・424・. 21, N o . 4Ch inese Journal of R eparative and R econstructive Surgery , A p ril 2007, V o l
・技术革新・
兔肌腱组织石蜡切片的制备
鄂群1 朱蓓2 王东林1
【摘 要】 目的 探索在动物实验条件下一种兔肌腱的石蜡制片方法。 方法 经手术分别获取新西兰大白兔1～3趾的趾深屈肌腱。左侧后肢为正常组, 切取后立即投入改良的4%多聚甲醛中室温固定1d ; 右侧后c m 长左右侧后爪2
肢为实验组, 暴露后爪趾深屈肌腱后, 注射10Λl 腺病毒载体, 术后第3天于注射点切取, 并立即投入改良4%多聚甲醛, 室温固定1d 。流水冲洗过夜后用酒精正丁醇混合液进行梯度脱水, 二甲苯透明, 浸蜡、包埋并切片。烤片后常规脱蜡至水,
H E 染色。 结果 光镜下, 正常组肌腱的胶原纤维束平行而整齐紧密地排列, 束间有沿其长轴成行平行排列的肌腱细
胞, 肌腱外膜可见成排的腱细胞。实验组肌腱外膜有炎性反应性增生, 组织结构完整, 染色鲜艳。 结论 为肌腱形态学方面的实验研究提供了一条新的便捷途径。
【关键词】 肌腱 石蜡切片 腺病毒载体中图分类号:R 2332 R 686 文献标识码:B
近年来肌腱损伤修复方面的研究在创伤外科中仍
是热点之一, 尤其是肌腱在形态学方面的实验研究有广泛的应用。然而肌腱组织比较致密、韧性大、较坚硬, 在制作组织切片, 尤其是石蜡制片时, 如果在制片过程中缺乏恰当处理肌腱组织的方法, 则不易制出合格切片[1, 2]。我们在三种基因治疗载体应用于肌腱的组织反应的实验比较研究形态学中, 成功摸索了一种肌腱的石蜡制片方法, 获得合格的肌腱切片, 报告如下。1 材料与方法1. 1 试剂配制
6
vecto r 52L acZ A d 52L acZ ; 1×10p fu Λl ) , 并用620缝
线在注射点处肌腱表面作一环形标记。术后第3天切取注射点处1c m 的肌腱作为实验组, 并立即投入改良4%多聚甲醛, 室温固定1d 。
1. 2. 2 H E 制片 流水冲洗过夜; 70%酒精正丁醇液(3∶1) ; 80%酒精正丁醇液(4∶1) ; 90%酒精正丁醇液(6∶1) ; 95%酒精正丁醇液(8∶1) ; 95%酒精正丁醇液(9∶1) 各3h ; 无水酒精2h , 共3次; 酒精正丁醇混合液(1∶1) :酒精正丁醇混合液(1∶3) 各3h :正丁醇6h ,
共两次; 二甲苯透明分别作用10、5和5m in ; 68℃浸蜡2h ; 70℃浸蜡1h ; 包埋; 切片; 厚度3～4Λm 。烤片70℃, 2h ; 常规脱蜡至水, H E 染色。2 结果
改良4%多聚甲醛固定液:4%多聚甲醛液95m l +5m l 冰醋酸。软化剂:乙二醇70m l +10%氨水30m l 。
熔点62℃石蜡。
1. 2 操作步骤
1. 2. 1 实验动物准备 新西兰白兔1只由南通大学实验动物中心提供。设左侧后肢为正常组, 右侧后肢为实验组。经3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(30m g kg ) 。手术区备毛, 大腿部止血带控制, 碘伏消毒后进行无菌操作。正常组在兔左后爪的2～3趾掌趾关节稍远端处行约1c m 的纵行切口, 依次切开皮肤、皮下组织及腱鞘, 切除趾浅屈肌腱, 暴露并切取1c m 长的趾深屈肌腱后立即投入改良4%多聚甲醛, 室温固定1d 。将右后爪2～3趾趾深屈肌腱暴露后, 用10Λl 的微量注射器在其内注射10Λl 的腺病毒载体5(adenoviru s
作者单位:1南通大学医学院病理解剖学教研室(江苏南通,
226001) ; 2南通大学附属医院手外科实验室
光镜下正常组切片见肌腱的胶原纤维束平行而整齐紧密地排列, 束间有沿其长轴成行平行排列的肌腱细胞。肌腱外膜可见成排的腱细胞(图1a ～c ) 。实验组肌腱外膜明显增厚, 见大量炎性反应性增生的腱膜细胞, 外膜下为平行排列的腱细胞和胶原纤维, 局灶呈波浪状排列; 组织结构完整, 染色鲜艳(图1d ～f ) 。
3 讨论
①固定剂的作用:改良4%多聚甲醛固定液, 含少量冰醋酸, 可加快固定剂的渗透固定作用和减少肌腱的收缩, 并可符合于特殊染色和免疫组织化学染色的固定要求[3]。②软化剂的作用:肌腱组织脱水不彻底易造成后继染色过程中脱片; 但是, 脱水、浸蜡等过度又会使组织变脆、变硬而不易切片。在实验设置时, 组织处理时间应宁过勿少, 这样石蜡组织可能出现略显脆
通讯作者:王东林, 副教授, 硕士导师, 研究方向:分子病理学,
E 2m ail:donglin@ntu. edu . cn
中国修复重建外科杂志2007年4月第21卷第4期・425・
图1 两组兔肌腱组织切片的HE 染色观察
a 正常组肌腱(×120) ○b 正常组肌腱(×300) ○c 正常组肌腱(×600) ○d 实验组肌腱(×120) ○e 实验组肌腱(×300) ○f 实验组肌腱○(×600)
硬难切片的情况, 我们在实验中专门配制了软化剂, 在切片操作中蘸涂蜡块组织切面, 可即时有效的软化过度脆硬组织, 从而改善和提高切片效果[4]。③正丁醇的作用:在肌腱梯度脱水的试剂配制中, 将常规梯度脱水剂中所含的水分替换为正丁醇, 既可以缓冲酒精对肌腱组织的硬化弊端又保证了脱水效果。在组织结构较为致密的肌腱组织中正丁醇渗透性和脱水能力较酒精弱, 为保证充分的组织脱水, 利用正丁醇不易致使肌腱组织发生过度硬化的特点, 适当增加正丁醇的操作步骤是十分必要的[5]。④组织浸蜡:肌腱组织质地比较韧硬和致密, 试剂浸透较缓慢, 适当设置低温和高温浸蜡程序并延长浸蜡时间, 可保证充分完全的组织浸蜡, 不致造成组织过度脆硬而难以切片或浸蜡不全造成切片和染色困难[6]。⑤实验组的设置:近年来研究表明, 将外源性基因导入损伤的屈肌腱中可能是促进其修复过程的有效方法, 但目前大多数转基因载体因其在靶组织中会引起组织的炎性反应, 应用受到一定的限制。因此关于基因治疗载体应用于肌腱的组织反应成了实验研究的热点, 于是肌腱形态学方面的实验研究也多了起来[7]。然而肌腱组织比较致密、韧性大、较坚硬, 在制作组织切片, 尤其是石蜡制片时, 如果在制片过程中缺乏恰当的处理肌腱组织的方法, 是不易制出合格切片的。我们在平时的工作中比较成功的摸索出了一种具
有实用价值的肌腱的石蜡制片方法。⑥关于A d 52L acZ :我们以前的实验是为了观察三种基因治疗载体应用于肌腱的组织炎性反应, A d 52L acZ 是其中之一, 它是带一段报告基因(L acZ ) 的腺病毒载体, 运用它可以将目的基因导入细胞或组织[8210]。
4 参考文献
[1**********]
吴尧平, 陆裕朴, 石凯军. 无人区肌腱损伤修复的实验研究. 中华医学杂志, 1990, 70(4) :1952197.
吕荣, 杨光. 介绍一种鸡肌腱切片的新方法. 中国修复重建外科杂志, 1996, 10(2) :69.
翁秀琴, 沈武成. 制作H E 染色石蜡切片的关键技术. 医药论坛杂志, 2005, 26(21) :80.
李云. 脆性组织切片的制作技巧和体会. 咸宁学院学报:医学版, 2005, 19(3) :1572157.
田珑, 张卫光. 正丁醇脱水制作肝组织石蜡切片. 解剖科学进展,
2004, 10(2) :190.
郭爱华, 魏淑英, 王斌. 临床病理制片常见问题及解决办法. 中国兽医杂志, 2005, 41(7) :56.
秦宏敏, 佟向阳, 许铁, 等. A d 2T GF Β1重组腺病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞的研究. 中华实验外科杂志, 2006, 23(10) :1256.
张海龙, 黄朝梁. 基因治疗韧带肌腱损伤进展. 创伤外科杂志, 2006, 8(3) :2742277.
岳宇, 刘颖, 李学志. 小标本组织快速石蜡切片的应用. 中国冶金工业医学杂志, 2005, 22(1) :96.
肖剑, 贾连顺, 程岚, 等. 兔腰椎间盘髓核细胞活力测定及外源性基因在其中的表达. 中国临床康复, 2002, 6(20) :302323024.
(收稿:2006206219 修回:2007201223)
(本文编辑:董奇男)
・424・. 21, N o . 4Ch inese Journal of R eparative and R econstructive Surgery , A p ril 2007, V o l
・技术革新・
兔肌腱组织石蜡切片的制备
鄂群1 朱蓓2 王东林1
【摘 要】 目的 探索在动物实验条件下一种兔肌腱的石蜡制片方法。 方法 经手术分别获取新西兰大白兔1～3趾的趾深屈肌腱。左侧后肢为正常组, 切取后立即投入改良的4%多聚甲醛中室温固定1d ; 右侧后c m 长左右侧后爪2
肢为实验组, 暴露后爪趾深屈肌腱后, 注射10Λl 腺病毒载体, 术后第3天于注射点切取, 并立即投入改良4%多聚甲醛, 室温固定1d 。流水冲洗过夜后用酒精正丁醇混合液进行梯度脱水, 二甲苯透明, 浸蜡、包埋并切片。烤片后常规脱蜡至水,
H E 染色。 结果 光镜下, 正常组肌腱的胶原纤维束平行而整齐紧密地排列, 束间有沿其长轴成行平行排列的肌腱细
胞, 肌腱外膜可见成排的腱细胞。实验组肌腱外膜有炎性反应性增生, 组织结构完整, 染色鲜艳。 结论 为肌腱形态学方面的实验研究提供了一条新的便捷途径。
【关键词】 肌腱 石蜡切片 腺病毒载体中图分类号:R 2332 R 686 文献标识码:B
近年来肌腱损伤修复方面的研究在创伤外科中仍
是热点之一, 尤其是肌腱在形态学方面的实验研究有广泛的应用。然而肌腱组织比较致密、韧性大、较坚硬, 在制作组织切片, 尤其是石蜡制片时, 如果在制片过程中缺乏恰当处理肌腱组织的方法, 则不易制出合格切片[1, 2]。我们在三种基因治疗载体应用于肌腱的组织反应的实验比较研究形态学中, 成功摸索了一种肌腱的石蜡制片方法, 获得合格的肌腱切片, 报告如下。1 材料与方法1. 1 试剂配制
6
vecto r 52L acZ A d 52L acZ ; 1×10p fu Λl ) , 并用620缝
线在注射点处肌腱表面作一环形标记。术后第3天切取注射点处1c m 的肌腱作为实验组, 并立即投入改良4%多聚甲醛, 室温固定1d 。
1. 2. 2 H E 制片 流水冲洗过夜; 70%酒精正丁醇液(3∶1) ; 80%酒精正丁醇液(4∶1) ; 90%酒精正丁醇液(6∶1) ; 95%酒精正丁醇液(8∶1) ; 95%酒精正丁醇液(9∶1) 各3h ; 无水酒精2h , 共3次; 酒精正丁醇混合液(1∶1) :酒精正丁醇混合液(1∶3) 各3h :正丁醇6h ,
共两次; 二甲苯透明分别作用10、5和5m in ; 68℃浸蜡2h ; 70℃浸蜡1h ; 包埋; 切片; 厚度3～4Λm 。烤片70℃, 2h ; 常规脱蜡至水, H E 染色。2 结果
改良4%多聚甲醛固定液:4%多聚甲醛液95m l +5m l 冰醋酸。软化剂:乙二醇70m l +10%氨水30m l 。
熔点62℃石蜡。
1. 2 操作步骤
1. 2. 1 实验动物准备 新西兰白兔1只由南通大学实验动物中心提供。设左侧后肢为正常组, 右侧后肢为实验组。经3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(30m g kg ) 。手术区备毛, 大腿部止血带控制, 碘伏消毒后进行无菌操作。正常组在兔左后爪的2～3趾掌趾关节稍远端处行约1c m 的纵行切口, 依次切开皮肤、皮下组织及腱鞘, 切除趾浅屈肌腱, 暴露并切取1c m 长的趾深屈肌腱后立即投入改良4%多聚甲醛, 室温固定1d 。将右后爪2～3趾趾深屈肌腱暴露后, 用10Λl 的微量注射器在其内注射10Λl 的腺病毒载体5(adenoviru s
作者单位:1南通大学医学院病理解剖学教研室(江苏南通,
226001) ; 2南通大学附属医院手外科实验室
光镜下正常组切片见肌腱的胶原纤维束平行而整齐紧密地排列, 束间有沿其长轴成行平行排列的肌腱细胞。肌腱外膜可见成排的腱细胞(图1a ～c ) 。实验组肌腱外膜明显增厚, 见大量炎性反应性增生的腱膜细胞, 外膜下为平行排列的腱细胞和胶原纤维, 局灶呈波浪状排列; 组织结构完整, 染色鲜艳(图1d ～f ) 。
3 讨论
①固定剂的作用:改良4%多聚甲醛固定液, 含少量冰醋酸, 可加快固定剂的渗透固定作用和减少肌腱的收缩, 并可符合于特殊染色和免疫组织化学染色的固定要求[3]。②软化剂的作用:肌腱组织脱水不彻底易造成后继染色过程中脱片; 但是, 脱水、浸蜡等过度又会使组织变脆、变硬而不易切片。在实验设置时, 组织处理时间应宁过勿少, 这样石蜡组织可能出现略显脆
通讯作者:王东林, 副教授, 硕士导师, 研究方向:分子病理学,
E 2m ail:donglin@ntu. edu . cn
中国修复重建外科杂志2007年4月第21卷第4期・425・
图1 两组兔肌腱组织切片的HE 染色观察
a 正常组肌腱(×120) ○b 正常组肌腱(×300) ○c 正常组肌腱(×600) ○d 实验组肌腱(×120) ○e 实验组肌腱(×300) ○f 实验组肌腱○(×600)
硬难切片的情况, 我们在实验中专门配制了软化剂, 在切片操作中蘸涂蜡块组织切面, 可即时有效的软化过度脆硬组织, 从而改善和提高切片效果[4]。③正丁醇的作用:在肌腱梯度脱水的试剂配制中, 将常规梯度脱水剂中所含的水分替换为正丁醇, 既可以缓冲酒精对肌腱组织的硬化弊端又保证了脱水效果。在组织结构较为致密的肌腱组织中正丁醇渗透性和脱水能力较酒精弱, 为保证充分的组织脱水, 利用正丁醇不易致使肌腱组织发生过度硬化的特点, 适当增加正丁醇的操作步骤是十分必要的[5]。④组织浸蜡:肌腱组织质地比较韧硬和致密, 试剂浸透较缓慢, 适当设置低温和高温浸蜡程序并延长浸蜡时间, 可保证充分完全的组织浸蜡, 不致造成组织过度脆硬而难以切片或浸蜡不全造成切片和染色困难[6]。⑤实验组的设置:近年来研究表明, 将外源性基因导入损伤的屈肌腱中可能是促进其修复过程的有效方法, 但目前大多数转基因载体因其在靶组织中会引起组织的炎性反应, 应用受到一定的限制。因此关于基因治疗载体应用于肌腱的组织反应成了实验研究的热点, 于是肌腱形态学方面的实验研究也多了起来[7]。然而肌腱组织比较致密、韧性大、较坚硬, 在制作组织切片, 尤其是石蜡制片时, 如果在制片过程中缺乏恰当的处理肌腱组织的方法, 是不易制出合格切片的。我们在平时的工作中比较成功的摸索出了一种具
有实用价值的肌腱的石蜡制片方法。⑥关于A d 52L acZ :我们以前的实验是为了观察三种基因治疗载体应用于肌腱的组织炎性反应, A d 52L acZ 是其中之一, 它是带一段报告基因(L acZ ) 的腺病毒载体, 运用它可以将目的基因导入细胞或组织[8210]。
4 参考文献
[1**********]
吴尧平, 陆裕朴, 石凯军. 无人区肌腱损伤修复的实验研究. 中华医学杂志, 1990, 70(4) :1952197.
吕荣, 杨光. 介绍一种鸡肌腱切片的新方法. 中国修复重建外科杂志, 1996, 10(2) :69.
翁秀琴, 沈武成. 制作H E 染色石蜡切片的关键技术. 医药论坛杂志, 2005, 26(21) :80.
李云. 脆性组织切片的制作技巧和体会. 咸宁学院学报:医学版, 2005, 19(3) :1572157.
田珑, 张卫光. 正丁醇脱水制作肝组织石蜡切片. 解剖科学进展,
2004, 10(2) :190.
郭爱华, 魏淑英, 王斌. 临床病理制片常见问题及解决办法. 中国兽医杂志, 2005, 41(7) :56.
秦宏敏, 佟向阳, 许铁, 等. A d 2T GF Β1重组腺病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞的研究. 中华实验外科杂志, 2006, 23(10) :1256.
张海龙, 黄朝梁. 基因治疗韧带肌腱损伤进展. 创伤外科杂志, 2006, 8(3) :2742277.
岳宇, 刘颖, 李学志. 小标本组织快速石蜡切片的应用. 中国冶金工业医学杂志, 2005, 22(1) :96.
肖剑, 贾连顺, 程岚, 等. 兔腰椎间盘髓核细胞活力测定及外源性基因在其中的表达. 中国临床康复, 2002, 6(20) :302323024.
(收稿:2006206219 修回:2007201223)
(本文编辑:董奇男)