山东大学实验报告 2017 年 5 月 12 日
班级： 生科15.2 学号： [1**********]9
科目： 细胞生物学实验 姓名： 郑建豪
小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数
【实验目的】
1. 学习掌握细胞培养的基本原理以及具体方法，并对小鼠脾细胞进行原代培养；
2. 掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用；
3. 学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法；
4. 学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数；
【实验原理】
1. 细胞培养
细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。
高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。
细胞培养的意义:具有其他生物技术无可比拟的优点；培养条件易改变和控制，便于单因子分析；便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察；在生物学的各个领域（如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被广泛应用。 细胞培养的局限性：在脱离机体复杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有一定距离；观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况；细胞培养得到的产物少。 培养细胞的条件有水的质量、无菌环境，最适温度、渗透压、气体条件、最适PH 、营养条件和培养基质等。
2. 细胞死活鉴定
细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。 活细胞和死亡细胞在生理技能和性质上主要存在一下差异：
① 细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，
只允许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。基于此，发展出了以
台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶或溴化乙啶等为染料鉴别细胞生死状态的方法，上述染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。此外，应用植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的生死状态。活细胞的原生质具有选择透过性，死细胞因其原生质的选择透过性已遭破坏，故与高渗透压溶液接触时不产生质壁分离。
② 代谢上的差异：活细胞中新陈代谢作用强，细胞内的酶具有较强的活性和还原能力。基于此，发展处了以荧光素二乙酸酯（FDA ）、荧光素二丙酸酯、荧光素二丁酸酯或荧光素二苯甲酰酯等酯化的荧光素鉴别细胞生死状态的方法，上述酯化的荧光素亲脂性提高，容易被细胞吸收进入，活细胞内的酯酶具有较强的活性，可将酯化的荧光素分解而释放出能发荧光的荧光素，该物质不能自由透过活的细胞膜，积累在细胞内，荧光显微镜下显示有明亮的绿色或黄绿色荧光；而死亡细胞内的酯酶因失去活性，不能分解酯化的荧光素，荧光显微镜下显示不发光。另外，可用亚甲基蓝为染料鉴定酵母细胞的生死状态。亚甲基蓝是一无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。活细胞因具有较强的还原能力，能使亚甲蓝从蓝色的氧化型变成无色的还原型，故活的酵母细胞在用亚甲基蓝染色后显示无色；死亡酵母细胞或代谢缓慢的衰老酵母细胞，因无还原能力或还原能力极弱，使亚甲蓝仍处于氧化态，故呈现蓝色或淡蓝色。
3. 血球计数板的使用
血球计数板是一块特制的厚载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个方格网(如图3) 。每个方格网共分9大格，其中间的一大格(又称为计数室) 常被用作微生物的计数。计数室的刻度有两种：一种是大方格分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即每个大方格都由400个小方格组成(图4) 。 每个大方格边长为1mm ，则每一大方格的面积为1mm2，每个小方格的面积为1／400mm2 ，盖上盖玻片后， 盖玻片与计数室底部之间的高度为0.1mm ，所以每个计数室(大方格) 的体积为0.1mm3 ，每个小方格的体积 为l ／4000mm3 。使用血球计数板直接计数时，先要测定每个小方格(或中方格) 中微生物的数量，再换算成每毫升菌液(或每克样品) 中微生物细胞的数量。
图1. 血球板构造 图2. 血球计数板网格的分区和分格
【实验用品】
1. 材料
小鼠脾脏；
2. 试剂
PBS 缓冲溶液、培养液、台盼蓝、伊红；
3. 器材
解剖剪、解剖镊、眼科剪、眼科镊、培养皿、纱布块、吸管、橡皮头、烧杯、移液枪、
注射器、针头、Eppendorf 管（上述器具彻底清洗、消毒、烤干、包装好）；倒置相差显微镜、酒精灯、酒精棉球、试管架、解剖板等。
【操作步骤】
一. 原代脾细胞培养
1、 取材：
取小白鼠一只，采用断头法处死，清水洗净小白鼠并浸于75%酒精中灭菌3min ，取出转入超净工作台内的解剖盘内，无菌操作打开腹腔，取出脾脏，去除周围的脂肪组织，镊起脾脏用PBS 液自上而下冲洗1-2次，转入无菌玻璃培养皿中，待用。
2、分离脾细胞：
用滴管先向上述无菌玻璃培养皿中滴入PBS 液30滴，再用L 形针头注射器在皿内吸取PBS 液0.2ml ，然后将其沿脾脏长轴方向注射入脾内，用针尖在脾脏上扎眼，并用L 形针头轻刮脾脏表面挤出脾细胞，用滴管吸皿中的PBS 液冲洗脾脏并吹散挂出的脾细胞，稍微倾斜并静置1-2min ，吸取上述静置后的脾细胞悬液上清部分放入Eppendorf 管，以3000转/分离心1-2min 。
3、培养脾细胞：
从超净工作台中区塑料培养皿一个，用“枪（1ml ）”加入细胞培养液2ml ，并在皿上做记号，待用。取上述离心后的Eppendorf 管，在超净工作台内打开弃去上清液，用“枪（200μl ）”吸取塑料皿中的培养液400ul ，加入弃去上清液的Eppendorf 管中，用枪头吹匀管底的脾细胞，然后吸取200ul 脾细胞悬液接种于上述塑料培养皿中，混匀，然后放入37℃二氧化碳培养箱中培养。
二. 细胞死活鉴定 台盼蓝法：
1、 试剂配制：
用生理盐水配置0.4%台盼蓝染液，备用。
2、 细胞悬液制备：
将生长有贴壁型细胞的培养瓶（皿）中的培养液倒入干净试管中，向培养瓶（皿）中加入0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA混合消化液1-2ml ，静置3-5min ，待见到细胞变圆，彼此不连接为止，弃去混合消化液并将上述试管中的培养液倒回培养瓶中，用滴管轻轻吹打细胞，制成细胞悬液。
3、 染色制片：
取0.5ml 细胞悬液放于干净的试管中，加1-2滴（约0.1ml ）染液，混合，2min 后制成临时装片，镜检。
4、 染色结果：
死细胞染成蓝色，活细胞不着色。
三. 用血球计数板进行细胞计数
1、 染色计数：
取上述步骤二所制备0.5ml 细胞悬液放于干净的试管中，加1-2滴（约0.1ml ）染液，混合2-5min ，滴加少许染色后的细胞悬液于放有盖片的血球计数板的斜面上，使悬液自然充满计数板小室（注意：不要使小室内有气泡产生，否则要重新滴加；在普通光镜10 物镜下计数四个大格内的细胞数，压线者数上不数下，数左不数右）。
2、根据染色结果计算活细胞率：
依据死细胞染成蓝色、活细胞不着色的原则计数死细胞数和细胞总数，以如下公式计算细胞存活率：
活细胞率（%）=细胞总数-死细胞数⨯100% 细胞总数
【实验结果】：
A. 细胞原代培养结果：
图3. 细胞培养结果（宏观） 图4. 显微镜下细胞培养结果（100x ）
B. 细胞死活鉴定结果：
图5. 细胞死活鉴定结果，蓝色为死细胞，无色为活细胞（400x ）
C. 细胞计数结果：
用血球计数板计数，分别计算了红细胞计数区域的五个中方格，计数结果如下：
由表可得五个中方块中活细胞数为288个 总数为 508个
则存活率=
288=56.7% 508
【注意事项】
1、 小鼠一定要将血放干净并且在酒精中充分浸泡3min ，防止杂菌污染无菌操作台；
2、 为近一步保证无菌操作台的无菌环境，可在玻璃挡板口点一酒精灯，一般操作都在酒精灯火焰旁操作；
3、 取小鼠脾时注意保持其完整，注入缓冲液要慢而准且适量，不要撑破脾脏，保证细
胞分散游离出来， 也不能使游离的细胞中含有块儿状物质；
4、 培养液PH 为7.0～7.4，其中加有酚酞，正常状况细胞生长过程代谢物使PH 下降，培养液的颜色改变 呈黄色，因此可通过培养液颜色变化初步判断细胞生长状况；
5、 生长状况良好的细胞膜和核完整，细胞质透明，而细胞质出现较多颗粒状或空泡证明细胞衰老。除游 离期和衰退期外细胞一般贴壁生长。游离期细胞一般圆形，折光率高，而衰退期细胞皱缩，透明度下降，立体感很差，较易区分；
6、 倒置显微镜将物镜与载物台间的空间解放，可以允许连同培养皿一同观察。
【思考题】：
1. 抑制肿瘤细胞增殖药物的筛选方法
1）以端粒酶活性为作用靶点筛选抗肿瘤药物
端粒是染色体特殊结构，起着保护染色体的完整和稳定性的作用 ，端粒酶是一种核糖核蛋白返转录酶，由RNA 和蛋白质组成，可以以自身的RNA 为模板合成端粒末端。已发现在正常的体细胞和良性肿瘤组织中端粒酶活性是阴性，而在人体恶性肿瘤组织和人的肿瘤细胞株中都表达了很高的活性 。因此，认为端粒酶与恶性肿瘤的发生发展有密切的关系，有可能成为肿瘤治疗的靶点。
2）应用快速荧光素测定法筛选抗肿瘤药物
快速荧光素测定法是一种近几年发展起来的应用非常广泛的体外药物敏感性测定方法，其原理为采用一些特殊的荧光染料，对细胞的特定成份进行染色或标记。或通过细胞酶的作用使无荧光性的材料分解或转换为荧光材料，通过测定荧光强度从而测定出活细胞的量。现在普遍采用一种特殊的荧光染FDAL1u(Fluoreseein diacetate)，在正常情况下它不具有荧光，但当它加人到具有完整细胞膜的肿瘤细胞的营养液中时，由于细胞分泌的水解酶的作用，FDA 水解释放出具有强烈荧光的荧光素。死亡的细胞由于其机能已受到抑制或破坏，FDA 水解水平大大降低，这样通过测定培养液中荧光的强度，就能测定活细胞的数量，从而测定出药物对细胞的作用，推测其抗肿瘤的效果。
3）应用结晶紫染色测定法筛选抗肿瘤药物
结晶紫染色测定法是由Gillies 等于1986年提出来的一种单层细胞培养的体外药物敏感性测定方法。其原理是结晶紫染色可通过细胞的特定摄生法而选择性地被细胞核吸收，死亡的细胞几乎不吸收结晶紫染料。而被核(DNA)吸收的结晶紫又可为有机溶媒提取，通过测定提取液的光密度值(OD)，就可测定活细胞的数量。近几年经过不断改进，结晶紫染色法已能适用于大量抗肿瘤药物的药敏测定，具有灵敏度高、重现性好的特点。
4）应用噬菌体筛选抗肿瘤药物
已确证多种病毒能引起动物肿瘤，噬菌体是细菌的病毒，与肿瘤病毒相似，噬菌体的DNA 也可整合到细菌染色体上，随细菌DNA 复制分裂并传至子代细菌，不引起细菌裂解但可引起细菌部分生物学性状发生改变¨ 。有些物质可使前噬菌体DNA 从溶原性细菌染色体上脱落，复制合成并释放出完整的噬菌体，致使敏感的细菌感染裂解，这种作用称为诱导作用。有些有诱导作用的物质常同时具有抗肿瘤作用，因此在研究肿瘤病毒一肿瘤细胞间关系时，常与溶原性噬菌体一溶原性细菌模型相比拟，同时启发人们用“诱导噬菌体作用”筛选抗肿瘤药物，并且已经取得一定成效。
5）细胞水平和动物水平相结合筛选具有抗肿瘤作用的中药
我国的传统医药在肿瘤的治疗方面有其独特的理论，天然中药以其疗效广泛、确切、毒性低受到国内外的广泛关注。近年来，从中药中提取抗肿瘤有效成份日益得到人们的重视，因此确立一套筛选抗肿瘤中药有效成份的方法也就越来越有必要了。经过长时间的摸索，除以上所述的几种方法外，对具有抗肿瘤作用中药的筛选己形成了一套具有自身特点的方法，现在
一般采取的方法是选取几种肿瘤细胞系，以培养细胞为实验模型，用MTT 实验、软琼脂等方法，在细胞水平检测中药提取物或单体的体外抗肿瘤作用，筛选出能够以较低浓度抑制肿瘤细胞生长或增殖的药物。在此基础上，以荷瘤小鼠为实验模型，在动物水平检测其在体抑瘤作用。
2. 诱导肿瘤细胞发生凋亡的药物筛选方法
1) 诱导肿瘤细胞凋亡
肿瘤细胞在5% CO2孵箱培养至对数生长期，镜下计数为1×106/ml，加入24孔板，每孔1 ml 细胞悬液。用无血清细胞悬液将待测药物配制成1 mg/ml溶液；每组药物分别设4个浓度：12.5、25、50、100 μg/ml；分别加入24孔培养板，作3个复孔。置于5％ CO2孵箱培养。
2)Annexin V/PI流式双参数分析
分别于加入药物作用2、4和8小时，吸取培养细胞悬液，用4℃预冷的PBS 洗细胞2次，用250 μl 结合缓冲液重悬细胞，使其浓度为1×106/ml；取100 μl 细胞悬液，加5 μlAnnexin V/FITC和10 μl 的碘化丙锭；混匀后室温避光孵育15分钟；用PBS 洗涤2次，进行流式细胞仪(FACS)分析。Annexin V-FITC/PI双参数进行调试，以此条件进行细胞凋亡和细胞坏死率检测。横坐标表示荧光强度，纵坐标表示细胞数，两个峰中的左边峰表示阴性峰，右峰表示凋亡峰，右峰曲线下面积越大凋亡就越多。根据所测数据计算细胞凋亡率和继发性坏死率。
3) 统计学分析
各组细胞凋亡率均取3个样本的均值，以X ±SD 表示，多个均数的两两比较采用《中国医学百科全书•医学统计学》统计软件包 PEMS 3.1软件进行检验。
山东大学实验报告 2017 年 5 月 12 日
班级： 生科15.2 学号： [1**********]9
科目： 细胞生物学实验 姓名： 郑建豪
小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数
【实验目的】
1. 学习掌握细胞培养的基本原理以及具体方法，并对小鼠脾细胞进行原代培养；
2. 掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用；
3. 学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法；
4. 学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数；
【实验原理】
1. 细胞培养
细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。
高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。
细胞培养的意义:具有其他生物技术无可比拟的优点；培养条件易改变和控制，便于单因子分析；便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察；在生物学的各个领域（如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被广泛应用。 细胞培养的局限性：在脱离机体复杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有一定距离；观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况；细胞培养得到的产物少。 培养细胞的条件有水的质量、无菌环境，最适温度、渗透压、气体条件、最适PH 、营养条件和培养基质等。
2. 细胞死活鉴定
细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。 活细胞和死亡细胞在生理技能和性质上主要存在一下差异：
① 细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，
只允许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。基于此，发展出了以
台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶或溴化乙啶等为染料鉴别细胞生死状态的方法，上述染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。此外，应用植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的生死状态。活细胞的原生质具有选择透过性，死细胞因其原生质的选择透过性已遭破坏，故与高渗透压溶液接触时不产生质壁分离。
② 代谢上的差异：活细胞中新陈代谢作用强，细胞内的酶具有较强的活性和还原能力。基于此，发展处了以荧光素二乙酸酯（FDA ）、荧光素二丙酸酯、荧光素二丁酸酯或荧光素二苯甲酰酯等酯化的荧光素鉴别细胞生死状态的方法，上述酯化的荧光素亲脂性提高，容易被细胞吸收进入，活细胞内的酯酶具有较强的活性，可将酯化的荧光素分解而释放出能发荧光的荧光素，该物质不能自由透过活的细胞膜，积累在细胞内，荧光显微镜下显示有明亮的绿色或黄绿色荧光；而死亡细胞内的酯酶因失去活性，不能分解酯化的荧光素，荧光显微镜下显示不发光。另外，可用亚甲基蓝为染料鉴定酵母细胞的生死状态。亚甲基蓝是一无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。活细胞因具有较强的还原能力，能使亚甲蓝从蓝色的氧化型变成无色的还原型，故活的酵母细胞在用亚甲基蓝染色后显示无色；死亡酵母细胞或代谢缓慢的衰老酵母细胞，因无还原能力或还原能力极弱，使亚甲蓝仍处于氧化态，故呈现蓝色或淡蓝色。
3. 血球计数板的使用
血球计数板是一块特制的厚载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个方格网(如图3) 。每个方格网共分9大格，其中间的一大格(又称为计数室) 常被用作微生物的计数。计数室的刻度有两种：一种是大方格分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即每个大方格都由400个小方格组成(图4) 。 每个大方格边长为1mm ，则每一大方格的面积为1mm2，每个小方格的面积为1／400mm2 ，盖上盖玻片后， 盖玻片与计数室底部之间的高度为0.1mm ，所以每个计数室(大方格) 的体积为0.1mm3 ，每个小方格的体积 为l ／4000mm3 。使用血球计数板直接计数时，先要测定每个小方格(或中方格) 中微生物的数量，再换算成每毫升菌液(或每克样品) 中微生物细胞的数量。
图1. 血球板构造 图2. 血球计数板网格的分区和分格
【实验用品】
1. 材料
小鼠脾脏；
2. 试剂
PBS 缓冲溶液、培养液、台盼蓝、伊红；
3. 器材
解剖剪、解剖镊、眼科剪、眼科镊、培养皿、纱布块、吸管、橡皮头、烧杯、移液枪、
注射器、针头、Eppendorf 管（上述器具彻底清洗、消毒、烤干、包装好）；倒置相差显微镜、酒精灯、酒精棉球、试管架、解剖板等。
【操作步骤】
一. 原代脾细胞培养
1、 取材：
取小白鼠一只，采用断头法处死，清水洗净小白鼠并浸于75%酒精中灭菌3min ，取出转入超净工作台内的解剖盘内，无菌操作打开腹腔，取出脾脏，去除周围的脂肪组织，镊起脾脏用PBS 液自上而下冲洗1-2次，转入无菌玻璃培养皿中，待用。
2、分离脾细胞：
用滴管先向上述无菌玻璃培养皿中滴入PBS 液30滴，再用L 形针头注射器在皿内吸取PBS 液0.2ml ，然后将其沿脾脏长轴方向注射入脾内，用针尖在脾脏上扎眼，并用L 形针头轻刮脾脏表面挤出脾细胞，用滴管吸皿中的PBS 液冲洗脾脏并吹散挂出的脾细胞，稍微倾斜并静置1-2min ，吸取上述静置后的脾细胞悬液上清部分放入Eppendorf 管，以3000转/分离心1-2min 。
3、培养脾细胞：
从超净工作台中区塑料培养皿一个，用“枪（1ml ）”加入细胞培养液2ml ，并在皿上做记号，待用。取上述离心后的Eppendorf 管，在超净工作台内打开弃去上清液，用“枪（200μl ）”吸取塑料皿中的培养液400ul ，加入弃去上清液的Eppendorf 管中，用枪头吹匀管底的脾细胞，然后吸取200ul 脾细胞悬液接种于上述塑料培养皿中，混匀，然后放入37℃二氧化碳培养箱中培养。
二. 细胞死活鉴定 台盼蓝法：
1、 试剂配制：
用生理盐水配置0.4%台盼蓝染液，备用。
2、 细胞悬液制备：
将生长有贴壁型细胞的培养瓶（皿）中的培养液倒入干净试管中，向培养瓶（皿）中加入0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA混合消化液1-2ml ，静置3-5min ，待见到细胞变圆，彼此不连接为止，弃去混合消化液并将上述试管中的培养液倒回培养瓶中，用滴管轻轻吹打细胞，制成细胞悬液。
3、 染色制片：
取0.5ml 细胞悬液放于干净的试管中，加1-2滴（约0.1ml ）染液，混合，2min 后制成临时装片，镜检。
4、 染色结果：
死细胞染成蓝色，活细胞不着色。
三. 用血球计数板进行细胞计数
1、 染色计数：
取上述步骤二所制备0.5ml 细胞悬液放于干净的试管中，加1-2滴（约0.1ml ）染液，混合2-5min ，滴加少许染色后的细胞悬液于放有盖片的血球计数板的斜面上，使悬液自然充满计数板小室（注意：不要使小室内有气泡产生，否则要重新滴加；在普通光镜10 物镜下计数四个大格内的细胞数，压线者数上不数下，数左不数右）。
2、根据染色结果计算活细胞率：
依据死细胞染成蓝色、活细胞不着色的原则计数死细胞数和细胞总数，以如下公式计算细胞存活率：
活细胞率（%）=细胞总数-死细胞数⨯100% 细胞总数
【实验结果】：
A. 细胞原代培养结果：
图3. 细胞培养结果（宏观） 图4. 显微镜下细胞培养结果（100x ）
B. 细胞死活鉴定结果：
图5. 细胞死活鉴定结果，蓝色为死细胞，无色为活细胞（400x ）
C. 细胞计数结果：
用血球计数板计数，分别计算了红细胞计数区域的五个中方格，计数结果如下：
由表可得五个中方块中活细胞数为288个 总数为 508个
则存活率=
288=56.7% 508
【注意事项】
1、 小鼠一定要将血放干净并且在酒精中充分浸泡3min ，防止杂菌污染无菌操作台；
2、 为近一步保证无菌操作台的无菌环境，可在玻璃挡板口点一酒精灯，一般操作都在酒精灯火焰旁操作；
3、 取小鼠脾时注意保持其完整，注入缓冲液要慢而准且适量，不要撑破脾脏，保证细
胞分散游离出来， 也不能使游离的细胞中含有块儿状物质；
4、 培养液PH 为7.0～7.4，其中加有酚酞，正常状况细胞生长过程代谢物使PH 下降，培养液的颜色改变 呈黄色，因此可通过培养液颜色变化初步判断细胞生长状况；
5、 生长状况良好的细胞膜和核完整，细胞质透明，而细胞质出现较多颗粒状或空泡证明细胞衰老。除游 离期和衰退期外细胞一般贴壁生长。游离期细胞一般圆形，折光率高，而衰退期细胞皱缩，透明度下降，立体感很差，较易区分；
6、 倒置显微镜将物镜与载物台间的空间解放，可以允许连同培养皿一同观察。
【思考题】：
1. 抑制肿瘤细胞增殖药物的筛选方法
1）以端粒酶活性为作用靶点筛选抗肿瘤药物
端粒是染色体特殊结构，起着保护染色体的完整和稳定性的作用 ，端粒酶是一种核糖核蛋白返转录酶，由RNA 和蛋白质组成，可以以自身的RNA 为模板合成端粒末端。已发现在正常的体细胞和良性肿瘤组织中端粒酶活性是阴性，而在人体恶性肿瘤组织和人的肿瘤细胞株中都表达了很高的活性 。因此，认为端粒酶与恶性肿瘤的发生发展有密切的关系，有可能成为肿瘤治疗的靶点。
2）应用快速荧光素测定法筛选抗肿瘤药物
快速荧光素测定法是一种近几年发展起来的应用非常广泛的体外药物敏感性测定方法，其原理为采用一些特殊的荧光染料，对细胞的特定成份进行染色或标记。或通过细胞酶的作用使无荧光性的材料分解或转换为荧光材料，通过测定荧光强度从而测定出活细胞的量。现在普遍采用一种特殊的荧光染FDAL1u(Fluoreseein diacetate)，在正常情况下它不具有荧光，但当它加人到具有完整细胞膜的肿瘤细胞的营养液中时，由于细胞分泌的水解酶的作用，FDA 水解释放出具有强烈荧光的荧光素。死亡的细胞由于其机能已受到抑制或破坏，FDA 水解水平大大降低，这样通过测定培养液中荧光的强度，就能测定活细胞的数量，从而测定出药物对细胞的作用，推测其抗肿瘤的效果。
3）应用结晶紫染色测定法筛选抗肿瘤药物
结晶紫染色测定法是由Gillies 等于1986年提出来的一种单层细胞培养的体外药物敏感性测定方法。其原理是结晶紫染色可通过细胞的特定摄生法而选择性地被细胞核吸收，死亡的细胞几乎不吸收结晶紫染料。而被核(DNA)吸收的结晶紫又可为有机溶媒提取，通过测定提取液的光密度值(OD)，就可测定活细胞的数量。近几年经过不断改进，结晶紫染色法已能适用于大量抗肿瘤药物的药敏测定，具有灵敏度高、重现性好的特点。
4）应用噬菌体筛选抗肿瘤药物
已确证多种病毒能引起动物肿瘤，噬菌体是细菌的病毒，与肿瘤病毒相似，噬菌体的DNA 也可整合到细菌染色体上，随细菌DNA 复制分裂并传至子代细菌，不引起细菌裂解但可引起细菌部分生物学性状发生改变¨ 。有些物质可使前噬菌体DNA 从溶原性细菌染色体上脱落，复制合成并释放出完整的噬菌体，致使敏感的细菌感染裂解，这种作用称为诱导作用。有些有诱导作用的物质常同时具有抗肿瘤作用，因此在研究肿瘤病毒一肿瘤细胞间关系时，常与溶原性噬菌体一溶原性细菌模型相比拟，同时启发人们用“诱导噬菌体作用”筛选抗肿瘤药物，并且已经取得一定成效。
5）细胞水平和动物水平相结合筛选具有抗肿瘤作用的中药
我国的传统医药在肿瘤的治疗方面有其独特的理论，天然中药以其疗效广泛、确切、毒性低受到国内外的广泛关注。近年来，从中药中提取抗肿瘤有效成份日益得到人们的重视，因此确立一套筛选抗肿瘤中药有效成份的方法也就越来越有必要了。经过长时间的摸索，除以上所述的几种方法外，对具有抗肿瘤作用中药的筛选己形成了一套具有自身特点的方法，现在
一般采取的方法是选取几种肿瘤细胞系，以培养细胞为实验模型，用MTT 实验、软琼脂等方法，在细胞水平检测中药提取物或单体的体外抗肿瘤作用，筛选出能够以较低浓度抑制肿瘤细胞生长或增殖的药物。在此基础上，以荷瘤小鼠为实验模型，在动物水平检测其在体抑瘤作用。
2. 诱导肿瘤细胞发生凋亡的药物筛选方法
1) 诱导肿瘤细胞凋亡
肿瘤细胞在5% CO2孵箱培养至对数生长期，镜下计数为1×106/ml，加入24孔板，每孔1 ml 细胞悬液。用无血清细胞悬液将待测药物配制成1 mg/ml溶液；每组药物分别设4个浓度：12.5、25、50、100 μg/ml；分别加入24孔培养板，作3个复孔。置于5％ CO2孵箱培养。
2)Annexin V/PI流式双参数分析
分别于加入药物作用2、4和8小时，吸取培养细胞悬液，用4℃预冷的PBS 洗细胞2次，用250 μl 结合缓冲液重悬细胞，使其浓度为1×106/ml；取100 μl 细胞悬液，加5 μlAnnexin V/FITC和10 μl 的碘化丙锭；混匀后室温避光孵育15分钟；用PBS 洗涤2次，进行流式细胞仪(FACS)分析。Annexin V-FITC/PI双参数进行调试，以此条件进行细胞凋亡和细胞坏死率检测。横坐标表示荧光强度，纵坐标表示细胞数，两个峰中的左边峰表示阴性峰，右峰表示凋亡峰，右峰曲线下面积越大凋亡就越多。根据所测数据计算细胞凋亡率和继发性坏死率。
3) 统计学分析
各组细胞凋亡率均取3个样本的均值，以X ±SD 表示，多个均数的两两比较采用《中国医学百科全书•医学统计学》统计软件包 PEMS 3.1软件进行检验。