毛细管色谱法测定洛美沙星中的有机溶剂残留量
来源: 作者:王国成, 陈莹, 徐波
摘 要：目的:建立毛细管气相色谱法测定洛美沙星中的有机溶剂残留量。方法: 用INNOWAX 毛细管气相色谱柱,FID 检测器, 以22戊酮为内标进行测定。结果: 乙酸乙酯、四氢呋喃、乙醇、乙腈的线性范围分别为0～80μg/m l ( r =0.999 7)、0～11.52μg/ml( r=0.9996)、0～80μg/ml( r=0.9997) , 0～6.56 μg/ml( r= 0.9996); 平均回收率分别为100.5%、100.1%、101.2%、100.1%; RSD 分别为1.30%、0.9%、1.18%和1.23% (n = 9) 。结论: 本方法简单、准确、灵敏度高、重现性好, 适用于洛美沙星中有机溶剂残留量的测定。
关键词 洛美沙星, 毛细管气相色谱法, 有机溶剂残留量
药物生产过程中残存的有机溶剂均有不同程度的毒性, 不仅对人体有害, 而且这些溶剂与药物的治疗作用无关, 原则上应愈少愈好。洛美沙星为第三代喹诺酮类广谱抗菌药, 是由日本北陆株式会社研制的第一代口服长效抗菌药。该药物在合成过程中采用了乙酸乙酯、四氢呋喃、乙醇、乙腈等有机溶剂, 故对此4种有机溶剂加以检测有利于药物质量控制。本试验采用毛细管色谱法测定洛美沙星原料药中有机溶剂的含量, 方法简便, 结果准确可靠。
1 仪器与试剂
Agilent6890 增强型气相色谱仪, Agilent6890 工作站。乙酸乙酯、四氢呋喃、乙醇、乙腈均为分析纯(上海化学试剂公司) , 22戊酮(内标物) 为色标试剂(天津化学试剂一厂) , 1-甲基-2-吡咯烷酮, 溶解样品用溶剂为化学纯(上海化学试剂公司) 。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱: Agilent HP-NNOWAX (固定液为键合聚乙二醇, 30m×0.53mm,1.0μm) 毛细管柱; 气化室温度: 220℃; 程序升温: 起始温度为40℃, 保持10min, 然后以20℃/min 升温至220℃,保持4 min;载气为氮气; 分流比:1∶1; 进样量2μl; 检测器温度: 氢焰离子化检测器(FID) , 240 ℃。
2.2 溶液及试样制备
2. 2. 1 内标溶液的制备 精密量取色标试剂2-戊酮124.0μl (约相当于100mg) , 置100ml 量瓶中, 用1-甲基-2-吡咯烷酮稀释至刻度, 摇匀; 精密量取1m l, 置10ml 容量瓶中, 用1-甲基-2-吡咯烷酮稀释至刻度, 摇匀, 作为内标溶液。
2. 2. 2 对照溶液的制备 精密量取乙酸乙酯111. 1μl (约相当于100mg) , 乙醇126.6μl(约相当于100mg) 置100ml 量瓶中, 用1-甲基-2-吡咯烷酮稀释至刻度, 摇匀, 作为对照贮备液A; 精密量取四氢呋喃162.2μl(约相当于144m g) , 乙腈105.0μl (约相当于82mg) 置100ml 量瓶中, 用1-甲基-2-吡咯烷酮稀释至刻度, 摇匀, 作为对照贮备液B 。精密量取对照贮备液A 10ml 与对照贮备液B 1ml 置同一100ml 量瓶中, 用1-甲基-2-吡咯烷酮稀释至刻度, 摇匀, 作为对照贮备液。精密量取对照贮备液5ml, 置10ml 量瓶中, 精密加入内标溶液1ml, 加1-甲基-2-吡咯烷酮稀释至刻度, 摇匀, 即得对照溶液。
2. 2. 3 供试品溶液的配制 取本品约0.1g, 精密称定, 置10ml 量瓶中, 精密加入内标溶液1ml, 加1-甲基-2-吡咯烷酮适量, 振摇使溶解并稀释至刻度, 摇匀, 作为供试品溶液。
2.3 系统适用性试验 精密量取对照品溶液2μl, 注入气相色谱仪, 记
录色谱图, 测定各有机溶剂的分离度及柱效。结果表明, 以上各有机溶剂计算的理论塔板数均达到2500 以上, 相邻溶剂的分离度均符合要求。
2.4 线性关系 精密量取对照贮备液0.5、1. 0、2. 0、4. 0、5. 0、6. 0 和8.0ml 分别置10ml 量瓶中, 各精密加入内标溶液1ml, 加1-甲基-2-吡咯烷酮稀释至刻度, 摇匀。分别精密量取上述各浓度溶液2μl, 注入气相色谱仪, 测定。分别以乙酸乙酯、四氢呋喃、乙醇、乙腈对照液的峰面积与22戊酮(内标) 峰面积的比值为纵坐标( Y ) , 以乙酸乙酯、四氢呋喃、乙醇、乙腈的浓度为横坐标( X ) , 进行线性回归。结果表明, 四氢呋喃、乙酸乙酯、乙醇、乙腈在相应的线性范围内线性关系良好。
2.5 回收率试验 分别取本品约0.1g, 精密称定, 置10 ml量瓶中(共10份) , 精密加入对照贮备液4ml(3份) 、5ml(3 份) 、6ml(3 份), 另取1份不加贮备液, 作为空白, 再精密加入内标溶液1ml, 加1-甲基-2-吡咯烷酮稀释至刻度, 摇匀(共10份) 。分别精密量取上述各浓度溶液2μl, 注入气相色谱仪, 记录峰面积, 计算回收率。
2. 6 精密度试验 精密量取对照溶液2μl, 按上述测定法操作, 重复进样6次, 四氢呋喃、乙酸乙酯、乙醇和乙腈RSD 分别为0.40%、0.59%、0.60% 和0.63%。
2. 7 最低检出限的测定 取对照品溶液逐步稀释进样, 测得乙酸乙酯、四氢呋喃、乙醇、乙腈的最低检出限为50.3.6.25和102.5 μg/ml。
2. 8 样品测定 按“2. 2. 3”项制备供试品试样, 按“2.2.2”项制备对照品试样, 分别测定, 记录色谱图, 按内标法以峰面积计算各溶剂含量。 3 讨论
3.1 色谱柱的选择 4种有机溶剂中乙醇和乙腈较难分离, 试验采用DB2624 气相色谱柱不能达到基线分离, 选用Agilent HP-NNOWAX 毛细管柱, 在本试验条件下, 各物质均可达到有效分离,4种有机溶剂和内标的出峰顺序依次为四氢呋喃(2.142min)、乙酸乙酯(2.455min) , 乙醇(3.233min)、2-戊酮(4.118min)和乙腈(5.074min) , 整个分析过程在20min 内完成, 快速简便。
3.2 内标物的选择 内标物的选择应在分析的样品中间出峰, 且不干扰被测成分的物质, 采用内标法测定有机溶剂含量, 可以减少仪器及实验者的操作误差。经过多种有机溶剂的筛选, 选择22戊酮为内标可以和这4种有机溶剂达到有效分离, 无干扰, 方法学验证得到满意结果, 精密度符合中国药典要求(RSD
3.3 柱温的选择 柱温升高可使 有机溶剂的出峰时间提前, 但升高温度不利于此4种有机溶剂的分离, 因此初始柱温选择40℃, 在此温度下, 溶剂1-甲基-2-吡咯烷酮的出峰时间保留时间过长, 在保证有机溶剂和内标得到有效分离的情况下, 利用程序升温使溶剂峰快速出峰, 缩短分析所用时间。
参考文献
1 周海钧, 金少鸿. 人用药品注册技术规范国际协调会( ICH)-质量的技术要求. 中国药学杂志, 1996, 31 (11) : 694
2 中国药典.2000. 二部. 附录64
高效毛细管气相色谱法测定保心安油中(一)-薄荷
酮、薄荷脑和桂皮醛的含量
来源: 作者:郑纯; 曾洁
摘要：目的：采用高效毛细管气相色谱法同时测定保心安油中(一)-薄荷酮、薄荷脑和桂皮醛的含量。方法：采用HP-INNOWAX 毛细管柱 (Crosslinked Polyethylene Glycol，0.25μm×0.25 mm×30m)，GC-MS 分离鉴定保心安油10种成分，3种成分的含量采用内标法测定，用HP-FFAP 毛细管柱(Crosslinked Polyethylene ，0.25μm×0.25 mm×30m)，柱温：115℃→155℃→230℃（4min ），分流进样，分流比40：1；进样口温度：180℃；检测器：FID ，温度：250℃。 结果：3种成分均达到良好的分离，(一)-薄荷酮、薄荷脑和桂皮醛线性范围分别为0.83～4.16μg(r=0.9999)，2.52—12.60μg (r=0.9999)，0.20～1.00μg (r=0.9999)；重现性均小于1.5％，平均回收率分别为(一)-薄荷酮：99.18％，RSD=1.4％；薄荷脑：99.92％，RSD= 1.1％；桂皮醛：99.22％，RSD=1.4％。 关键词：保心安油毛细管气相色谱气质联用分离定量(一)-薄荷酮薄荷脑桂皮醛
Capilary Column Gas Chromatography Determination of(一)-Menthone ，Menthol ，Cinnamic Aldehyde in Po Sum On Oil
保心安油由薄荷油、肉桂油、细辛、黄芩、血竭等数10味药组成的进口中成药。具镇痛、驱风、通窍、消肿等功效，主治伤风鼻塞、感冒头痛、蚊叮虫咬、跌打损 伤、肠胃不适等症。本文采用HP-INNOWAX 毛细管柱GC-MS 分离、鉴定该制剂10种主要活性成分，用FFAP 毛细管柱内标法测定了(一)-薄荷 酮、薄荷脑和桂皮醛的含量。本法快速，准确，可靠。
1 仪器与材料
气相色谱／质谱系统HP-5973；气相色谱仪HP- 6890型；色谱工作站：HP-Chemstation ；毛细管色谱柱：HP-INNOWAX(Crosslinked Polyethylene Glyco1) ，0.25μm×0.25mm ×30m；HP-FFAP(Crosslinked Polyethylene)，0.25μm×0.25mm×30m；HP-5(Crosslinked 5％PH ME Siloxane)，
0.25μm×0.25mm×30m；对照品：(一)-薄荷酮，Aldrich Chemical Company，Inc ．；(一)-薄荷脑、桂皮醛、萘(内标物) 均为美国Sigma 公司产品。所用试剂均为分析纯。
2 实验部分
2． 1 GC-MS鉴定 油中主要化学成分 GC-MS色谱条件：GC-MS 接口温度280℃；载气：氦气；分流比：10：1；色谱柱：HP-INNOWAX(Crosslinked Polyethylene Glycol，0.25μm ×0.25mmx30m)；柱温：60℃(通过
3℃/min)→110℃(2min) (通过3℃/min) →150℃(1min) (通过100℃/min)→ 230℃(1 min)；MS 条件：离子源温度300℃，电子能量7OeV ，倍增电压1.6kV ，扫描速度：1s ／dec ，检测质荷比范围m ／z ：40—425，检索谱 库DATABASE ／NIST98L ，对保心安油进行GC-MS 分析，结果鉴定1O 个主要化学成分。
2．2 含量测定
2． 2．1 色谱条件的选择 本实验曾选用非极性柱HP-5毛细管柱
(Crosslinked 5％PH ME Siloxane) 、极性柱HP-INNOWAX 毛细管柱(Crosslinked Polyethylene Glyco1)和极性柱HP-FFAP(Crosslinked Polyethylene)，结果
HP-INNOWAX 柱和HP-FFAP 柱的分离效果均优于HP-5柱，故选定HP-FFAP 柱。柱温：115℃（通过 4℃/min）→155℃（1min ）（通过40℃/min）→230℃(4min)，分流进样，分流比40：1；进样口温度：180℃，压力： 15Pa；检测器：FID ，温度：250℃ 。流速：H2 30mL/min；Air400mL/min；Makeup(N2)25mL/min。
2．2．2 溶液制备
内标溶液的制备：取萘适量，加石油醚(60℃～9O℃)溶解，并制成每1mL 含2Omg 的溶液，摇匀，作为内标溶液。
对 照品溶液的制备：取(一)-薄荷酮2O.12mg ，(一)-薄荷脑60.34mg ，桂皮醛
5.78mg ，精密称定，置10mL 量瓶中，精密加入内标溶液 2mL，加石油醚(6O℃～90℃)溶解并稀释至刻度，摇匀，制成含(一)-薄荷酮、(一)-薄荷脑、桂皮醛分别为2.012，60.34， 0.578mg/mL的溶液，作为对照品溶液。
样品溶液的制备：取本品约0.3 g，精密称定，置10mL 量瓶中，精密加入内标溶液2mL ，加石油醚(60℃～9O℃ )溶解并稀释至刻度，摇匀，作为样品溶液。
2．2．3 系统适用性实验 按“2．2．2”项下制备6份供试品溶液，照
“2．2．1”项色谱条件，分别进样1μL ，通过色谱工作站计算系统适应性参数。
2． 2．4 空白实验 模拟保心安油制备工艺分别制备缺薄荷油和肉桂油的阴性样品，按“2．2．2”项下分别制备阴性样品溶液，照“2．2．1”项色谱条件进样分析其色谱图，结 果阴性对照在样品的薄荷脑和桂皮醛色谱峰保留时间处无色谱峰干扰。采用GC-MS 对样品与(一)-薄荷酮、(一)-薄荷脑和肉桂醛对照品进行离子色谱峰分 析比较，结果显示样品分别在与上述3种对照品相同保留时间处的离子碎片峰完全相同，亦证明样品的(一)-薄荷酮、薄荷脑和肉桂醛的色谱峰无干扰。
2． 2．5 线性关系考察取(一)-薄荷酮、(一)-薄荷脑和桂皮醛对照品适量，加石油醚(60℃～90℃)配制成浓度分别为8.312，25.22， 20.32mg/mL 的混合对照品溶液，分别精密吸取混合对照品溶液1，2，3，4，5mL ，置10mL 量瓶中，加石油醚(60℃～90℃)稀释至刻度，取上述溶液分别进样 1μL ，以峰面积为纵坐标，以各组分进样量为横坐标，绘制标准曲线，求得(一)-薄荷酮、(一)-薄荷脑和桂皮醛的回归方程分别为：
Y=443085.179X +15.644 r=0.9999
Y=485252.443X +36.001 r=0.9999
Y=405027.619X + 15.514 r=0.9999
线性范围分别为0.83～4.16，2.52～12.60，0.20～1.00μg 。
2． 2．6 精密度实验取“2．2．2”项下的对照品溶液，连续进样6针，每针1μL ，按内标法分别测定相对校正因子，并计算其RSD ，结果(一)-薄荷酮、
(一)- 薄荷脑和桂皮醛相对校正因子平均值(n=6)分别为1.5614，1.4178，
1.630；RSD 分别为0.03％，0.03％，0.05％。
2．2．7 重现性实验 取保心安油样品6份，按样品测定法测定，结果(一)-薄荷酮、薄荷脑和肉桂醛含量的RSD 分别为1.1％，0.8％，1.5％，证明重现性良好。
2． 2．8 加样回收率实验 取已知含量的保心安油样品0.15g ，6份，精密称定，置10mL 量瓶中，分别精密吸取(一)-薄荷酮(18.12mg/mL)、(一)-薄荷脑 (46.39mg/mL ) 和桂皮醛(1.41mg/mL ) 对照品溶液约1mL ，分别加至样品中(n=6)，精密吸取内标溶液2 mL，加石油醚(60℃～90℃)稀释至刻度，依法制备，进样1μL ，计算平均回收率，(一)-薄荷酮：99.18％，RSD=1.4％；薄荷脑： 99.92％，
RSD=1.1％；桂皮醛：99.22％，RSD=1.4％。结果表明样品回收率良好。
2．2．9 样品的测定按“2．2．2”项下分别制备对照品溶液和样品溶液，按“2．2．1”项下色谱条件分别进样1μL ，注人气相色谱仪中，测定，计算(一)-薄荷酮、薄荷脑和桂皮醛的含量。
3 讨论
对于含精油类中药，精油成分较复杂，大多含手性异构体，目前药典和中药进口部颁标准对该类药物仍基本采用填充柱进行气相分析，远远达不到分离的目的，本实 验为典型的例证，保心安油的挥发性成分主要为薄荷油和肉桂油的主要成分，用普通不锈钢柱仅分离出4～5个色谱峰，FID 检测器无法确定色谱峰的纯度。而采 用毛细管柱可分离出十几个主要化学成分，大大提高了分离度和检测的灵敏度，用GC-MS 对色谱峰进行成分鉴定，同时保证其峰的纯度，在不具备对照品的情况 下，经GC-MS 分析，对该制剂挥发性成分的指纹图谱的鉴定或采用相对含量形式控制其他活性成分含量，具有重要意义，通过毛细管柱比较实验发现，对于含薄 荷油的成品，非极性柱(如：HP-5) 的分离效果不如极性柱(如：HP-FFAP ，HP-INNOWAX) 。我们还发现薄荷脑色谱峰是(一)-薄荷脑(左 旋) 和(+)-薄荷脑(右旋) 的混合物，用非极性柱(HP-5)长时间分离可见两叉峰，但无法完全分离，采用极性柱，该异构体是以单峰的形式表现，实验中 发现毛细管柱气相色谱用外标法的精密度和重现性远低于内标法，尤其是连续测定多份样品，含量误差较大，故不宜用外标法定量，而采用内标法的精密度、重现性 得到显著的提高(RSD
参考文献
1 Hartwig Schulz ．Rapid NIRS determination of quality parameters in leaves and isolated essential oil of Mentha species ．J ，Essent Oil Res ．1999.11：185
2 GAO Hai(高海) ．Determination of three components in peppermint oil by GC(气相色谱法测定薄荷油中三种主要成分的含量) ．Pharm Bull(药学通报) ，1988，23(7)：414
气相色谱法—内标法
什么叫内标法? 怎样选择内标物?
内标法是一种间接或相对的校准方法。在分析测定样品中某组分含量时，加入一种内标物质以校谁和消除出于操作条件的波动而对分析结果产生的影响，以提高分析结果的准确度。
内标法在气相色谱定量分析中是一种重要的技术。使用内标法时，在样品中加入一定量的标准物质，它可被色谱拄所分离，又不受试样中其它组分峰的干 扰，只要测定内标物和待测组分的峰面积与相对响应值，即可求出待测组分在样品中的百分含量。采用内标法定量时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想地 说，内标物应当是一个能得到纯样的己知化合物，这样它能以准确、已知的量加到样品中去，它应当和被分析的样品组分有基本相同或尽可能一致的物理化学性质 (如化学结构、极性、挥发度及在溶剂中的溶解度等) 、色谱行为和响应特征，最好是被分析物质的一个同系物。当然，在色谱分析条什下，内标物必
须能与样品中 各组分充分分离。需要指出的是，在少数情况下，分析人员可能比较关心化台物在一个复杂过程中所得到的回收率，此时，他可以使用一种在这种过程中很容易被完 全回收的化台物作内标，来测定感兴趣化合物的百分回收率，而不必遵循以上所说的选择原则。
在使用内标法定量时，有哪些因素会影响内标和被测组分的峰高或峰面积的比值?
影响内标和被测组分峰高或峰面积比值的因素主要有化学方面的、色谱方面的和仪器方面的三类。
由化学方面的原因产生的面积比的变化常常在分析重复样品时出现。 化学方面的因素包括：
1、内标物在样品里混合不好；
2、内标物和样品组分之间发生反应，
3、内标物纯度可变等。
对于一个比较成熟的方法来说，色谱方面的问题发生的可能性更大一些，色谱上常见的一些问题(如渗漏) 对绝对面积的影响比较大，对面积比的影响则 要小一些，但如果绝对面积的变化已大到足以使面积比发生显著变化的程度，那么一定有某个重要的色谱问题存在，比如进样量改变太大，样品组分浓度和内标浓度 之间有很大的差别，检测器非线性等。进样量应足够小并保持不变，这样才不致于造成检测器和积分装置饱和。如果认为方法比较可靠，而色谱固看来也是正常的 话，应着重检查积分装置和设置、斜率和峰宽定位。对积分装置发生怀疑的最有力的证据是：面积比可变，而峰高比保持相对恒定，
在制作内标标准曲线时应注意什么?
在用内标法做色话定量分析时，先配制一定重量比的被测组分和内标样品的混合物做色谱分析，测量峰面积，做重量比和面积比的关系曲线，此曲线即为 标准曲线。在实际样品分析时所采用的色谱条件应尽可能与制作标准曲线时所用的条件一致，因此，在制作标准曲线时，不仅要注明色谱条件(如固定相、柱温、载 气流速等) ，还应注明进样体积和内标物浓度。在制作内标标准曲线时，各点并不完全落在直线上，此时应求出面积比和重量比的比值与其平均位的标准偏差，在使 用过程中应定期进行单点校正，若所得值与平均值的偏差小于2，曲线仍可使用，若大于2，则应重作曲线，如果曲线在铰短时期内即产生变动，则不宜使用内标法 定量。
毛细管色谱法测定洛美沙星中的有机溶剂残留量
来源: 作者:王国成, 陈莹, 徐波
摘 要：目的:建立毛细管气相色谱法测定洛美沙星中的有机溶剂残留量。方法: 用INNOWAX 毛细管气相色谱柱,FID 检测器, 以22戊酮为内标进行测定。结果: 乙酸乙酯、四氢呋喃、乙醇、乙腈的线性范围分别为0～80μg/m l ( r =0.999 7)、0～11.52μg/ml( r=0.9996)、0～80μg/ml( r=0.9997) , 0～6.56 μg/ml( r= 0.9996); 平均回收率分别为100.5%、100.1%、101.2%、100.1%; RSD 分别为1.30%、0.9%、1.18%和1.23% (n = 9) 。结论: 本方法简单、准确、灵敏度高、重现性好, 适用于洛美沙星中有机溶剂残留量的测定。
关键词 洛美沙星, 毛细管气相色谱法, 有机溶剂残留量
药物生产过程中残存的有机溶剂均有不同程度的毒性, 不仅对人体有害, 而且这些溶剂与药物的治疗作用无关, 原则上应愈少愈好。洛美沙星为第三代喹诺酮类广谱抗菌药, 是由日本北陆株式会社研制的第一代口服长效抗菌药。该药物在合成过程中采用了乙酸乙酯、四氢呋喃、乙醇、乙腈等有机溶剂, 故对此4种有机溶剂加以检测有利于药物质量控制。本试验采用毛细管色谱法测定洛美沙星原料药中有机溶剂的含量, 方法简便, 结果准确可靠。
1 仪器与试剂
Agilent6890 增强型气相色谱仪, Agilent6890 工作站。乙酸乙酯、四氢呋喃、乙醇、乙腈均为分析纯(上海化学试剂公司) , 22戊酮(内标物) 为色标试剂(天津化学试剂一厂) , 1-甲基-2-吡咯烷酮, 溶解样品用溶剂为化学纯(上海化学试剂公司) 。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱: Agilent HP-NNOWAX (固定液为键合聚乙二醇, 30m×0.53mm,1.0μm) 毛细管柱; 气化室温度: 220℃; 程序升温: 起始温度为40℃, 保持10min, 然后以20℃/min 升温至220℃,保持4 min;载气为氮气; 分流比:1∶1; 进样量2μl; 检测器温度: 氢焰离子化检测器(FID) , 240 ℃。
2.2 溶液及试样制备
2. 2. 1 内标溶液的制备 精密量取色标试剂2-戊酮124.0μl (约相当于100mg) , 置100ml 量瓶中, 用1-甲基-2-吡咯烷酮稀释至刻度, 摇匀; 精密量取1m l, 置10ml 容量瓶中, 用1-甲基-2-吡咯烷酮稀释至刻度, 摇匀, 作为内标溶液。
2. 2. 2 对照溶液的制备 精密量取乙酸乙酯111. 1μl (约相当于100mg) , 乙醇126.6μl(约相当于100mg) 置100ml 量瓶中, 用1-甲基-2-吡咯烷酮稀释至刻度, 摇匀, 作为对照贮备液A; 精密量取四氢呋喃162.2μl(约相当于144m g) , 乙腈105.0μl (约相当于82mg) 置100ml 量瓶中, 用1-甲基-2-吡咯烷酮稀释至刻度, 摇匀, 作为对照贮备液B 。精密量取对照贮备液A 10ml 与对照贮备液B 1ml 置同一100ml 量瓶中, 用1-甲基-2-吡咯烷酮稀释至刻度, 摇匀, 作为对照贮备液。精密量取对照贮备液5ml, 置10ml 量瓶中, 精密加入内标溶液1ml, 加1-甲基-2-吡咯烷酮稀释至刻度, 摇匀, 即得对照溶液。
2. 2. 3 供试品溶液的配制 取本品约0.1g, 精密称定, 置10ml 量瓶中, 精密加入内标溶液1ml, 加1-甲基-2-吡咯烷酮适量, 振摇使溶解并稀释至刻度, 摇匀, 作为供试品溶液。
2.3 系统适用性试验 精密量取对照品溶液2μl, 注入气相色谱仪, 记
录色谱图, 测定各有机溶剂的分离度及柱效。结果表明, 以上各有机溶剂计算的理论塔板数均达到2500 以上, 相邻溶剂的分离度均符合要求。
2.4 线性关系 精密量取对照贮备液0.5、1. 0、2. 0、4. 0、5. 0、6. 0 和8.0ml 分别置10ml 量瓶中, 各精密加入内标溶液1ml, 加1-甲基-2-吡咯烷酮稀释至刻度, 摇匀。分别精密量取上述各浓度溶液2μl, 注入气相色谱仪, 测定。分别以乙酸乙酯、四氢呋喃、乙醇、乙腈对照液的峰面积与22戊酮(内标) 峰面积的比值为纵坐标( Y ) , 以乙酸乙酯、四氢呋喃、乙醇、乙腈的浓度为横坐标( X ) , 进行线性回归。结果表明, 四氢呋喃、乙酸乙酯、乙醇、乙腈在相应的线性范围内线性关系良好。
2.5 回收率试验 分别取本品约0.1g, 精密称定, 置10 ml量瓶中(共10份) , 精密加入对照贮备液4ml(3份) 、5ml(3 份) 、6ml(3 份), 另取1份不加贮备液, 作为空白, 再精密加入内标溶液1ml, 加1-甲基-2-吡咯烷酮稀释至刻度, 摇匀(共10份) 。分别精密量取上述各浓度溶液2μl, 注入气相色谱仪, 记录峰面积, 计算回收率。
2. 6 精密度试验 精密量取对照溶液2μl, 按上述测定法操作, 重复进样6次, 四氢呋喃、乙酸乙酯、乙醇和乙腈RSD 分别为0.40%、0.59%、0.60% 和0.63%。
2. 7 最低检出限的测定 取对照品溶液逐步稀释进样, 测得乙酸乙酯、四氢呋喃、乙醇、乙腈的最低检出限为50.3.6.25和102.5 μg/ml。
2. 8 样品测定 按“2. 2. 3”项制备供试品试样, 按“2.2.2”项制备对照品试样, 分别测定, 记录色谱图, 按内标法以峰面积计算各溶剂含量。 3 讨论
3.1 色谱柱的选择 4种有机溶剂中乙醇和乙腈较难分离, 试验采用DB2624 气相色谱柱不能达到基线分离, 选用Agilent HP-NNOWAX 毛细管柱, 在本试验条件下, 各物质均可达到有效分离,4种有机溶剂和内标的出峰顺序依次为四氢呋喃(2.142min)、乙酸乙酯(2.455min) , 乙醇(3.233min)、2-戊酮(4.118min)和乙腈(5.074min) , 整个分析过程在20min 内完成, 快速简便。
3.2 内标物的选择 内标物的选择应在分析的样品中间出峰, 且不干扰被测成分的物质, 采用内标法测定有机溶剂含量, 可以减少仪器及实验者的操作误差。经过多种有机溶剂的筛选, 选择22戊酮为内标可以和这4种有机溶剂达到有效分离, 无干扰, 方法学验证得到满意结果, 精密度符合中国药典要求(RSD
3.3 柱温的选择 柱温升高可使 有机溶剂的出峰时间提前, 但升高温度不利于此4种有机溶剂的分离, 因此初始柱温选择40℃, 在此温度下, 溶剂1-甲基-2-吡咯烷酮的出峰时间保留时间过长, 在保证有机溶剂和内标得到有效分离的情况下, 利用程序升温使溶剂峰快速出峰, 缩短分析所用时间。
参考文献
1 周海钧, 金少鸿. 人用药品注册技术规范国际协调会( ICH)-质量的技术要求. 中国药学杂志, 1996, 31 (11) : 694
2 中国药典.2000. 二部. 附录64
高效毛细管气相色谱法测定保心安油中(一)-薄荷
酮、薄荷脑和桂皮醛的含量
来源: 作者:郑纯; 曾洁
摘要：目的：采用高效毛细管气相色谱法同时测定保心安油中(一)-薄荷酮、薄荷脑和桂皮醛的含量。方法：采用HP-INNOWAX 毛细管柱 (Crosslinked Polyethylene Glycol，0.25μm×0.25 mm×30m)，GC-MS 分离鉴定保心安油10种成分，3种成分的含量采用内标法测定，用HP-FFAP 毛细管柱(Crosslinked Polyethylene ，0.25μm×0.25 mm×30m)，柱温：115℃→155℃→230℃（4min ），分流进样，分流比40：1；进样口温度：180℃；检测器：FID ，温度：250℃。 结果：3种成分均达到良好的分离，(一)-薄荷酮、薄荷脑和桂皮醛线性范围分别为0.83～4.16μg(r=0.9999)，2.52—12.60μg (r=0.9999)，0.20～1.00μg (r=0.9999)；重现性均小于1.5％，平均回收率分别为(一)-薄荷酮：99.18％，RSD=1.4％；薄荷脑：99.92％，RSD= 1.1％；桂皮醛：99.22％，RSD=1.4％。 关键词：保心安油毛细管气相色谱气质联用分离定量(一)-薄荷酮薄荷脑桂皮醛
Capilary Column Gas Chromatography Determination of(一)-Menthone ，Menthol ，Cinnamic Aldehyde in Po Sum On Oil
保心安油由薄荷油、肉桂油、细辛、黄芩、血竭等数10味药组成的进口中成药。具镇痛、驱风、通窍、消肿等功效，主治伤风鼻塞、感冒头痛、蚊叮虫咬、跌打损 伤、肠胃不适等症。本文采用HP-INNOWAX 毛细管柱GC-MS 分离、鉴定该制剂10种主要活性成分，用FFAP 毛细管柱内标法测定了(一)-薄荷 酮、薄荷脑和桂皮醛的含量。本法快速，准确，可靠。
1 仪器与材料
气相色谱／质谱系统HP-5973；气相色谱仪HP- 6890型；色谱工作站：HP-Chemstation ；毛细管色谱柱：HP-INNOWAX(Crosslinked Polyethylene Glyco1) ，0.25μm×0.25mm ×30m；HP-FFAP(Crosslinked Polyethylene)，0.25μm×0.25mm×30m；HP-5(Crosslinked 5％PH ME Siloxane)，
0.25μm×0.25mm×30m；对照品：(一)-薄荷酮，Aldrich Chemical Company，Inc ．；(一)-薄荷脑、桂皮醛、萘(内标物) 均为美国Sigma 公司产品。所用试剂均为分析纯。
2 实验部分
2． 1 GC-MS鉴定 油中主要化学成分 GC-MS色谱条件：GC-MS 接口温度280℃；载气：氦气；分流比：10：1；色谱柱：HP-INNOWAX(Crosslinked Polyethylene Glycol，0.25μm ×0.25mmx30m)；柱温：60℃(通过
3℃/min)→110℃(2min) (通过3℃/min) →150℃(1min) (通过100℃/min)→ 230℃(1 min)；MS 条件：离子源温度300℃，电子能量7OeV ，倍增电压1.6kV ，扫描速度：1s ／dec ，检测质荷比范围m ／z ：40—425，检索谱 库DATABASE ／NIST98L ，对保心安油进行GC-MS 分析，结果鉴定1O 个主要化学成分。
2．2 含量测定
2． 2．1 色谱条件的选择 本实验曾选用非极性柱HP-5毛细管柱
(Crosslinked 5％PH ME Siloxane) 、极性柱HP-INNOWAX 毛细管柱(Crosslinked Polyethylene Glyco1)和极性柱HP-FFAP(Crosslinked Polyethylene)，结果
HP-INNOWAX 柱和HP-FFAP 柱的分离效果均优于HP-5柱，故选定HP-FFAP 柱。柱温：115℃（通过 4℃/min）→155℃（1min ）（通过40℃/min）→230℃(4min)，分流进样，分流比40：1；进样口温度：180℃，压力： 15Pa；检测器：FID ，温度：250℃ 。流速：H2 30mL/min；Air400mL/min；Makeup(N2)25mL/min。
2．2．2 溶液制备
内标溶液的制备：取萘适量，加石油醚(60℃～9O℃)溶解，并制成每1mL 含2Omg 的溶液，摇匀，作为内标溶液。
对 照品溶液的制备：取(一)-薄荷酮2O.12mg ，(一)-薄荷脑60.34mg ，桂皮醛
5.78mg ，精密称定，置10mL 量瓶中，精密加入内标溶液 2mL，加石油醚(6O℃～90℃)溶解并稀释至刻度，摇匀，制成含(一)-薄荷酮、(一)-薄荷脑、桂皮醛分别为2.012，60.34， 0.578mg/mL的溶液，作为对照品溶液。
样品溶液的制备：取本品约0.3 g，精密称定，置10mL 量瓶中，精密加入内标溶液2mL ，加石油醚(60℃～9O℃ )溶解并稀释至刻度，摇匀，作为样品溶液。
2．2．3 系统适用性实验 按“2．2．2”项下制备6份供试品溶液，照
“2．2．1”项色谱条件，分别进样1μL ，通过色谱工作站计算系统适应性参数。
2． 2．4 空白实验 模拟保心安油制备工艺分别制备缺薄荷油和肉桂油的阴性样品，按“2．2．2”项下分别制备阴性样品溶液，照“2．2．1”项色谱条件进样分析其色谱图，结 果阴性对照在样品的薄荷脑和桂皮醛色谱峰保留时间处无色谱峰干扰。采用GC-MS 对样品与(一)-薄荷酮、(一)-薄荷脑和肉桂醛对照品进行离子色谱峰分 析比较，结果显示样品分别在与上述3种对照品相同保留时间处的离子碎片峰完全相同，亦证明样品的(一)-薄荷酮、薄荷脑和肉桂醛的色谱峰无干扰。
2． 2．5 线性关系考察取(一)-薄荷酮、(一)-薄荷脑和桂皮醛对照品适量，加石油醚(60℃～90℃)配制成浓度分别为8.312，25.22， 20.32mg/mL 的混合对照品溶液，分别精密吸取混合对照品溶液1，2，3，4，5mL ，置10mL 量瓶中，加石油醚(60℃～90℃)稀释至刻度，取上述溶液分别进样 1μL ，以峰面积为纵坐标，以各组分进样量为横坐标，绘制标准曲线，求得(一)-薄荷酮、(一)-薄荷脑和桂皮醛的回归方程分别为：
Y=443085.179X +15.644 r=0.9999
Y=485252.443X +36.001 r=0.9999
Y=405027.619X + 15.514 r=0.9999
线性范围分别为0.83～4.16，2.52～12.60，0.20～1.00μg 。
2． 2．6 精密度实验取“2．2．2”项下的对照品溶液，连续进样6针，每针1μL ，按内标法分别测定相对校正因子，并计算其RSD ，结果(一)-薄荷酮、
(一)- 薄荷脑和桂皮醛相对校正因子平均值(n=6)分别为1.5614，1.4178，
1.630；RSD 分别为0.03％，0.03％，0.05％。
2．2．7 重现性实验 取保心安油样品6份，按样品测定法测定，结果(一)-薄荷酮、薄荷脑和肉桂醛含量的RSD 分别为1.1％，0.8％，1.5％，证明重现性良好。
2． 2．8 加样回收率实验 取已知含量的保心安油样品0.15g ，6份，精密称定，置10mL 量瓶中，分别精密吸取(一)-薄荷酮(18.12mg/mL)、(一)-薄荷脑 (46.39mg/mL ) 和桂皮醛(1.41mg/mL ) 对照品溶液约1mL ，分别加至样品中(n=6)，精密吸取内标溶液2 mL，加石油醚(60℃～90℃)稀释至刻度，依法制备，进样1μL ，计算平均回收率，(一)-薄荷酮：99.18％，RSD=1.4％；薄荷脑： 99.92％，
RSD=1.1％；桂皮醛：99.22％，RSD=1.4％。结果表明样品回收率良好。
2．2．9 样品的测定按“2．2．2”项下分别制备对照品溶液和样品溶液，按“2．2．1”项下色谱条件分别进样1μL ，注人气相色谱仪中，测定，计算(一)-薄荷酮、薄荷脑和桂皮醛的含量。
3 讨论
对于含精油类中药，精油成分较复杂，大多含手性异构体，目前药典和中药进口部颁标准对该类药物仍基本采用填充柱进行气相分析，远远达不到分离的目的，本实 验为典型的例证，保心安油的挥发性成分主要为薄荷油和肉桂油的主要成分，用普通不锈钢柱仅分离出4～5个色谱峰，FID 检测器无法确定色谱峰的纯度。而采 用毛细管柱可分离出十几个主要化学成分，大大提高了分离度和检测的灵敏度，用GC-MS 对色谱峰进行成分鉴定，同时保证其峰的纯度，在不具备对照品的情况 下，经GC-MS 分析，对该制剂挥发性成分的指纹图谱的鉴定或采用相对含量形式控制其他活性成分含量，具有重要意义，通过毛细管柱比较实验发现，对于含薄 荷油的成品，非极性柱(如：HP-5) 的分离效果不如极性柱(如：HP-FFAP ，HP-INNOWAX) 。我们还发现薄荷脑色谱峰是(一)-薄荷脑(左 旋) 和(+)-薄荷脑(右旋) 的混合物，用非极性柱(HP-5)长时间分离可见两叉峰，但无法完全分离，采用极性柱，该异构体是以单峰的形式表现，实验中 发现毛细管柱气相色谱用外标法的精密度和重现性远低于内标法，尤其是连续测定多份样品，含量误差较大，故不宜用外标法定量，而采用内标法的精密度、重现性 得到显著的提高(RSD
参考文献
1 Hartwig Schulz ．Rapid NIRS determination of quality parameters in leaves and isolated essential oil of Mentha species ．J ，Essent Oil Res ．1999.11：185
2 GAO Hai(高海) ．Determination of three components in peppermint oil by GC(气相色谱法测定薄荷油中三种主要成分的含量) ．Pharm Bull(药学通报) ，1988，23(7)：414
气相色谱法—内标法
什么叫内标法? 怎样选择内标物?
内标法是一种间接或相对的校准方法。在分析测定样品中某组分含量时，加入一种内标物质以校谁和消除出于操作条件的波动而对分析结果产生的影响，以提高分析结果的准确度。
内标法在气相色谱定量分析中是一种重要的技术。使用内标法时，在样品中加入一定量的标准物质，它可被色谱拄所分离，又不受试样中其它组分峰的干 扰，只要测定内标物和待测组分的峰面积与相对响应值，即可求出待测组分在样品中的百分含量。采用内标法定量时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想地 说，内标物应当是一个能得到纯样的己知化合物，这样它能以准确、已知的量加到样品中去，它应当和被分析的样品组分有基本相同或尽可能一致的物理化学性质 (如化学结构、极性、挥发度及在溶剂中的溶解度等) 、色谱行为和响应特征，最好是被分析物质的一个同系物。当然，在色谱分析条什下，内标物必
须能与样品中 各组分充分分离。需要指出的是，在少数情况下，分析人员可能比较关心化台物在一个复杂过程中所得到的回收率，此时，他可以使用一种在这种过程中很容易被完 全回收的化台物作内标，来测定感兴趣化合物的百分回收率，而不必遵循以上所说的选择原则。
在使用内标法定量时，有哪些因素会影响内标和被测组分的峰高或峰面积的比值?
影响内标和被测组分峰高或峰面积比值的因素主要有化学方面的、色谱方面的和仪器方面的三类。
由化学方面的原因产生的面积比的变化常常在分析重复样品时出现。 化学方面的因素包括：
1、内标物在样品里混合不好；
2、内标物和样品组分之间发生反应，
3、内标物纯度可变等。
对于一个比较成熟的方法来说，色谱方面的问题发生的可能性更大一些，色谱上常见的一些问题(如渗漏) 对绝对面积的影响比较大，对面积比的影响则 要小一些，但如果绝对面积的变化已大到足以使面积比发生显著变化的程度，那么一定有某个重要的色谱问题存在，比如进样量改变太大，样品组分浓度和内标浓度 之间有很大的差别，检测器非线性等。进样量应足够小并保持不变，这样才不致于造成检测器和积分装置饱和。如果认为方法比较可靠，而色谱固看来也是正常的 话，应着重检查积分装置和设置、斜率和峰宽定位。对积分装置发生怀疑的最有力的证据是：面积比可变，而峰高比保持相对恒定，
在制作内标标准曲线时应注意什么?
在用内标法做色话定量分析时，先配制一定重量比的被测组分和内标样品的混合物做色谱分析，测量峰面积，做重量比和面积比的关系曲线，此曲线即为 标准曲线。在实际样品分析时所采用的色谱条件应尽可能与制作标准曲线时所用的条件一致，因此，在制作标准曲线时，不仅要注明色谱条件(如固定相、柱温、载 气流速等) ，还应注明进样体积和内标物浓度。在制作内标标准曲线时，各点并不完全落在直线上，此时应求出面积比和重量比的比值与其平均位的标准偏差，在使 用过程中应定期进行单点校正，若所得值与平均值的偏差小于2，曲线仍可使用，若大于2，则应重作曲线，如果曲线在铰短时期内即产生变动，则不宜使用内标法 定量。