：用剪刀沿肋骨的肋软骨和骨的连接处由下向上剪开，不要剪断锁骨，剪时应尽量贴着胸内壁，并注意不要剪断胸骨两侧的大血管。然后将肋弓提起，暴露腹腔内脏器。
（五） 取材
取材一定要迅速，应在动物处死后立即进行解剖和切取组织材料，否则会引起细胞发生死后变化（如组织自溶及腐败现象等），进而失去原有的结构，如果进行酶组化染色，将会使大量的酶失活和丢失。
取材方法和注意事项
（1）取材用的刀剪必须锋利，取材时应用镊子夹该组织的周围的结缔组织，凡是用镊子夹过的或用手压过的组织均不可用。
（2）根据实验要求选择不同的取材方法（整体取出脏器法、单个脏器取出法和切取组织块法等）
（3）取材的先后顺序原则。根据死后组织结构改变的速度的快慢而定。先腹腔后胸腔，先消化管后肝、脾等多血的器官及神经组织。
（4）取材组织块的大小既要保证组织的完整性，又要力求小而薄，一般以1.0cm×1.0cm×0.5cm为好，但有些特殊要求的可视情况而定。
（5）较小的组织或器官（淋巴结、松果体、脑垂体和神经节等）应整体固定，但要破坏其表面一侧的被膜。
（6）管状及囊状组织（消化管的取材）都不应斜切，先将一段肠管或食管剪下，从中剪开管腔，使之成片状，然后将其铺在纸板下，黏膜面朝上，用大头针或细线将四边固定，用生理盐水漂洗黏膜表面，然后固定。
（7）较细的管状脏器（输尿管、输精管、输卵管、中动脉和静脉等）应取下1~2cm长，平铺于硬纸片上或吸水纸上分段固定。
（8）取材要尽量注意脏器的完整性。
（9）应根据所要观察的部位及实验目的进行选择组织的切面。对于病理材料，除切取病变部位外，还要切取病变和正常组织交界部分的区域，以利于进行正常组织与病理组织的对比观察分析。
（10）取材时要注明取材时间、组织器官名称、固定液名称、组织块的数量、所取组织位于器官的部位等，以备查。
（六） 固定
1．固定的目的
（1）防止组织溶解及腐败，以保持组织和细胞与正常生活时的形态相似；
（2）使细胞内蛋白质、脂肪、糖、酶等各种成分转变为不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时的相仿；
（3）组织细胞内的不同物质经固定后可以产生不同的折光率，对染料也产生不同的亲和力，造成光学上的差异，使得在生活情况下原来看不清楚的结构变得清晰起来，并使得细胞各部分容易着色，有利于区别不同的组织成分。
（4）固定剂的硬化作用，增加组织硬度，便于制片。
2．固定的对象和方法
（1）固定的主要对象是蛋白质；
（2）固定液的量要足够，其固定液的量一般不少于组织总体积的10倍以上（一般为1：20）。对于某些需要制作神经染色和酶组织化学染色的组织固定，比一般的固定要严格。
（3）特殊的固定方法（注射或灌注固定）：某些组织块由于体积过大或固定液极难渗入内部或需要对整个脏器或整个动物进行固定，宜采用此方法，将固定液注入血管，经血管分支到整个组织和全身，从而得到充分固定。
①局部灌注固定：
肺：肺内含有空气，固定难以渗入，可将固定液从气管、支气管或肺动脉注入固定液，从支气管注入时速度一定要慢，量不宜过多。注射固定后可将整个肺投入固定液中6~12小时，再分别切成小块。
肝、肾：经肝动脉或肾动脉注入固定液。
脑：动物麻醉后暴露颈动脉，以注射针尖向着关部的方向注入固定液。
②全身灌注固定：
步骤：取大白鼠，1%戊巴比妥钠麻醉，打开胸、腹腔，纵向切开心包，用纱线在主动脉弓起始部，然后用50ml注射器，选用适当针头，从左心室向主动脉方向刺入，将纱线扎紧固定，在右心房开一孔放血，取用与动物等量的生理盐水注入血管中洗涤，待洗涤处的液体不见血时，再注入固定液。待动物体有一定硬度时即可取材，将所需组织从动物身上切去后，经适当处理，即投入固定液中（甲醛或多聚甲醛）
3．固定液的性质和条件
（1）能迅速渗入组织，使组织细胞形态在短期内不至于有较大变化。
（2）固定液有相当的渗透力，对组织各部分的渗透力相等，可使组织内外完全固定。
（3）使组织细胞不至于因固定而引起人为的改变。
（4）尽可能避免固定剂使组织膨胀或收缩。
（5）使组织达到一定硬度，获得较佳的折光率和对染料具有较强的亲合力。
4．固定时应注意的事项
（1）固定液及被固定的组织必须新鲜；
（2）固定液的用量一般为组织体积的10~20倍，容器不要过小，材料也不要太多；应避免组织紧贴瓶底或瓶壁，以免影响固定液的渗入，必要的时候可以在瓶底垫上一层棉花；
（3）固定时间视组织块的种类、性质、大小，固定液的种类、性质、渗透力的强弱，固定时的温度的高低，实验目的等；
（4）防止被固定的组织因固定剂的作用而发生变形；
（5）固定所用的固定液，以新配的为好，放置过久会失效；
（6）在固定期间摇动组织或摇动容器有利于固定液的渗入，对长期固定的标本，可经常更换固定液
（7）取材固定应同时作好记录，包括组织名称、固定液和时间等内容。
5．固定剂
单纯固定剂
（1）10%甲醛：对组织渗透性强，固定均匀。对组织膨胀约5%，经酒精脱水时有较大的收
缩。能保存脂肪，不能沉淀核蛋白及白蛋白，长期用其固定的组织使组织变为酸性，不利于染色，特别是细胞核的着色。经自来水冲洗6~24小时后，可以使其酸碱中和，并减少结晶。
（2）4%多聚甲醛：对组织穿透性好，组织收缩小，对大多数抗原物质保存较好，特别是对脂肪和各种酶的固定效果更好。固定的时间不宜太长，以24小时以内为宜，适用于免疫组织化学染色。
（3）饱和的苦味酸溶液：能沉淀一切蛋白质，渗透力弱，对组织收缩大，故一般不能单独使用。
（4）冰醋酸：渗透力强，沉淀核蛋白，对染色质固定好，使组织膨胀，故一般不单独使用。
（5）锇酸：价格昂贵，为强氧化剂，易还原成氢氧化锇，呈黑色沉淀；必须避光保存。不能沉淀蛋白质，而使蛋白质凝胶化，所以对蛋白质固定不均匀，锇酸固定的细胞能保持生活时的形态，不收缩细胞，对胞质固定较长好，核的固定不好，锇酸为脂肪及类脂质的优良固定剂，经它固定的脂肪和类脂质呈黑色，特别是对于是显示线粒体和高难度尔基复合体效果良好。
混合固定剂
（1）Bouin氏固定液：为常用的良好的固定剂，穿透速度快，组织收缩性较小，固定均匀，固定后组织有适当的硬度，对于切片和染色均有良好的效果。一般固定12~24小时，固定后入70%酒精洗去苦味酸的黄色，在脱水时经各浓度酒精也可洗去黄色，在酒精中加入氨水一滴或少许碳酸钾饱和水溶液，可加快洗去苦味酸的黄色即使留有少量苦味酸的黄色，对一般染色体并无影响。
（2）Zenker液（PH2.3）：此液多用于一般组织的固定，它能使细胞核、细胞质染色清晰但固定时间长，一般要12~36小时，加热可以缩短固定时间。固定后的组织必须流水冲洗12小时，由于固定中含有升汞，在经70%酒精脱水时，加少量的碘液（0.5%碘酒精）以脱汞。
（3）Carnoy液：渗透力强，特别适宜于固定染色体、肝糖、粘液等一些较为细微的结构。显示DNA、RNA效果良好。
（4）改良Bouin氏固定液：此液对一般组织固定效果都很好，固定时间为4~18小时，固定后直接放70%乙醇脱水，固定时间较长对组织亦无损害。
（七） 组织块修整
固定后的组织块可能会在外部形态上有些改变，或者由于组织在还未固定时就取材，组织器官较软，取材不容易切平。经固定后的组织有一定的硬度，此时就可以做一些修整，但改变不要太大，只是将组织材料切取平整，修掉一些不规则的部位。修整组织块时，手术切片一定要锋利。
四、水洗
1．目的：
洗去渗入组织中的固定液，终止固定。以免影响对组织内结构的观察、分析和研究。
2．原则和方法：
固定后的组织块的冲洗，一般情况下是置水龙头下以自来水流水冲洗，这样可以使组织中的固定液随时溢出，洗得更干净彻底，有些还需要进行特殊的洗涤。
（1）各种以水配制的固定液如甲醛，都必须用流水冲洗，大块组织一般冲洗24小时，小块组织一般冲洗2—10小时。
（2）固定液为多聚甲醛时，用于免疫组织化学等特殊染色的应将组织投入PB缓冲液中，每60分钟更新洗涤液一次，累计6小时。
（3）固定液为酒精或是酒精混合液，一般不需用水冲洗，其组织块的洗涤应用与固定液浓度相等垢酒精换洗或者直接进行脱水的程序。
（4）用锇酸或含有锇酸的固定液固定的组织，必须用流水彻底冲洗干净。
（5）经含有苦味酸的固定液固定的组织块，无论其固定液是水溶性还是酒精溶性，都应充分冲洗，水溶性固定液固定的组织块一般须冲洗12小时，再进入70%的酒精溶液洗涤，酒精溶性固定液固定的组织块直接进入70%的酒精溶液洗涤，该溶液可以脱掉苦味酸的黄色，但最好从50%酒精开始洗涤。
（6）冲洗好的组织可存放在75%酒精内
五、脱水包埋
（一）脱水
1．脱水的目的
组织内的水不能和支持剂混合，所以必须把组织中的水分彻底脱除。脱水有利于组织的透明和浸蜡，有利于组织的永久保存。
2．脱水剂
（1）乙醇：可作固定剂，又可脱水剂，但乙醇与水混合时有较剧烈的物理反应。高浓度的酒精对组织有强烈收缩及脆化的缺点，因此用乙醇脱水不能直接入纯酒精中脱水，而必须经过由高到低的一系列不同浓度的酒精，逐渐取代组织中水分，以保证组织脱水彻底，并避免组织过度收缩和硬化。
（2）丙酮：脱水能力比酒精强，但对组织的收缩更大，在组织学制片中较少使用，多用于病理快速切片，或用于某些组化水解酶的固定。
（3）正丁醇：是较好的脱水兼透明剂，可与酒精及石蜡混合，用于脱水是可先经过各种不同浓度的正丁醇和乙醇混合液，再入正丁醇，进行石蜡包埋时，可先用正丁醇和石蜡等量混合液，然后浸入纯石蜡包埋，正丁醇用于脱水的优点是很少引起组织收缩和脆硬，可替代二甲苯，是很好的脱水剂，但由于价格较贵，不常使用。
3．步骤
（1）乙醇脱水过程
50%乙醇 6~8小时
75%乙醇 6~8小时
85%乙醇 3~5小时
95%乙醇 1~2小时
95%乙醇 1~2小时
100%乙醇Ⅰ 1小时
100%乙醇Ⅱ 1小时
（2）丙酮脱水
如果是丙酮固定的组织，则不必再经过乙醇，可以用新丙酮更换一次，便直接浸入二甲苯或苯中透明。其他水溶液固定的组织，均按上述乙醇脱水方法脱水，亦可由100%乙醇中移入丙酮继续脱水2~4小时再入二甲苯透明，透明后浸蜡包埋。
（3）正丁醇脱水
组织用正丁醇脱水前，先经50%乙醇脱水，然后移入正丁醇和乙醇混合液进行脱水。 50%乙醇 6~12小时
50%乙醇+20%正丁醇+30%蒸馏水 5~8小时
50%乙醇+35%正丁醇+15%蒸馏水 4~6小时
45%乙醇+45%正丁醇+10%蒸馏水 3~5小时
25%乙醇+75%正丁醇 2~3小时
25%乙醇+75%正丁醇 1~2小时
15%乙醇+85%正丁醇 1~2小时
5%乙醇+95%正丁醇 1~2小时
100%正丁醇Ⅰ 1小时
100%正丁醇Ⅱ 1小时
4．注意事项：
（1）脱水的过程应逐步地而不应骤然地进行，不能操之过急。
（2）脱水的时间应根据组织块的大小和组织的类型而定。
（3）组织块在高浓度，特别是无水乙醇内不能放置的时间太长。无水乙醇吸水能力太强，容易造成组织块的过度硬化，使得切片理组织易碎裂。
（4）在脱水的过程中可以将组织块停留在70%~80%的酒精中。
（5）每次更换新的脱水剂时（组织块从低浓度到高浓度），都要把组织块放在吸水纸上吸干，装组织块的容器也要控干水分，以免将水及低浓度脱水剂带入高浓度脱水剂中，影响脱水效果。
（6）脱水剂的先择要根据实验的要求及实验室的条件
（二）透明
1．透明的目的
置换组织内的脱水剂，为下一步的浸蜡起到桥梁作用；
使组织呈现不同程度的透明状态，有利于光线的透过。
2．透明剂
（1）二甲苯：是现在应用最广的一种透明剂，价格较便宜，不能和水混合，遇水则变成乳白色浑浊，因此必完全脱水后才能使用；易溶于酒精又能溶解石蜡，透明力强；其最大的缺
点是容易使组织收缩变硬变脆，所以组织不能在其停留过久，透明时间视组织块的大小、性质而定；有的组织如肌肉、肌腱、软骨、骨、皮肤、头皮及眼球等，不宜用二甲苯透明，因组织过硬不易切片；长时间接触，对粘膜有刺激作用。
（2）苯：性质与二甲苯相似，对组织收缩也较小，组织也不易变脆，但透明较慢，组织在其内可以滞留12~24小时，但毒性较大。
（3）香柏油：用为透明剂，效果很好，有高度透明作用，能与醇和二甲苯混合，香柏油对组织的硬化及收缩程度比任何其他透明剂都要小，但透明的速度较慢，3mm以下厚度的组织块需12小时以上。香柏油与石蜡不易融合，即香柏油不易被石蜡取代，因此经香柏油透明以后，可经过二甲苯短时间媒浸，再进行石蜡包埋。肌肉、皮肤、血管、膀胱、垂体及肾上腺等用香柏油效果较好。
3．二甲苯的步骤：两次透明
第一次透明约40分钟
第二次时间不一定，要视透明效果而定
4．注意事项
（1）时间不宜过长，否则组织会变脆；
（2）组织块脱水必彻底。
（三）浸蜡、包埋（石蜡包埋法）
1．浸蜡
（1）浸蜡的目的
置换组织中的透明剂，为包埋做准备。
（2）浸蜡的步骤
在60度恒温蜡箱中放置3个蜡杯，分别编号1（52℃~54℃）、2（52℃~54℃，或54℃~56℃）、3（56℃~58℃），其中分别盛软蜡、软蜡、硬蜡，取透明好的组织块放入软蜡中各1小时，迅速取出放入硬蜡，同样放置1小时。如果时间来及包埋，可以将已经完成浸蜡的组织块取出放在温箱外，第二天继续。
（3）注意事项
温箱中的温度必须严格控制在60℃的范围，不能超过60℃；浸蜡时间不宜过长。浸蜡温度过高或时间过长使组织收缩过度收缩和脆变。
2．包埋
（1）步骤
①准备包埋蜡：一般应用硬蜡（56~58℃或60~62℃）为好，所用的石蜡要求透明无杂质，新的石蜡要反复熔凝，并有一定的粘韧性，可以加一些蜂蜡。蜡的熔点应与组织的硬度相适应。包埋用过的石蜡可以反复使用。
②准备包埋框：可以用金属的，也可以用硬纸摺叠。
③点燃酒精灯，准备好无齿尖镊子，需作标记应先写好标签。
④在金属框中倒入硬蜡，然后用无齿镊子取组织块放入石蜡中，置好方向。可室温下冷却。 ⑤包埋框或纸盒内的蜡逐渐凝结，若表面已凝结形成一层固体状，即可放入冷水中，加速其
凝固。
⑥待蜡块完全凝固以后，便可拆卸包埋框架， 或拆开纸盒，取出蜡块。
（2）注意事项
①包埋时夹取组织的镊子，用酒精灯随时烧热，以免石蜡凝结后粘附在镊子上，造成蜡块凝固不均匀。
②包埋操作要迅速，组织从浸蜡杯中取出置入包埋框中的时间应尽量缩短。
③包埋后的蜡块应呈均质半透明状，如果出现白色混浊状，一般出现在组织周围或组织的底部，应考虑这样几个方面的问题：a. 脱水不彻底。b.包埋蜡温度低了，组织进行包埋时，包埋框中的蜡已成凝结状。c.组织内还残留有较多的透明剂，d.石蜡不纯。
④包埋箱中的温度必须保持恒定。
⑤如包埋得不好，可将蜡块溶化，重新浸蜡和包埋。
⑥较小的组织可在脱水透明时开始用伊红染色
六、石蜡切片制备
（一）石蜡切片前的准备
1．切片刀。传统的切片刀在使用之前，一定要在显微镜下检查刀口的损伤程度，然后进行磨刀。现在也可以使用一次性刀片，可省去磨刀。
2．修整蜡块：切去组织周围过多的石蜡，一般情况下在组织周围留有约1~2mm的石蜡边，两边必须平行。
3．蜡块固定：修整好的蜡块先固定在事先准备好的小方木块或者金属块上，固定方法是把蜡铲先在酒精灯上加热，再将蜡块底部烙熔，迅速烙粘在小方木块或金属块底座上。
4．载玻片擦洗干净后，在其表面涂上粘附剂（蛋白甘油、APES或多聚赖氨酸），根据染色方法选择不同的粘附剂。
5．准备好毛笔、镊子、染色架。
6．调好展片器内水的温度（45℃），有时也可以加些酒精到水中。
（二）石蜡切片
1．将切片刀装在刀片机的刀架上并固定紧，固定蜡块底座或蜡块，调整蜡块与刀至合适位置，刀刃与蜡块表面呈5度角。
2．切片多使用轮转式切片机，切片时，左手执毛笔，右手转切片机转轮，先修出组织块。
3．调整切片机上的切片厚度为4~7µm，然后切片。
4．切片可以是单张，也可以是连续切片形成蜡带
5．展片和捞片：
（1）直接展片法：在载玻片上滴加几滴蒸馏水，然后把切片铺在小滴上面，用酒精灯在载玻片下面加热，待完全展平，倾斜载玻片，倒弃多余水分，同时摆正切片。
（2）温水漂浮法：此法用展片机或者用恒温水浴箱，先使水温保持在45~50℃，用左手拿毛笔轻轻托起切片，用右手用眼科镊子夹起切片的一角，正面向上轻轻平铺放置于展片器的
水面上，动作要轻快，切好的石蜡切片漂浮在温水中受热后及在表面张力的作用会自然平整地展开，必要时可用眼科镊轻轻拔开，然后捞片，并及时编号。
6．展好的切片在室温下稍微干燥后，放在40℃恒温烤箱中，小片组织30分钟即可，大的需12~24小时，烤干备用。
（三）注意事项
1．切片刀刃倾斜过大或过小都不能正常进行切片。
2．修整蜡块时要细心，看清楚组织在蜡块中的位置，以免将需要的组织修掉。
3．连续转动切片机的转轮时，速度一定要均匀，不能时快时慢，以免切片厚薄不一。
4．使用轮转式切片机切片时，是由下向上切，为得到定然整的切片，防止组织出现刀纹裂缝，应将组织硬、脆难切的部分放在上端，如皮肤应将表皮部分向上，肠胃等组织应将浆膜面面朝上。
5．用展片器展片时，水温应根据使用的石蜡熔点进行了调整，一般低于石蜡熔点10~15℃；捞片的时候动作要轻、稍快。动作太大容易出现气泡。如果没有展片器可以用温水浴锅来代替。
6．单个切片要摆到载玻片的1/3与2/3交界处；连续切片的粘片顺序一般是从左到右，组织切片较小是，可以并列粘贴2~3条蜡带。
7．烤片的温度不宜过高；烤片的时间要合适。脑组织要待稍微晾干一些后，才能烤片，否则容易产生气泡影响染色和观察。
七、H-E染色
（一）步骤
1．脱蜡
二甲苯I 10分钟
二甲苯II 5分钟
2．水化
100%酒精I 5分钟
100%酒精II 5分钟
95%酒精I 5分钟
95%酒精II 5分钟
85%酒精 3分钟
75%酒精 2分钟
蒸馏水冲洗 1分钟
3．染色
苏木精染色 5分钟
自来水洗
盐酸酒精分化 15秒
自来水洗（镜检）
自来水洗 15分钟
蒸馏水洗 2分钟
75%酒精 2分钟
85%酒精 2分钟
0.5%伊红染色 1分钟
95%酒精I 5分钟
95%酒精II 5分钟
100%酒精I 5分钟
100%酒精II 5分钟
二甲苯I 5分钟
二甲苯II 5分钟
4．封片
中性树胶封片
上述处理好的玻片，取中性树胶滴入载玻片的组织上，取盖玻片从一端逐步盖下去，避免发生气泡
（二）注意事项
1．染色之前一定要了解清楚所用的染色液的配制方法，不同的染色液染色后的处理是不一样的。
2．染色过程中所用的时间要根据染色时的室内温度、染液的新鲜程度及实验室的实际情况等灵活掌握。在室温高、切片、染色液又是新配制的，染色时间就要短，反之时间就长。
3．伊红有水溶的和醇溶的，如果用的是水溶的，应该在脱水前进行染色，如果是醇溶的，应使用与溶解伊红等浓度的酒精开始脱水。
4．在二甲苯脱蜡之前可以先在60℃烤箱内0.5~1小时，这样可以使切片粘附更牢固不易脱片，也有利于脱蜡。
5．二甲苯在HE染色中有脱蜡、透明的作用。二甲苯脱蜡的好坏主要取决于切片在二甲苯内放置的时间和脱蜡时的温度以及二甲苯的使用次数。染好的切片必须经过透明，有利于显微镜观察，同时并为封片起到了桥梁作用。
6．用梯度酒精脱水时，在低浓度酒精中时间不宜过长，到高浓度时逐步延长脱水时间。以免脱水不彻底，影响二甲苯透明的效果。
7．在酸性分化液内停留的时间不要过长，分化不可过度，避免使细胞核内该染上色的结构脱色。不需分化处理的苏木精染色时要注意掌握染色时间，以防止组织切片染色背景过深或细胞核、胞质染色不足。
石蜡切片制备基本步骤
一、准备工作
（一）洗涤实验所需器皿：（玻璃器皿的清洗）
1、 用洗衣粉将玻璃器皿表里擦洗干净反复洗刷
2、 将器皿在自来水下冲洗干净
3、 将器皿倒扣在铺有吸水纸或纱布的桌子上控干
注：一般情况下，经以上步骤后，用蒸馏水洗过1~3次即可烘干备用，如果做特殊染色还需浸泡在酸性清洁液内12~24小时，再经自来水彻底冲洗，再用蒸馏水过洗1~3次 烘干备用。
（二）配制： 硫酸洗液的配制
清洁液（洗液）的配制：
成分 强酸液 次强酸液 弱酸液
浓硫酸（ml） 1000 200 100
重铬酸钾（mg） 63 120 100
蒸馏水 （ml） 200 200 1000
重铬酸钾 1200g
蒸馏水 2000ml
将2000ml浓硫酸缓缓倒入上述溶液中，边倒边用木棒轻轻搅拌
（三）载玻片与盖玻片的处理
1. 将所需载玻片与盖玻片清洗后，放入硫酸重铬酸钾溶液中浸泡24小时
2. 流水冲洗，再用蒸馏水冲洗3遍
3. 95%~100%酒精浸泡24小时，用绸布擦干备用
注：在将载玻片与盖玻片放入清洁液中时，要一片片地投入，使其不致重叠。
二、常用液体的配制
（一）缓冲溶液：
1．磷酸盐缓冲液
A液：0.1mol/L磷酸二氢钠
B液：0.1mol/L磷酸氢二钠
A液与B液按比例混合调整到所需的PH值（3：7≈PH7.0）
2．枸椽酸缓冲溶液
A液：0.1mol/L枸椽酸
B液：0.1mol/L枸椽酸钠
A液与B液按比例混合调整到所需的PH值（6.2：42.8≈PH6.2）
（二）固定剂：
1．甲醛：10%甲醛
福尔马林 100ml
蒸馏水 900ml
注：实际甲醛含量只有3.6~4.0%但习惯上都将其视为10%。
2．10％中性福尔马林钙固定液
甲醛液 10ml
蒸馏水 90ml
加碳酸钙至过饱和(以容器底部碳酸钙沉淀1~2cm厚为适度)充分振荡混合后，放置24小时取上清液使用。
3．4%多聚甲醛：
8%多聚甲醛
多聚甲醛 8g
蒸馏水 100ml
加温至60℃左右，不时搅拌，成为乳白色溶液。滴加1N NaOH，并不停搅动至液体清明。 1N NaOH
lN等于1L溶液中某种物质1mol除以该物质的氢当量价所得数值的量
氧化钠(NaOH )；分子量＝40．005，当量价＝1
1N Na0H的配制方法为：m＝40．005／1＝40．005g。取40．005gNaOH溶解于1L蒸馏水中
4%多聚甲醛
8%多聚甲醛 50ml
0.1M磷酸盐缓冲液 50ml
PH7.2
先取50 ml 8%多聚甲醛，用0.1M磷酸二氢钠和0.1M磷酸氢二钠将PH值调至7.2
4．Bouin液：
苦味酸饱和水溶液 75ml
36％~40％福尔马林液 25ml
冰醋酸 5m1
5．改良Bouin氏固定液
苦味酸饱和水溶液 45ml
95%酒精 45ml
36％~40％福尔马林液 5ml
冰醋酸 5m1
6．Carnoy液：
冰醋酸 10 m1
氯仿 30 m1
无水乙醇 60 m1
以上三者临用前混合，预冷至4℃后使用。24小时后固定液失效。
（三）染色液
1．Harris苏木精液
A液：
苏木精 1g
无水酒精 10ml
B液：
铵矾或钾矾 20g
蒸馏水 200ml
氧化汞 0.5ml
冰醋酸 8ml
将矾溶于水，加热溶解（B液），稍冷后将苏木精酒精液（A液）混入B液，加热，稍冷却，加氧化汞，再继续加热1分钟，染液变为紫色，注意在加氧化汞时宜逐渐少量加入，防止染液溅出。全冷后呈深紫色，将烧杯口用纱布盖好，隔夜过滤，在过滤液内每96 ml中加4 ml冰醋酸，放置1周后成熟，即可用于染色，保存期1~2个月。此染液在加醋酸后，对核染色特具选择性，故很适于脱落细胞的核染色。由于染液内已加有氧化剂，故不能长期储存，但利于配后即用。
2．Mayer苏木精掖
苏木精 1g
钾矾或铵矾 50g
碘酸钠 0.2g
蒸馏水 1000ml
水合氯醛 50g
枸橼酸 1g
将苏木精，钾矾及碘酸钠依次加入水内，略加热并搅拌，此时液体呈蓝色，待全溶后过夜。再加入水合氯醛及枸橼酸并加热至煮沸5分钟，冷后过滤备用。如不急用可不煮沸而在室温待其成熟，染液可较长期贮存使用。核染色鲜明，染色时间5—10分钟。用该染液染色后，不需分化，充分水洗蓝化后即可，伊红复染细胞质，使用一段时间后就要换新溶液。
3．Hasnsen甲矾苏木精的配制
A液：苏木精 1g
无水乙醇 10ml
B液：钾矾 20g
蒸馏水 200ml
C液：高锰酸钾 1g
蒸馏水 16ml
三液分别溶化后，将A液倒入B液，再加入C液3ml，充分搅拌均匀后加热至沸腾，1分钟左右，将容器置于冷水中使其迅速冷却，此液配后即可使用，染后无需碱化，细胞核即为蓝色，效果较好，高锰酸钾可以迅速氧化苏木精（每1g苏木精需0.177g高锰酸钾氧化）。
4．伊红
0.5~1%水溶液或酒精溶液。
1．水溶性伊红
伊红 5~10g
蒸馏水 1000ml
冰醋酸 10滴
先将水溶性伊红加入蒸馏水中，用玻璃棒搅起泡沫后过滤，再加冰醋酸。
2．醇溶性伊红
伊红 5~10g
70%~90%酒精 1000ml
冰醋酸 10滴
（四）其它
1．麻醉剂：
2~4%戊巴比妥钠，1ml/kg体重（45mg/kg）。
2．各级浓度酒精的配制
75%；85%；95%；100%酒精。75%和85%酒精用95%酒精配制；（取75ml95%酒精，加水至95ml，即为75%酒精）
3．盐酸洒精
多用于多种染色过程中的分色，如苏木精染色后分色。配法是在100ml的70％酒精内加0.5~1ml的浓盐酸(Hcl)。用盐酸酒精分色后要经自来水充分冲洗组织切片，去除所含的酸再作其他处理。
4．碘酒
取碘5g，溶于95％酒精80ml，再加入20ml蒸溜水即成
5．生理盐水
以氯化纳0.85~0.90g溶于100m1蒸馏水配成的生理盐水适用哺乳动物
石蜡切片制备基本步骤 之二
三、取材，固定
（一） 实验动物的抓取及固定
1．小白鼠、大白鼠的抓取及固定方法
要点：（1）动作要轻缓；（2）不要突然袭击；（3）如发现动物的毛发竖起来时，最好停一会后再抓；（4）将四肢打开，固定在木板或方形蜡板上。
2．实验家兔的抓取及固定方法
要点：（1）随时抚摩其头部；（2）防止被其脚爪抓伤；（3）根据实验要求选择固定方法。
3．豚鼠的抓取及固定方法
要点：先用一只手扣住豚鼠背部，然后抓紧两耳间头颈部的皮肤，用另一只手托起臀部送到动物固定台上。
（二） 实验动物的编号、标记、分组和被毛去除方法
1．编号和标记方法
（1）染色法
标记溶液：3%~5%苦味酸 黄色
2%硝酸银 咖啡色（涂后光照10分钟）
0.5%中性红或品红 红色
龙胆紫 紫色
编号原则：先左后右，从前到后
左前脚为1，左侧腹为2，左后腿为3，头顶为4，腰背部为5，尾基为6，右前脚为7，右侧腹为8，右后腿为9。超过10可用不同的染色的标记液，一种染色为个位，另一种为十位数。
（2）挂牌法
（3）耳孔法
一般来说，小型动物适宜用耳孔法和染色法，中型动物适用于挂牌法。
2．实验动物的随机分组方法
动物实验时，常常需要将选择好的实验动物，按研究需要分成若干个组，分组时为了避免人为因素的影响，常应用随机数字表进行完全随机化的分组。
3．实验动物被毛去除方法
剪毛法
拔毛法
剃毛法
脱毛法：系用化学脱毛剂将实验动物被毛脱去，适用于无菌手术野的准备以及观察动物皮肤血液循环和病理变化。方法：将需脱毛部位的被毛先用弯头剪刀剪去，尽量剪短，勿剪破皮肤。然后用温水将该部位润湿，再用纱布包扎棉球的小棒蘸脱毛剂，在需脱毛部位涂一层，经2~3min后，用温水洗去该部位脱下的毛，自然晾干备用，切勿用纱布去擦，以免损伤皮肤。
脱毛剂配方：
（1）硫化钠3g
肥皂粉1g
淀粉7 g
加水适量调成糊状
（2）硫化钠8g
溶于100ml水中
（3）硫化钠8g
淀粉7 g
糖4 g
甘油5 g
硼砂1 g
加水75ml
（三） 实验动物处死
处死动物的方法很多，无论是采用哪种方法，都要尽力避免使动物长时间陷于痛苦和濒于死亡状态。热爱生命，珍爱动物。
1．空气栓塞致死法
要点：（1）常用于大的动物（如：兔、猫、狗和猴等）；（2）用50~100ml注射器一只；（3）此方法迅速、方便，但各脏器淤血明显。
2．麻醉后处死法
注：采用此方法，取材后一定要确定动物是否已死亡，最好再行断颈。
（1）吸入麻醉法
要点：（1）适用于较小的动物（小白鼠、大白鼠、豚鼠和兔等）；（2）用乙醚浸泡过的脱脂棉；（3）时间大约1~2分钟；（4）注意防火
（2）注射麻醉法
要点：（1）适用范围较广；（2）注射方式可采用静脉、腹腔、皮下和肌内注射，最常用的是腹腔注射；（3）注射致死量一般视动物大小而定。
3．脑、脊破坏法
要点：（1）常用于蛙类；（2）用金属针经枕骨大孔进入，破坏大脑和脊髓。
4．断头处死法
要点：（1）常用于小动物；（2）用剪刀剪断颈椎；（3）如果没有特殊要求，最好不要使头和躯干分离。
5．断椎法
要点：（1）常用于大白鼠和小白鼠；（2）一手固定头部，一手拽住实验动物的尾部，轻轻一拉扯断其颈椎，使其脱位，椎管内急性损伤瘫痪或死亡后取材；（3）此方法处死动物组织结构保存较好。
（四） 实验动物解剖
解剖步骤
1．实验动物被麻醉或处死后，将其；固定在动物解剖台上，用纱布蘸取生理盐水湿润被毛；
2．从下颌至耻骨联合沿正中线切开皮肤；
3．打开腹腔：沿肋骨下缘腹正中，用镊子提起腹壁切开腹壁肌肉，至耻骨联合，从肋骨下端向脊柱方向，将两侧腹壁剪开，充分暴露腹腔内脏器；
4．打开胸腔：用剪刀沿肋骨的肋软骨和骨的连接处由下向上剪开，不要剪断锁骨，剪时应尽量贴着胸内壁，并注意不要剪断胸骨两侧的大血管。然后将肋弓提起，暴露腹腔内脏器。
（五） 取材
取材一定要迅速，应在动物处死后立即进行解剖和切取组织材料，否则会引起细胞发生死后变化（如组织自溶及腐败现象等），进而失去原有的结构，如果进行酶组化染色，将会使大量的酶失活和丢失。
取材方法和注意事项
（1）取材用的刀剪必须锋利，取材时应用镊子夹该组织的周围的结缔组织，凡是用镊子夹过的或用手压过的组织均不可用。
（2）根据实验要求选择不同的取材方法（整体取出脏器法、单个脏器取出法和切取组织块法等）
（3）取材的先后顺序原则。根据死后组织结构改变的速度的快慢而定。先腹腔后胸腔，先消化管后肝、脾等多血的器官及神经组织。
（4）取材组织块的大小既要保证组织的完整性，又要力求小而薄，一般以1.0cm×1.0cm×0.5cm为好，但有些特殊要求的可视情况而定。
（5）较小的组织或器官（淋巴结、松果体、脑垂体和神经节等）应整体固定，但要破坏其表面一侧的被膜。
（6）管状及囊状组织（消化管的取材）都不应斜切，先将一段肠管或食管剪下，从中剪开管腔，使之成片状，然后将其铺在纸板下，黏膜面朝上，用大头针或细线将四边固定，用生理盐水漂洗黏膜表面，然后固定。
（7）较细的管状脏器（输尿管、输精管、输卵管、中动脉和静脉等）应取下1~2cm长，平铺于硬纸片上或吸水纸上分段固定。
（8）取材要尽量注意脏器的完整性。
（9）应根据所要观察的部位及实验目的进行选择组织的切面。对于病理材料，除切取病变部位外，还要切取病变和正常组织交界部分的区域，以利于进行正常组织与病理组织的对比观察分析。
（10）取材时要注明取材时间、组织器官名称、固定液名称、组织块的数量、所取组织位于器官的部位等，以备查。
（六） 固定
1．固定的目的
（1）防止组织溶解及腐败，以保持组织和细胞与正常生活时的形态相似；
（2）使细胞内蛋白质、脂肪、糖、酶等各种成分转变为不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时的相仿；
（3）组织细胞内的不同物质经固定后可以产生不同的折光率，对染料也产生不同的亲和力，造成光学上的差异，使得在生活情况下原来看不清楚的结构变得清晰起来，并使得细胞各部分容易着色，有利于区别不同的组织成分。
（4）固定剂的硬化作用，增加组织硬度，便于制片。
2．固定的对象和方法
（1）固定的主要对象是蛋白质；
（2）固定液的量要足够，其固定液的量一般不少于组织总体积的10倍以上（一般为1：20）。对于某些需要制作神经染色和酶组织化学染色的组织固定，比一般的固定要严格。
（3）特殊的固定方法（注射或灌注固定）：某些组织块由于体积过大或固定液极难渗入内部或需要对整个脏器或整个动物进行固定，宜采用此方法，将固定液注入血管，经血管分支到整个组织和全身，从而得到充分固定。
①局部灌注固定：
肺：肺内含有空气，固定难以渗入，可将固定液从气管、支气管或肺动脉注入固定液，从支气管注入时速度一定要慢，量不宜过多。注射固定后可将整个肺投入固定液中6~12小时，再分别切成小块。
肝、肾：经肝动脉或肾动脉注入固定液。
脑：动物麻醉后暴露颈动脉，以注射针尖向着关部的方向注入固定液。
②全身灌注固定：
步骤：取大白鼠，1%戊巴比妥钠麻醉，打开胸、腹腔，纵向切开心包，用纱线在主动脉弓起始部，然后用50ml注射器，选用适当针头，从左心室向主动脉方向刺入，将纱线扎紧固定，在右心房开一孔放血，取用与动物等量的生理盐水注入血管中洗涤，待洗涤处的液体不见血时，再注入固定液。待动物体有一定硬度时即可取材，将所需组织从动物身上切去后，经适当处理，即投入固定液中（甲醛或多聚甲醛）
3．固定液的性质和条件
（1）能迅速渗入组织，使组织细胞形态在短期内不至于有较大变化。
（2）固定液有相当的渗透力，对组织各部分的渗透力相等，可使组织内外完全固定。
（3）使组织细胞不至于因固定而引起人为的改变。
（4）尽可能避免固定剂使组织膨胀或收缩。
（5）使组织达到一定硬度，获得较佳的折光率和对染料具有较强的亲合力。
4．固定时应注意的事项
（1）固定液及被固定的组织必须新鲜；
（2）固定液的用量一般为组织体积的10~20倍，容器不要过小，材料也不要太多；应避免组织紧贴瓶底或瓶壁，以免影响固定液的渗入，必要的时候可以在瓶底垫上一层棉花；
（3）固定时间视组织块的种类、性质、大小，固定液的种类、性质、渗透力的强弱，固定时的温度的高低，实验目的等；
（4）防止被固定的组织因固定剂的作用而发生变形；
（5）固定所用的固定液，以新配的为好，放置过久会失效；
（6）在固定期间摇动组织或摇动容器有利于固定液的渗入，对长期固定的标本，可经常更换固定液
（7）取材固定应同时作好记录，包括组织名称、固定液和时间等内容。
5．固定剂
单纯固定剂
（1）10%甲醛：对组织渗透性强，固定均匀。对组织膨胀约5%，经酒精脱水时有较大的收
缩。能保存脂肪，不能沉淀核蛋白及白蛋白，长期用其固定的组织使组织变为酸性，不利于染色，特别是细胞核的着色。经自来水冲洗6~24小时后，可以使其酸碱中和，并减少结晶。
（2）4%多聚甲醛：对组织穿透性好，组织收缩小，对大多数抗原物质保存较好，特别是对脂肪和各种酶的固定效果更好。固定的时间不宜太长，以24小时以内为宜，适用于免疫组织化学染色。
（3）饱和的苦味酸溶液：能沉淀一切蛋白质，渗透力弱，对组织收缩大，故一般不能单独使用。
（4）冰醋酸：渗透力强，沉淀核蛋白，对染色质固定好，使组织膨胀，故一般不单独使用。
（5）锇酸：价格昂贵，为强氧化剂，易还原成氢氧化锇，呈黑色沉淀；必须避光保存。不能沉淀蛋白质，而使蛋白质凝胶化，所以对蛋白质固定不均匀，锇酸固定的细胞能保持生活时的形态，不收缩细胞，对胞质固定较长好，核的固定不好，锇酸为脂肪及类脂质的优良固定剂，经它固定的脂肪和类脂质呈黑色，特别是对于是显示线粒体和高难度尔基复合体效果良好。
混合固定剂
（1）Bouin氏固定液：为常用的良好的固定剂，穿透速度快，组织收缩性较小，固定均匀，固定后组织有适当的硬度，对于切片和染色均有良好的效果。一般固定12~24小时，固定后入70%酒精洗去苦味酸的黄色，在脱水时经各浓度酒精也可洗去黄色，在酒精中加入氨水一滴或少许碳酸钾饱和水溶液，可加快洗去苦味酸的黄色即使留有少量苦味酸的黄色，对一般染色体并无影响。
（2）Zenker液（PH2.3）：此液多用于一般组织的固定，它能使细胞核、细胞质染色清晰但固定时间长，一般要12~36小时，加热可以缩短固定时间。固定后的组织必须流水冲洗12小时，由于固定中含有升汞，在经70%酒精脱水时，加少量的碘液（0.5%碘酒精）以脱汞。
（3）Carnoy液：渗透力强，特别适宜于固定染色体、肝糖、粘液等一些较为细微的结构。显示DNA、RNA效果良好。
（4）改良Bouin氏固定液：此液对一般组织固定效果都很好，固定时间为4~18小时，固定后直接放70%乙醇脱水，固定时间较长对组织亦无损害。
（七） 组织块修整
固定后的组织块可能会在外部形态上有些改变，或者由于组织在还未固定时就取材，组织器官较软，取材不容易切平。经固定后的组织有一定的硬度，此时就可以做一些修整，但改变不要太大，只是将组织材料切取平整，修掉一些不规则的部位。修整组织块时，手术切片一定要锋利。
四、水洗
1．目的：
洗去渗入组织中的固定液，终止固定。以免影响对组织内结构的观察、分析和研究。
2．原则和方法：
固定后的组织块的冲洗，一般情况下是置水龙头下以自来水流水冲洗，这样可以使组织中的固定液随时溢出，洗得更干净彻底，有些还需要进行特殊的洗涤。
（1）各种以水配制的固定液如甲醛，都必须用流水冲洗，大块组织一般冲洗24小时，小块组织一般冲洗2—10小时。
（2）固定液为多聚甲醛时，用于免疫组织化学等特殊染色的应将组织投入PB缓冲液中，每60分钟更新洗涤液一次，累计6小时。
（3）固定液为酒精或是酒精混合液，一般不需用水冲洗，其组织块的洗涤应用与固定液浓度相等垢酒精换洗或者直接进行脱水的程序。
（4）用锇酸或含有锇酸的固定液固定的组织，必须用流水彻底冲洗干净。
（5）经含有苦味酸的固定液固定的组织块，无论其固定液是水溶性还是酒精溶性，都应充分冲洗，水溶性固定液固定的组织块一般须冲洗12小时，再进入70%的酒精溶液洗涤，酒精溶性固定液固定的组织块直接进入70%的酒精溶液洗涤，该溶液可以脱掉苦味酸的黄色，但最好从50%酒精开始洗涤。
（6）冲洗好的组织可存放在75%酒精内
五、脱水包埋
（一）脱水
1．脱水的目的
组织内的水不能和支持剂混合，所以必须把组织中的水分彻底脱除。脱水有利于组织的透明和浸蜡，有利于组织的永久保存。
2．脱水剂
（1）乙醇：可作固定剂，又可脱水剂，但乙醇与水混合时有较剧烈的物理反应。高浓度的酒精对组织有强烈收缩及脆化的缺点，因此用乙醇脱水不能直接入纯酒精中脱水，而必须经过由高到低的一系列不同浓度的酒精，逐渐取代组织中水分，以保证组织脱水彻底，并避免组织过度收缩和硬化。
（2）丙酮：脱水能力比酒精强，但对组织的收缩更大，在组织学制片中较少使用，多用于病理快速切片，或用于某些组化水解酶的固定。
（3）正丁醇：是较好的脱水兼透明剂，可与酒精及石蜡混合，用于脱水是可先经过各种不同浓度的正丁醇和乙醇混合液，再入正丁醇，进行石蜡包埋时，可先用正丁醇和石蜡等量混合液，然后浸入纯石蜡包埋，正丁醇用于脱水的优点是很少引起组织收缩和脆硬，可替代二甲苯，是很好的脱水剂，但由于价格较贵，不常使用。
3．步骤
（1）乙醇脱水过程
50%乙醇 6~8小时
75%乙醇 6~8小时
85%乙醇 3~5小时
95%乙醇 1~2小时
95%乙醇 1~2小时
100%乙醇Ⅰ 1小时
100%乙醇Ⅱ 1小时
（2）丙酮脱水
如果是丙酮固定的组织，则不必再经过乙醇，可以用新丙酮更换一次，便直接浸入二甲苯或苯中透明。其他水溶液固定的组织，均按上述乙醇脱水方法脱水，亦可由100%乙醇中移入丙酮继续脱水2~4小时再入二甲苯透明，透明后浸蜡包埋。
（3）正丁醇脱水
组织用正丁醇脱水前，先经50%乙醇脱水，然后移入正丁醇和乙醇混合液进行脱水。 50%乙醇 6~12小时
50%乙醇+20%正丁醇+30%蒸馏水 5~8小时
50%乙醇+35%正丁醇+15%蒸馏水 4~6小时
45%乙醇+45%正丁醇+10%蒸馏水 3~5小时
25%乙醇+75%正丁醇 2~3小时
25%乙醇+75%正丁醇 1~2小时
15%乙醇+85%正丁醇 1~2小时
5%乙醇+95%正丁醇 1~2小时
100%正丁醇Ⅰ 1小时
100%正丁醇Ⅱ 1小时
4．注意事项：
（1）脱水的过程应逐步地而不应骤然地进行，不能操之过急。
（2）脱水的时间应根据组织块的大小和组织的类型而定。
（3）组织块在高浓度，特别是无水乙醇内不能放置的时间太长。无水乙醇吸水能力太强，容易造成组织块的过度硬化，使得切片理组织易碎裂。
（4）在脱水的过程中可以将组织块停留在70%~80%的酒精中。
（5）每次更换新的脱水剂时（组织块从低浓度到高浓度），都要把组织块放在吸水纸上吸干，装组织块的容器也要控干水分，以免将水及低浓度脱水剂带入高浓度脱水剂中，影响脱水效果。
（6）脱水剂的先择要根据实验的要求及实验室的条件
（二）透明
1．透明的目的
置换组织内的脱水剂，为下一步的浸蜡起到桥梁作用；
使组织呈现不同程度的透明状态，有利于光线的透过。
2．透明剂
（1）二甲苯：是现在应用最广的一种透明剂，价格较便宜，不能和水混合，遇水则变成乳白色浑浊，因此必完全脱水后才能使用；易溶于酒精又能溶解石蜡，透明力强；其最大的缺
点是容易使组织收缩变硬变脆，所以组织不能在其停留过久，透明时间视组织块的大小、性质而定；有的组织如肌肉、肌腱、软骨、骨、皮肤、头皮及眼球等，不宜用二甲苯透明，因组织过硬不易切片；长时间接触，对粘膜有刺激作用。
（2）苯：性质与二甲苯相似，对组织收缩也较小，组织也不易变脆，但透明较慢，组织在其内可以滞留12~24小时，但毒性较大。
（3）香柏油：用为透明剂，效果很好，有高度透明作用，能与醇和二甲苯混合，香柏油对组织的硬化及收缩程度比任何其他透明剂都要小，但透明的速度较慢，3mm以下厚度的组织块需12小时以上。香柏油与石蜡不易融合，即香柏油不易被石蜡取代，因此经香柏油透明以后，可经过二甲苯短时间媒浸，再进行石蜡包埋。肌肉、皮肤、血管、膀胱、垂体及肾上腺等用香柏油效果较好。
3．二甲苯的步骤：两次透明
第一次透明约40分钟
第二次时间不一定，要视透明效果而定
4．注意事项
（1）时间不宜过长，否则组织会变脆；
（2）组织块脱水必彻底。
（三）浸蜡、包埋（石蜡包埋法）
1．浸蜡
（1）浸蜡的目的
置换组织中的透明剂，为包埋做准备。
（2）浸蜡的步骤
在60度恒温蜡箱中放置3个蜡杯，分别编号1（52℃~54℃）、2（52℃~54℃，或54℃~56℃）、3（56℃~58℃），其中分别盛软蜡、软蜡、硬蜡，取透明好的组织块放入软蜡中各1小时，迅速取出放入硬蜡，同样放置1小时。如果时间来及包埋，可以将已经完成浸蜡的组织块取出放在温箱外，第二天继续。
（3）注意事项
温箱中的温度必须严格控制在60℃的范围，不能超过60℃；浸蜡时间不宜过长。浸蜡温度过高或时间过长使组织收缩过度收缩和脆变。
2．包埋
（1）步骤
①准备包埋蜡：一般应用硬蜡（56~58℃或60~62℃）为好，所用的石蜡要求透明无杂质，新的石蜡要反复熔凝，并有一定的粘韧性，可以加一些蜂蜡。蜡的熔点应与组织的硬度相适应。包埋用过的石蜡可以反复使用。
②准备包埋框：可以用金属的，也可以用硬纸摺叠。
③点燃酒精灯，准备好无齿尖镊子，需作标记应先写好标签。
④在金属框中倒入硬蜡，然后用无齿镊子取组织块放入石蜡中，置好方向。可室温下冷却。 ⑤包埋框或纸盒内的蜡逐渐凝结，若表面已凝结形成一层固体状，即可放入冷水中，加速其
凝固。
⑥待蜡块完全凝固以后，便可拆卸包埋框架， 或拆开纸盒，取出蜡块。
（2）注意事项
①包埋时夹取组织的镊子，用酒精灯随时烧热，以免石蜡凝结后粘附在镊子上，造成蜡块凝固不均匀。
②包埋操作要迅速，组织从浸蜡杯中取出置入包埋框中的时间应尽量缩短。
③包埋后的蜡块应呈均质半透明状，如果出现白色混浊状，一般出现在组织周围或组织的底部，应考虑这样几个方面的问题：a. 脱水不彻底。b.包埋蜡温度低了，组织进行包埋时，包埋框中的蜡已成凝结状。c.组织内还残留有较多的透明剂，d.石蜡不纯。
④包埋箱中的温度必须保持恒定。
⑤如包埋得不好，可将蜡块溶化，重新浸蜡和包埋。
⑥较小的组织可在脱水透明时开始用伊红染色
六、石蜡切片制备
（一）石蜡切片前的准备
1．切片刀。传统的切片刀在使用之前，一定要在显微镜下检查刀口的损伤程度，然后进行磨刀。现在也可以使用一次性刀片，可省去磨刀。
2．修整蜡块：切去组织周围过多的石蜡，一般情况下在组织周围留有约1~2mm的石蜡边，两边必须平行。
3．蜡块固定：修整好的蜡块先固定在事先准备好的小方木块或者金属块上，固定方法是把蜡铲先在酒精灯上加热，再将蜡块底部烙熔，迅速烙粘在小方木块或金属块底座上。
4．载玻片擦洗干净后，在其表面涂上粘附剂（蛋白甘油、APES或多聚赖氨酸），根据染色方法选择不同的粘附剂。
5．准备好毛笔、镊子、染色架。
6．调好展片器内水的温度（45℃），有时也可以加些酒精到水中。
（二）石蜡切片
1．将切片刀装在刀片机的刀架上并固定紧，固定蜡块底座或蜡块，调整蜡块与刀至合适位置，刀刃与蜡块表面呈5度角。
2．切片多使用轮转式切片机，切片时，左手执毛笔，右手转切片机转轮，先修出组织块。
3．调整切片机上的切片厚度为4~7µm，然后切片。
4．切片可以是单张，也可以是连续切片形成蜡带
5．展片和捞片：
（1）直接展片法：在载玻片上滴加几滴蒸馏水，然后把切片铺在小滴上面，用酒精灯在载玻片下面加热，待完全展平，倾斜载玻片，倒弃多余水分，同时摆正切片。
（2）温水漂浮法：此法用展片机或者用恒温水浴箱，先使水温保持在45~50℃，用左手拿毛笔轻轻托起切片，用右手用眼科镊子夹起切片的一角，正面向上轻轻平铺放置于展片器的
水面上，动作要轻快，切好的石蜡切片漂浮在温水中受热后及在表面张力的作用会自然平整地展开，必要时可用眼科镊轻轻拔开，然后捞片，并及时编号。
6．展好的切片在室温下稍微干燥后，放在40℃恒温烤箱中，小片组织30分钟即可，大的需12~24小时，烤干备用。
（三）注意事项
1．切片刀刃倾斜过大或过小都不能正常进行切片。
2．修整蜡块时要细心，看清楚组织在蜡块中的位置，以免将需要的组织修掉。
3．连续转动切片机的转轮时，速度一定要均匀，不能时快时慢，以免切片厚薄不一。
4．使用轮转式切片机切片时，是由下向上切，为得到定然整的切片，防止组织出现刀纹裂缝，应将组织硬、脆难切的部分放在上端，如皮肤应将表皮部分向上，肠胃等组织应将浆膜面面朝上。
5．用展片器展片时，水温应根据使用的石蜡熔点进行了调整，一般低于石蜡熔点10~15℃；捞片的时候动作要轻、稍快。动作太大容易出现气泡。如果没有展片器可以用温水浴锅来代替。
6．单个切片要摆到载玻片的1/3与2/3交界处；连续切片的粘片顺序一般是从左到右，组织切片较小是，可以并列粘贴2~3条蜡带。
7．烤片的温度不宜过高；烤片的时间要合适。脑组织要待稍微晾干一些后，才能烤片，否则容易产生气泡影响染色和观察。
七、H-E染色
（一）步骤
1．脱蜡
二甲苯I 10分钟
二甲苯II 5分钟
2．水化
100%酒精I 5分钟
100%酒精II 5分钟
95%酒精I 5分钟
95%酒精II 5分钟
85%酒精 3分钟
75%酒精 2分钟
蒸馏水冲洗 1分钟
3．染色
苏木精染色 5分钟
自来水洗
盐酸酒精分化 15秒
自来水洗（镜检）
自来水洗 15分钟
蒸馏水洗 2分钟
75%酒精 2分钟
85%酒精 2分钟
0.5%伊红染色 1分钟
95%酒精I 5分钟
95%酒精II 5分钟
100%酒精I 5分钟
100%酒精II 5分钟
二甲苯I 5分钟
二甲苯II 5分钟
4．封片
中性树胶封片
上述处理好的玻片，取中性树胶滴入载玻片的组织上，取盖玻片从一端逐步盖下去，避免发生气泡
（二）注意事项
1．染色之前一定要了解清楚所用的染色液的配制方法，不同的染色液染色后的处理是不一样的。
2．染色过程中所用的时间要根据染色时的室内温度、染液的新鲜程度及实验室的实际情况等灵活掌握。在室温高、切片、染色液又是新配制的，染色时间就要短，反之时间就长。
3．伊红有水溶的和醇溶的，如果用的是水溶的，应该在脱水前进行染色，如果是醇溶的，应使用与溶解伊红等浓度的酒精开始脱水。
4．在二甲苯脱蜡之前可以先在60℃烤箱内0.5~1小时，这样可以使切片粘附更牢固不易脱片，也有利于脱蜡。
5．二甲苯在HE染色中有脱蜡、透明的作用。二甲苯脱蜡的好坏主要取决于切片在二甲苯内放置的时间和脱蜡时的温度以及二甲苯的使用次数。染好的切片必须经过透明，有利于显微镜观察，同时并为封片起到了桥梁作用。
6．用梯度酒精脱水时，在低浓度酒精中时间不宜过长，到高浓度时逐步延长脱水时间。以免脱水不彻底，影响二甲苯透明的效果。
7．在酸性分化液内停留的时间不要过长，分化不可过度，避免使细胞核内该染上色的结构脱色。不需分化处理的苏木精染色时要注意掌握染色时间，以防止组织切片染色背景过深或细胞核、胞质染色不足。