[摘要]目的：探讨刺蒺藜血清对黑素瘤细胞增殖及黑素合成的影响。方法：体外培养小鼠B16黑素瘤细胞，制备大鼠含药血清，分别采用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT法）和NaOH裂解法检测细胞增殖及黑素含量。结果：刺蒺藜对黑素细胞增殖及黑素含量具有低剂量(10g)抑制、高剂量(30g)促进作用(P [关键词]刺蒺藜；含药血清；细胞增殖；黑素合成 [中图分类号]R758[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2011）01-0063-03 Effects of serum containing Tribulus terrestris on proliferation and melanogenesis in cultured B16 melanoma cells YANG Liu,XIE Jia-bao,HONG Xun-qiang,LIU Li-li,MA Ling-ling (Department of Dermatology, Integrative Medicine Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510315, Guangdong,China) Abstract:ObjectiveTo observe the effects of serum containing Tribulus terrestris on proliferation and melanogenesis in B16 melanoma cells.MethodsB16 melanoma cells was cultured in vitro．Serum containing Tribulus terrestris was prepared．MTT and NaOH method were used to detect proliferation and melanogenesis respectively.ResultsThe serum containing Tribulus terrestris increased the amount of melanin at higher concentrations (30g) but acted to the reverse effect at lower concentrations(10g) (P0.05)． Conclusionsthe effects of serum containing Tribulus terrestris on proliferation and melanogenesis in B16 melanoma cells correlated with the concentration of Tribulus terrestris．It presented a two-way regulation on proliferation and melanogenesis in cultured B16 melanoma cells． Key words：Tribulus terrestris；serum containing；proliferation ；melanogenesis 色素障碍性疾病是临床上常见的皮肤病之一，而黑素细胞产生的黑素是决定皮肤颜色的主要因素。刺蒺藜作为治疗色素障碍性疾病的常用药物，我们既往的研究发现不同浓度刺蒺藜水提物以及含药血清对酪氨酸酶（TYR）活性有高浓度激活, 低浓度抑制的作用[1-2], 提示临床治疗不同色素代谢性疾病时刺蒺藜的用量应有所不同。为进一步研究这一问题, 我们采用中药血清学方法研究低、中、高三种给药剂量所制备的大鼠血清对B16黑素瘤细胞增殖及黑素合成的影响，旨在为刺蒺藜治疗色素性皮肤病的理论研究提供科学的实验依据。 1材料和方法 1.1 黑素瘤细胞株及来源：人Ａ375黑素瘤细胞株由中国科学院上海细胞研究所提供。 1.2 试剂：MTT(四甲基偶氮唑蓝)、二甲基亚砜（DMSO）、0.25%胰蛋白酶-EDTA（美国Sigma公司），DMEM培养液（高糖）、10%胎牛血清（美国Gibco公司），其它试剂均为国产分析纯。 1.3 实验药物：①实验用药材刺蒺藜购自南方医科大学南方医院中药房，经南方医科大学中医系中药教研室严格鉴定；②补骨脂素（甲氧沙林片）由重庆华邦制药有限公司馈赠, 批号：20021201。 1.4 实验动物：清洁级wistar雌性大鼠，体重200～250g，购自南方医科大学实验动物中心。 1.5 主要仪器：倒置显微镜（Nikon公司），自动酶标仪（芬兰Thermo公司）等。 1.6实验方法 1.6.1 中药水提取液的制备：刺蒺藜100g经鉴定后置砂锅内, 加相当于药材量的8倍的蒸馏水浸泡2h，煮沸30min过滤。药渣加5倍水继续煎煮，煮沸30min过滤。合并两次滤液，于水浴上分别浓缩成每毫升相当于原生药0.2g的中药药液。 1.6.2 补骨脂素混悬液的制备：取8-甲氧补骨脂素片5mg×6片，研磨成极细胞粉，加少量单蒸水，再研成糊状，加水10ml 再研，移入100ml量筒，再加水20ml研磨, 移入量筒，反复数次，直到将所有白色粉状物全部移入量筒。定容至100ml（0.3mg/ml），移入棕色瓶中，4℃保存备用。 1.6.3 大鼠药物血清制备：将30只雌性大鼠随机分成5组, 每组6只, 按60kg人每日白蒺藜30、20、10(高、中、低)三种剂量换算大鼠用量, 中药组三组随机给予0.2g/ml刺蒺藜水提液1.5/100g、1ml/100g、0.5ml /100g；阳性对照组给予0.3g /ml的补骨脂素混悬液（用前摇匀）；空白对照组给予等量单蒸水。每天上午给大鼠灌胃1次，连续灌胃7天，末次给药后1.5～2h，以 11%氨基甲酸乙酯腹腔注射（11g/kg）麻醉大鼠，无菌条件下，从腹主动脉取血，3 000r离心20min，分离提取血清，分离血清，经0.22μm滤膜抽滤除菌，分装后置于56℃水浴中灭活30min[3]，-20℃冰箱保存备用。 1.6.4 小鼠B16黑素瘤细胞的培养及传代：细胞以按4×104个/孔接种于96孔板，用含10%胎牛血清的DMEM培养基，在37℃及5% CO2下孵育常规培养，待细胞生长至80%左右融合状态，0.25%胰酶-EDTA消化，以每瓶约105个进行传代至25cm2，每3天传代1次。 1.6.5 黑素瘤细胞增殖的测定[4-5]：采用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT法)，取对数生长期细胞常规消化，调整细胞为5×104个/ml，取100μl接种于96孔板，37℃及5% CO2下孵育24h后，分别加入含不同剂量药物血清的培养液200μl，血清浓度为10%，以空白组血清作对照，每份血清设3个复孔，常规培养48h后，每孔加入5g/L的MTT溶液20μl，继续孵育4h，弃上清液，每孔加150μl DMSO，振荡10min，在酶标仪490nm波长下测量各孔吸光度值，用吸光度值表示细胞增殖。
1.6.6 黑素合成含量测定[6-7]：采用NaOH裂解法，黑素细胞接种方法同上，设立对照组同前。药物作用48h后，弃上清液，弃上清液，用不含Ca2+和Mg2+的PBS液洗2遍，然后加入100μl1N NaOH(含10%DMSO)在37℃水浴保温2h，用酶标仪测定490nm波长的吸光度值，用吸光度值表示黑素含量。 1.7 统计学方法：利用SPSS13.0统计软件进行方差分析，P 2结果 2.1 含药血清对B16黑素瘤细胞增殖的影响：结果见表1。五组含药大鼠血清作用于黑素瘤细胞于48h后，经方差分析五组间差异有显著性（F=21.983，P0.05)。与阳性对照组相比较，低剂量组具有明显抑制细胞增殖作用（P0.05）。 2.2 含药血清对B16黑素瘤细胞黑素合成的影响：结果见表2。五组含药大鼠血清作用于黑素瘤细胞48 h后，经方差分析五组间差异有显著性（F=14.349，P0.05)。与阳性对照组相比较，低剂量组具有明显抑制细胞增殖作用（P0.05）。 3讨论 传统的中药药理体外实验，是将单味中药或复方制剂直接加入到体外细胞反应体系中进行，这种方法本身存在一些弊端。比如：中药绝大部分情况下是口服给药,在经过胃肠道和肝脏代谢后,最后进入血液的并不完全是原药成分，而且中药本身由多种成分组成,这种多成分的整体效应并非等于各部分效应之和，其提取物的理化性质不十分恒定，有可能对体外实验产生干扰作用，必然导致离体反应体系生理活性的改变，从而影响实验结果的正确性、真实性和可靠性，影响药效的判断和评价。 本研究模拟体内环境采用中药血清药理学研究方法进行，研究含药血清对体外培养的小鼠B16黑素瘤细胞增殖及黑素合成的影响。结果显示，白蒺藜低、中、高三种给药剂量大鼠血清对黑素瘤细胞增殖及黑素合成的作用不同。高剂量组血清（30g）对黑素瘤细胞增殖及黑素合成具有促进作用，低剂量组血清（10g）对黑素瘤细胞增殖及黑素合成具有抑制作用，而中剂量组血清（20g）对黑素瘤细胞增殖及黑素合成的影响倾向于促进作用，但其促进作用不明显，这与不同浓度白蒺藜水提物表现出对酪氨酸酶活性的双向调节作用以及白蒺藜血清对酪氨酸酶活性的双向调节作用[1-2]相一致。综合我们的实验结果，提示刺蒺藜对色素代谢的调节与剂量密切相关，刺蒺藜的双向调节作用在临床上治疗色素代谢障碍性皮肤病时值得借鉴。当然，刺蒺藜双向调节作用的内在机理以及如何把握刺蒺藜浓度的临界点等关键问题仍有待更深入的研究，解决这些问题将对临床使用白蒺藜治疗色素代谢障碍性疾病会有更好的指导作用。 [参考文献] [1]邓燕,杨柳.不同浓度的中药刺蒺藜对黑素细胞和酪氨酸酶的作用[J].第一军医大学学报,2002,22(11)∶1017-1019． [2]杨柳,赖梅生,蔡红兵.白蒺藜血清对酪氨酸酶活性的双向调节作用[J].陕西中医,2005,26（4）：370-373． [3]吴水生,张小如,阮时宝．血清药理学研究中含药血清是否需灭活的探讨[J]．福建中医学院学报,2001,11(2):45-46． [4]Im SJ,Kim KN,Yun YG,et al．Effect of Radix Ginseng and Radix Trichosanthis on melanogenesis stimulation in murine B16 melanoma cells by umberiferae plant extracts and their coumarin constituents[J]．Biol Pharm Bull,2005,28:1229-1233． [5]Mosmann T．Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival：application to proliferation and cytotoxicity assays[J]．J Immunol Methods,1983,65 (1-2):55- 63． [6]雷铁池,朱文元,夏明玉,等．甘草酸、熊果苷及氢醌对小鼠黑素瘤细胞黑素生成影响的比较研究[J]．中华皮肤科杂志,2000,29(1):69-72． [7]Mun YJ,Lee SW,Jeong HW,et al．Inhibitory effect of miconazole on melanogenesis[J]．Biol Pharm Bul,2004,27(6):806-809． [收稿日期]2010-10-18[修回日期]2010-12-21 编辑/张惠娟
[摘要]目的：探讨刺蒺藜血清对黑素瘤细胞增殖及黑素合成的影响。方法：体外培养小鼠B16黑素瘤细胞，制备大鼠含药血清，分别采用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT法）和NaOH裂解法检测细胞增殖及黑素含量。结果：刺蒺藜对黑素细胞增殖及黑素含量具有低剂量(10g)抑制、高剂量(30g)促进作用(P [关键词]刺蒺藜；含药血清；细胞增殖；黑素合成 [中图分类号]R758[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2011）01-0063-03 Effects of serum containing Tribulus terrestris on proliferation and melanogenesis in cultured B16 melanoma cells YANG Liu,XIE Jia-bao,HONG Xun-qiang,LIU Li-li,MA Ling-ling (Department of Dermatology, Integrative Medicine Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510315, Guangdong,China) Abstract:ObjectiveTo observe the effects of serum containing Tribulus terrestris on proliferation and melanogenesis in B16 melanoma cells.MethodsB16 melanoma cells was cultured in vitro．Serum containing Tribulus terrestris was prepared．MTT and NaOH method were used to detect proliferation and melanogenesis respectively.ResultsThe serum containing Tribulus terrestris increased the amount of melanin at higher concentrations (30g) but acted to the reverse effect at lower concentrations(10g) (P0.05)． Conclusionsthe effects of serum containing Tribulus terrestris on proliferation and melanogenesis in B16 melanoma cells correlated with the concentration of Tribulus terrestris．It presented a two-way regulation on proliferation and melanogenesis in cultured B16 melanoma cells． Key words：Tribulus terrestris；serum containing；proliferation ；melanogenesis 色素障碍性疾病是临床上常见的皮肤病之一，而黑素细胞产生的黑素是决定皮肤颜色的主要因素。刺蒺藜作为治疗色素障碍性疾病的常用药物，我们既往的研究发现不同浓度刺蒺藜水提物以及含药血清对酪氨酸酶（TYR）活性有高浓度激活, 低浓度抑制的作用[1-2], 提示临床治疗不同色素代谢性疾病时刺蒺藜的用量应有所不同。为进一步研究这一问题, 我们采用中药血清学方法研究低、中、高三种给药剂量所制备的大鼠血清对B16黑素瘤细胞增殖及黑素合成的影响，旨在为刺蒺藜治疗色素性皮肤病的理论研究提供科学的实验依据。 1材料和方法 1.1 黑素瘤细胞株及来源：人Ａ375黑素瘤细胞株由中国科学院上海细胞研究所提供。 1.2 试剂：MTT(四甲基偶氮唑蓝)、二甲基亚砜（DMSO）、0.25%胰蛋白酶-EDTA（美国Sigma公司），DMEM培养液（高糖）、10%胎牛血清（美国Gibco公司），其它试剂均为国产分析纯。 1.3 实验药物：①实验用药材刺蒺藜购自南方医科大学南方医院中药房，经南方医科大学中医系中药教研室严格鉴定；②补骨脂素（甲氧沙林片）由重庆华邦制药有限公司馈赠, 批号：20021201。 1.4 实验动物：清洁级wistar雌性大鼠，体重200～250g，购自南方医科大学实验动物中心。 1.5 主要仪器：倒置显微镜（Nikon公司），自动酶标仪（芬兰Thermo公司）等。 1.6实验方法 1.6.1 中药水提取液的制备：刺蒺藜100g经鉴定后置砂锅内, 加相当于药材量的8倍的蒸馏水浸泡2h，煮沸30min过滤。药渣加5倍水继续煎煮，煮沸30min过滤。合并两次滤液，于水浴上分别浓缩成每毫升相当于原生药0.2g的中药药液。 1.6.2 补骨脂素混悬液的制备：取8-甲氧补骨脂素片5mg×6片，研磨成极细胞粉，加少量单蒸水，再研成糊状，加水10ml 再研，移入100ml量筒，再加水20ml研磨, 移入量筒，反复数次，直到将所有白色粉状物全部移入量筒。定容至100ml（0.3mg/ml），移入棕色瓶中，4℃保存备用。 1.6.3 大鼠药物血清制备：将30只雌性大鼠随机分成5组, 每组6只, 按60kg人每日白蒺藜30、20、10(高、中、低)三种剂量换算大鼠用量, 中药组三组随机给予0.2g/ml刺蒺藜水提液1.5/100g、1ml/100g、0.5ml /100g；阳性对照组给予0.3g /ml的补骨脂素混悬液（用前摇匀）；空白对照组给予等量单蒸水。每天上午给大鼠灌胃1次，连续灌胃7天，末次给药后1.5～2h，以 11%氨基甲酸乙酯腹腔注射（11g/kg）麻醉大鼠，无菌条件下，从腹主动脉取血，3 000r离心20min，分离提取血清，分离血清，经0.22μm滤膜抽滤除菌，分装后置于56℃水浴中灭活30min[3]，-20℃冰箱保存备用。 1.6.4 小鼠B16黑素瘤细胞的培养及传代：细胞以按4×104个/孔接种于96孔板，用含10%胎牛血清的DMEM培养基，在37℃及5% CO2下孵育常规培养，待细胞生长至80%左右融合状态，0.25%胰酶-EDTA消化，以每瓶约105个进行传代至25cm2，每3天传代1次。 1.6.5 黑素瘤细胞增殖的测定[4-5]：采用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT法)，取对数生长期细胞常规消化，调整细胞为5×104个/ml，取100μl接种于96孔板，37℃及5% CO2下孵育24h后，分别加入含不同剂量药物血清的培养液200μl，血清浓度为10%，以空白组血清作对照，每份血清设3个复孔，常规培养48h后，每孔加入5g/L的MTT溶液20μl，继续孵育4h，弃上清液，每孔加150μl DMSO，振荡10min，在酶标仪490nm波长下测量各孔吸光度值，用吸光度值表示细胞增殖。
1.6.6 黑素合成含量测定[6-7]：采用NaOH裂解法，黑素细胞接种方法同上，设立对照组同前。药物作用48h后，弃上清液，弃上清液，用不含Ca2+和Mg2+的PBS液洗2遍，然后加入100μl1N NaOH(含10%DMSO)在37℃水浴保温2h，用酶标仪测定490nm波长的吸光度值，用吸光度值表示黑素含量。 1.7 统计学方法：利用SPSS13.0统计软件进行方差分析，P 2结果 2.1 含药血清对B16黑素瘤细胞增殖的影响：结果见表1。五组含药大鼠血清作用于黑素瘤细胞于48h后，经方差分析五组间差异有显著性（F=21.983，P0.05)。与阳性对照组相比较，低剂量组具有明显抑制细胞增殖作用（P0.05）。 2.2 含药血清对B16黑素瘤细胞黑素合成的影响：结果见表2。五组含药大鼠血清作用于黑素瘤细胞48 h后，经方差分析五组间差异有显著性（F=14.349，P0.05)。与阳性对照组相比较，低剂量组具有明显抑制细胞增殖作用（P0.05）。 3讨论 传统的中药药理体外实验，是将单味中药或复方制剂直接加入到体外细胞反应体系中进行，这种方法本身存在一些弊端。比如：中药绝大部分情况下是口服给药,在经过胃肠道和肝脏代谢后,最后进入血液的并不完全是原药成分，而且中药本身由多种成分组成,这种多成分的整体效应并非等于各部分效应之和，其提取物的理化性质不十分恒定，有可能对体外实验产生干扰作用，必然导致离体反应体系生理活性的改变，从而影响实验结果的正确性、真实性和可靠性，影响药效的判断和评价。 本研究模拟体内环境采用中药血清药理学研究方法进行，研究含药血清对体外培养的小鼠B16黑素瘤细胞增殖及黑素合成的影响。结果显示，白蒺藜低、中、高三种给药剂量大鼠血清对黑素瘤细胞增殖及黑素合成的作用不同。高剂量组血清（30g）对黑素瘤细胞增殖及黑素合成具有促进作用，低剂量组血清（10g）对黑素瘤细胞增殖及黑素合成具有抑制作用，而中剂量组血清（20g）对黑素瘤细胞增殖及黑素合成的影响倾向于促进作用，但其促进作用不明显，这与不同浓度白蒺藜水提物表现出对酪氨酸酶活性的双向调节作用以及白蒺藜血清对酪氨酸酶活性的双向调节作用[1-2]相一致。综合我们的实验结果，提示刺蒺藜对色素代谢的调节与剂量密切相关，刺蒺藜的双向调节作用在临床上治疗色素代谢障碍性皮肤病时值得借鉴。当然，刺蒺藜双向调节作用的内在机理以及如何把握刺蒺藜浓度的临界点等关键问题仍有待更深入的研究，解决这些问题将对临床使用白蒺藜治疗色素代谢障碍性疾病会有更好的指导作用。 [参考文献] [1]邓燕,杨柳.不同浓度的中药刺蒺藜对黑素细胞和酪氨酸酶的作用[J].第一军医大学学报,2002,22(11)∶1017-1019． [2]杨柳,赖梅生,蔡红兵.白蒺藜血清对酪氨酸酶活性的双向调节作用[J].陕西中医,2005,26（4）：370-373． [3]吴水生,张小如,阮时宝．血清药理学研究中含药血清是否需灭活的探讨[J]．福建中医学院学报,2001,11(2):45-46． [4]Im SJ,Kim KN,Yun YG,et al．Effect of Radix Ginseng and Radix Trichosanthis on melanogenesis stimulation in murine B16 melanoma cells by umberiferae plant extracts and their coumarin constituents[J]．Biol Pharm Bull,2005,28:1229-1233． [5]Mosmann T．Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival：application to proliferation and cytotoxicity assays[J]．J Immunol Methods,1983,65 (1-2):55- 63． [6]雷铁池,朱文元,夏明玉,等．甘草酸、熊果苷及氢醌对小鼠黑素瘤细胞黑素生成影响的比较研究[J]．中华皮肤科杂志,2000,29(1):69-72． [7]Mun YJ,Lee SW,Jeong HW,et al．Inhibitory effect of miconazole on melanogenesis[J]．Biol Pharm Bul,2004,27(6):806-809． [收稿日期]2010-10-18[修回日期]2010-12-21 编辑/张惠娟