水环境微生物样品取样方法
海水宏基因组样品的采集方法：
参照文献：Jorge Frias-Lopez, Yanmei Shi, et al.(2008). Microbial community gene expression in ocean surface waters.PNAS, 105(10): 3805-3810.
1) 用125mm孔径的GF/A滤器将海水预过滤 (Whatman, Maidstone, U.K.)，然后采用孔径为0.22um的Steripak-GP20滤器（Millipore, Bedford, MA）、Masterflex peristaltic 泵(Cole Parmer Instrument Company, Vernon Hills, IL）抽滤
2) 待260L水样抽滤完毕，用裂解液(50 mM Tris•HCl, 40 mM EDTA, 0.75 M 蔗糖)覆盖Steripak-GP20滤器，并置于-80℃冻存待用
海水样品DNA提取方法：
M.T. Suzuki1, C.M. Preston, et al.(2004). Phylogenetic Screening of Ribosomal RNA Gene-Containing Clones in Bacterial Artificial
Chromosome (BAC) Libraries from Different Depths in Monterey Bay. Microbial Ecology; 48: 473-488.
1) 于Monterey海湾的M1 (36o45.50N 122o02.10W)位点的100m深度处收集1400L海水，用GFA滤器(Millipore, Billerica, MA)过滤，然后采用切向流（Tangential flow filtration）DC-10L系统，使用中空纤维滤芯（30,000-Da cutoff, H10P30-20, Millipore)）离心浓缩至330mL的终体积
2) 加入8L回洗液洗涤中空纤维滤芯，并浓缩到500mL
3) 将浓缩液再次用Pellicon XL50系统，采用30-kDa NMWL滤芯 (Pellicon 2 Maxi Filter, Millipore) 离心浓缩到15mL的终体积；接着再离心（12,000×g, Brinkmann 5415D, Westbury, NY），沉淀-80℃留存待用
4) 沉淀用含有浓度为0.5 mg mL–1的蛋白酶K（Fisher, Fairlawn, NJ)）和1%的
SDS(Sigma, St Louis, MO) 的蔗糖裂解液(40 mM EDTA, 50 mM Tris HCl, pH 8.0, 0.75 M sucrose)重悬，于55℃温浴20min
5) 将细胞裂解液于70℃温浴5min，然后用酚氯仿异戊醇（酚：氯仿：异戊醇=24:24:1，Sigma）抽提2次，氯仿异戊醇（氯仿：异戊醇=24:1，Sigma）抽提1次
6) 收集水相，用Centricon 100 (Millipore)超滤（见商品操作指南）
7) 通过CsCl浮力平衡离心（Buoyant equilibrium centrifugation，详见：Suzuki, MT, Taylor, LT, DeLong, EF. (2000). Quantitative analysis of small-subunit rRNA genes in mixed microbial populations via 5，-nuclease assays. Appl Environ Microbiol 66(11): 4605–4614），获得纯化的DNA
水环境微生物样品取样方法
海水宏基因组样品的采集方法：
参照文献：Jorge Frias-Lopez, Yanmei Shi, et al.(2008). Microbial community gene expression in ocean surface waters.PNAS, 105(10): 3805-3810.
1) 用125mm孔径的GF/A滤器将海水预过滤 (Whatman, Maidstone, U.K.)，然后采用孔径为0.22um的Steripak-GP20滤器（Millipore, Bedford, MA）、Masterflex peristaltic 泵(Cole Parmer Instrument Company, Vernon Hills, IL）抽滤
2) 待260L水样抽滤完毕，用裂解液(50 mM Tris•HCl, 40 mM EDTA, 0.75 M 蔗糖)覆盖Steripak-GP20滤器，并置于-80℃冻存待用
海水样品DNA提取方法：
M.T. Suzuki1, C.M. Preston, et al.(2004). Phylogenetic Screening of Ribosomal RNA Gene-Containing Clones in Bacterial Artificial
Chromosome (BAC) Libraries from Different Depths in Monterey Bay. Microbial Ecology; 48: 473-488.
1) 于Monterey海湾的M1 (36o45.50N 122o02.10W)位点的100m深度处收集1400L海水，用GFA滤器(Millipore, Billerica, MA)过滤，然后采用切向流（Tangential flow filtration）DC-10L系统，使用中空纤维滤芯（30,000-Da cutoff, H10P30-20, Millipore)）离心浓缩至330mL的终体积
2) 加入8L回洗液洗涤中空纤维滤芯，并浓缩到500mL
3) 将浓缩液再次用Pellicon XL50系统，采用30-kDa NMWL滤芯 (Pellicon 2 Maxi Filter, Millipore) 离心浓缩到15mL的终体积；接着再离心（12,000×g, Brinkmann 5415D, Westbury, NY），沉淀-80℃留存待用
4) 沉淀用含有浓度为0.5 mg mL–1的蛋白酶K（Fisher, Fairlawn, NJ)）和1%的
SDS(Sigma, St Louis, MO) 的蔗糖裂解液(40 mM EDTA, 50 mM Tris HCl, pH 8.0, 0.75 M sucrose)重悬，于55℃温浴20min
5) 将细胞裂解液于70℃温浴5min，然后用酚氯仿异戊醇（酚：氯仿：异戊醇=24:24:1，Sigma）抽提2次，氯仿异戊醇（氯仿：异戊醇=24:1，Sigma）抽提1次
6) 收集水相，用Centricon 100 (Millipore)超滤（见商品操作指南）
7) 通过CsCl浮力平衡离心（Buoyant equilibrium centrifugation，详见：Suzuki, MT, Taylor, LT, DeLong, EF. (2000). Quantitative analysis of small-subunit rRNA genes in mixed microbial populations via 5，-nuclease assays. Appl Environ Microbiol 66(11): 4605–4614），获得纯化的DNA