实验 二 食品添加剂苯甲酸、山梨酸同时测定
一、目的要求
1. 理解反相色谱的原理和应用。
2. 掌握标准曲线定量法。
3. 学习HPLC 法测定多种食品添加剂方法。
4. 学习ageilent1100HPLC 分析仪器的操作使用。
二、原理
糖精钠是易溶于水的盐类，样品中的苯甲酸、山梨酸经氢氧化钠溶液(O.50 mol ·L ) 浸泡后，转化为易溶于水的苯甲酸钠、山梨酸钠，经沉淀蛋白质、过滤等处理后，四种被测组分滞留于水相中与杂质分离。若样品含有二氧化碳和乙醇，则应加温除去。调pH 至近中性，过滤后进高效液相色谱仪，经反相色谱分离后，以紫外检测器进行检测，以标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度做工作曲线，再根据样品中的对应物峰面积，由工作曲线算出其浓度。
三、试剂与样品
方法中所用试剂，除另有规定外，均为分析纯试剂，水为蒸馏水或同等纯度水，溶液为水溶液。 1 甲醇：经滤膜(0.5μm)过滤。
2 稀氨水(1＋1) ：氨水加水等体积混合。
3 乙酸铵溶液(0.02mol/L)：称取1.54g 乙酸铵，加水至1000mL ，溶解，经滤膜(0.45μm)过滤。 4 碳酸氢钠溶液(20g/L)：称取2g 碳酸氢钠(优级纯) ，加水至100mL ，振摇溶解。
5 苯甲酸标准储备溶液：准确称取0.1000g 苯甲酸，加碳酸氢钠溶液(20g/L)5mL，加热溶解，移入100mL 容量瓶中，加水定容至100mL ，苯甲酸含量为1mg/mL，作为储备溶液。
6 山梨酸标准储备溶液：准确称取0.1000g 山梨酸，加碳酸氢钠溶液(20g/L)5mL，加热溶解，移入100mL 容量瓶中，加水定容至100mL ，山梨酸含量为1mg/mL，作为储备溶液。
7 苯甲酸、山梨酸标准混合使用溶液：取苯甲酸、山梨酸标准储备溶液各1.0mL ，放入10mL 容量瓶中，加水至刻度。此溶液含苯甲酸、山梨酸、糖精钠各0.1mg/mL。经滤膜(0.45μm)过滤。
9 乙酸铵溶液(0.02mol/L)：称取1.54g 乙酸铵，加水至1000mL ，溶解，经滤膜(0.45μm) 过滤。 10 样品：雪碧。
四、仪器
高效液相色谱仪：Agilent 1100型美国安捷伦公司(四元泵、在线脱气机、手动进样器、柱温箱、DAD 检测器)
五、分析步骤
1 样品处理：（在C209完成）：用移液管移取10.0mL 已经除去二氧化碳雪碧样品，用氨水(1＋1) 调pH 约7（约加1.5滴，用pH 试纸确定）。加水定容至50mL ，
然后到C203，用滤膜(0.45μm)过滤，用HPLC 测定样品及工作曲线。
2 高效液相色谱参考条件
2.1 色谱柱：色谱柱（Hypersil ODS C18）4. 0×250 mm 5μm美国安捷伦公司不锈钢柱。
2.2 流动相：甲醇：乙酸铵溶液(0.02m0l/L)(26 ：74) 。
2.3 流速：1.2mL/min。
2.4 进样量：20μL。
2.5
2.6
2.7 检测器（DAD ）波长：苯甲酸220 nm、山梨酸254 nm。 根据保留时间定性，外标峰面积法定量（当场记录）。 计算：X 2 （g/kg） = （m 3× V 3）÷（m 4× V 4）
M 3——进样体积中苯甲酸或山梨酸的质量，mg ； 式中：X 2——样品中苯甲酸或山梨酸的含量，g/kg；
V 4——进样体积，mL ；
V 3——样品稀释液总体积，mL ；
m 4——样品质量，g 。
结果的表述：报告算术平均值的二位有效数。
七、思考题
1. 用标准曲线法定量的优缺点是什么？
2. 用HPLC 同时测定多种组分，各组分相互之间有无干扰? 为什么？
3.. 在样品过滤时，为什么要弃去前过滤液？这样做会不会影响实验结果？为什么？
八、附件：ageilent 1100 HPLC分析仪器操作程序
(一) 、开机：
1、打开计算机, 进入Windows NT （或Windows 2000）画面, 并运行Bootp Server程序。
2、打开 1100 LC 各模块电源。
3、待各模块自检完成后，双击Instrument 1 Online图标，化学工作站自动与1100LC 通讯，进入的工作站画面如下所示。
4、从“View”菜单中选择“Method and Run control”画面, 单击”View”菜单中的“Show Top Toolbar”，“Show status(状况) toolbar”，“System diagram(图表) ”,”Sampling diagram”，使其命令前有“√”标志，来调用所需的界面。
5、把流动相放入溶剂瓶中。
6、打开Purge 阀。
7、单击Pump 图标，出现参数设定菜单，单击Setup pump选项，进入泵编辑画面。
8 、设Flow ：5ml/min，单击OK 。
9、单击Pump 图标，出现参数设定菜单，单击Pump control选项，选中On ，单击OK ，则系统开始Purge ，直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止, 切换通道继续Purge ，直到所有要用通道无气泡为止。
10、单击Pump 图标，出现参数设定菜单，单击Pump Control选项，选中Off ，单击Ok 关泵， 关闭 Purge valve 。
11、单击Pump 图标，出现参数设定菜单，单击Setup pump选项，进入Pump 编辑画面，设Flow ：1.0ml/min。
12、单击泵下面的瓶图标，如图所示（以二元泵为例），输入溶剂的实际体积和瓶体积。也可输入停泵的体积。单击Ok 。
(二) 数据采集方法编辑：
7、DAD 检测器参数设定: 检测波长: 254nm,BW=30nm, 参比波长=350nm,BW=100nm;
检测波长：一般选择最大吸收处的波长。样品带宽BW ： 一般选择最大吸收值一半处的整个宽度。参比波长：一般选择在靠近样品信号的无吸收或低吸收区域。参比带宽BW ：至少要与样品信号的带宽相等，许多情况下用100nm 作为缺省值。Peak width（Response time）：其值尽可能接近要测的窄峰峰宽。Slit —狭缝窄，光谱分辨率高；宽时，噪音低。同时可以输入采集光谱方式，步长，范围，阈值。选中所用的灯。 点击Ok 进入下一画面。
10、 在“ Run time checklist(清单) ”中选中“Data acquisition(获得) ”，单击Ok
11、 单击“Method”菜单，选中“Save method as”，输入一方法名，如“test”，单击Ok 。
12、 从菜单 “View”中选中”Online signal” ,选中Windows 1,然后单击Change 钮, 将所要绘图的信号移到右边的框中, 点击Ok.(如同时检测二个信号, 则重复12, 选中 Windows 2)。
13、 从“Run control ”菜单中选择“Sample info”选项，如上图所示，输入操作者名称，在“Data file ”中选择“Manual”或“Prefix(前缀) ”。
区别: Manual--每次做样之前必须给出新名字, 否则仪器会将上次的数据覆盖掉。 Prefix —在Prefix 框中输入前缀，在Counter 框中输入计数器的起始位，仪器会自动命名，如vwd0001，vwd0002……。
14、 从Instrument 菜单选择System on。
15、 等仪器Ready ，基线平稳，从Method 菜单中选择“Run method”，进样。
（三）、数据分析方法编辑: 1、 从“View”菜单中，单击“Data analysis”进入数据分析画面。
2、 从“File”菜单选择“Load signal”，选中您的数据文件名，如下图所示。单击Ok 。
3、做谱图优化, 从“Graphics(图形) ”菜单中选择“Signal options”选项，。从Ranges 中选择Auto scale及合适的显示时间，单击ok, 或选择”Use Ranges” 调整。反复进行，直到图的比例合适为止。
4、积分: (1)、从“Integration(积分) ”中选择 “Auto integrate”,如积分结果不理想, 再从菜单中选择“Integration Events”选项，选择合适的Slope sensitivity，Peak width，Area reject，Height reject。
(2)、从“Integration”菜单中选择“Integrate”选项， 则数据被积分。
(3)、如积分结果不理想，则修改相应的积分参数，直到满意为止。
(4)、单击左边“√”图标，将积分参数存入方法。
5、打印报告: (1)、从“Report”菜单中选择“Specify(指定) report”选项，进入如上画面。
(2)、单击“Quantitative(定量的) Results”框中Calculate(计算) 右侧的黑三角，选中Percent （面积百分比），其它选项不变。
(3)、单击Ok.
(4)、从“Report”菜单中选择“Print report”，则报告结果将打印到屏幕上，如想输出到打印机上，则单击Report 底部的“Print”钮。
(四) 、关机：关机前，用 100%的水冲洗系统20分钟，然后用有机溶剂冲洗系统10分钟（如ACN ），然后关泵，（适于反相色谱柱）。[正相色谱柱用适当的溶剂冲洗] ，退出化学工作站，及其它窗口，关闭计算机（用shut down关）。 关掉Agilent 1100电源开关。
(五) 、Agilent 1100 LC维护保养：
1、色谱柱长时间不用，存放时，柱内应充满溶剂，两端封死（如ACN 适于反相色谱柱，正相色谱柱用相应的有机相）
2、对于手动进样器，当使用缓冲溶液时，要用水冲洗进样口，同时搬动进样阀数次，每次数毫升。
3、流动相使用前必须过滤，不要使用多日存放的蒸馏水（易长菌）。
4、带seal-wash 的 1100，要配制90%水+10%异丙醇，以每分2—3滴的速度虹吸排出，溶剂不能干涸。
实验 二 食品添加剂苯甲酸、山梨酸同时测定
一、目的要求
1. 理解反相色谱的原理和应用。
2. 掌握标准曲线定量法。
3. 学习HPLC 法测定多种食品添加剂方法。
4. 学习ageilent1100HPLC 分析仪器的操作使用。
二、原理
糖精钠是易溶于水的盐类，样品中的苯甲酸、山梨酸经氢氧化钠溶液(O.50 mol ·L ) 浸泡后，转化为易溶于水的苯甲酸钠、山梨酸钠，经沉淀蛋白质、过滤等处理后，四种被测组分滞留于水相中与杂质分离。若样品含有二氧化碳和乙醇，则应加温除去。调pH 至近中性，过滤后进高效液相色谱仪，经反相色谱分离后，以紫外检测器进行检测，以标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度做工作曲线，再根据样品中的对应物峰面积，由工作曲线算出其浓度。
三、试剂与样品
方法中所用试剂，除另有规定外，均为分析纯试剂，水为蒸馏水或同等纯度水，溶液为水溶液。 1 甲醇：经滤膜(0.5μm)过滤。
2 稀氨水(1＋1) ：氨水加水等体积混合。
3 乙酸铵溶液(0.02mol/L)：称取1.54g 乙酸铵，加水至1000mL ，溶解，经滤膜(0.45μm)过滤。 4 碳酸氢钠溶液(20g/L)：称取2g 碳酸氢钠(优级纯) ，加水至100mL ，振摇溶解。
5 苯甲酸标准储备溶液：准确称取0.1000g 苯甲酸，加碳酸氢钠溶液(20g/L)5mL，加热溶解，移入100mL 容量瓶中，加水定容至100mL ，苯甲酸含量为1mg/mL，作为储备溶液。
6 山梨酸标准储备溶液：准确称取0.1000g 山梨酸，加碳酸氢钠溶液(20g/L)5mL，加热溶解，移入100mL 容量瓶中，加水定容至100mL ，山梨酸含量为1mg/mL，作为储备溶液。
7 苯甲酸、山梨酸标准混合使用溶液：取苯甲酸、山梨酸标准储备溶液各1.0mL ，放入10mL 容量瓶中，加水至刻度。此溶液含苯甲酸、山梨酸、糖精钠各0.1mg/mL。经滤膜(0.45μm)过滤。
9 乙酸铵溶液(0.02mol/L)：称取1.54g 乙酸铵，加水至1000mL ，溶解，经滤膜(0.45μm) 过滤。 10 样品：雪碧。
四、仪器
高效液相色谱仪：Agilent 1100型美国安捷伦公司(四元泵、在线脱气机、手动进样器、柱温箱、DAD 检测器)
五、分析步骤
1 样品处理：（在C209完成）：用移液管移取10.0mL 已经除去二氧化碳雪碧样品，用氨水(1＋1) 调pH 约7（约加1.5滴，用pH 试纸确定）。加水定容至50mL ，
然后到C203，用滤膜(0.45μm)过滤，用HPLC 测定样品及工作曲线。
2 高效液相色谱参考条件
2.1 色谱柱：色谱柱（Hypersil ODS C18）4. 0×250 mm 5μm美国安捷伦公司不锈钢柱。
2.2 流动相：甲醇：乙酸铵溶液(0.02m0l/L)(26 ：74) 。
2.3 流速：1.2mL/min。
2.4 进样量：20μL。
2.5
2.6
2.7 检测器（DAD ）波长：苯甲酸220 nm、山梨酸254 nm。 根据保留时间定性，外标峰面积法定量（当场记录）。 计算：X 2 （g/kg） = （m 3× V 3）÷（m 4× V 4）
M 3——进样体积中苯甲酸或山梨酸的质量，mg ； 式中：X 2——样品中苯甲酸或山梨酸的含量，g/kg；
V 4——进样体积，mL ；
V 3——样品稀释液总体积，mL ；
m 4——样品质量，g 。
结果的表述：报告算术平均值的二位有效数。
七、思考题
1. 用标准曲线法定量的优缺点是什么？
2. 用HPLC 同时测定多种组分，各组分相互之间有无干扰? 为什么？
3.. 在样品过滤时，为什么要弃去前过滤液？这样做会不会影响实验结果？为什么？
八、附件：ageilent 1100 HPLC分析仪器操作程序
(一) 、开机：
1、打开计算机, 进入Windows NT （或Windows 2000）画面, 并运行Bootp Server程序。
2、打开 1100 LC 各模块电源。
3、待各模块自检完成后，双击Instrument 1 Online图标，化学工作站自动与1100LC 通讯，进入的工作站画面如下所示。
4、从“View”菜单中选择“Method and Run control”画面, 单击”View”菜单中的“Show Top Toolbar”，“Show status(状况) toolbar”，“System diagram(图表) ”,”Sampling diagram”，使其命令前有“√”标志，来调用所需的界面。
5、把流动相放入溶剂瓶中。
6、打开Purge 阀。
7、单击Pump 图标，出现参数设定菜单，单击Setup pump选项，进入泵编辑画面。
8 、设Flow ：5ml/min，单击OK 。
9、单击Pump 图标，出现参数设定菜单，单击Pump control选项，选中On ，单击OK ，则系统开始Purge ，直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止, 切换通道继续Purge ，直到所有要用通道无气泡为止。
10、单击Pump 图标，出现参数设定菜单，单击Pump Control选项，选中Off ，单击Ok 关泵， 关闭 Purge valve 。
11、单击Pump 图标，出现参数设定菜单，单击Setup pump选项，进入Pump 编辑画面，设Flow ：1.0ml/min。
12、单击泵下面的瓶图标，如图所示（以二元泵为例），输入溶剂的实际体积和瓶体积。也可输入停泵的体积。单击Ok 。
(二) 数据采集方法编辑：
7、DAD 检测器参数设定: 检测波长: 254nm,BW=30nm, 参比波长=350nm,BW=100nm;
检测波长：一般选择最大吸收处的波长。样品带宽BW ： 一般选择最大吸收值一半处的整个宽度。参比波长：一般选择在靠近样品信号的无吸收或低吸收区域。参比带宽BW ：至少要与样品信号的带宽相等，许多情况下用100nm 作为缺省值。Peak width（Response time）：其值尽可能接近要测的窄峰峰宽。Slit —狭缝窄，光谱分辨率高；宽时，噪音低。同时可以输入采集光谱方式，步长，范围，阈值。选中所用的灯。 点击Ok 进入下一画面。
10、 在“ Run time checklist(清单) ”中选中“Data acquisition(获得) ”，单击Ok
11、 单击“Method”菜单，选中“Save method as”，输入一方法名，如“test”，单击Ok 。
12、 从菜单 “View”中选中”Online signal” ,选中Windows 1,然后单击Change 钮, 将所要绘图的信号移到右边的框中, 点击Ok.(如同时检测二个信号, 则重复12, 选中 Windows 2)。
13、 从“Run control ”菜单中选择“Sample info”选项，如上图所示，输入操作者名称，在“Data file ”中选择“Manual”或“Prefix(前缀) ”。
区别: Manual--每次做样之前必须给出新名字, 否则仪器会将上次的数据覆盖掉。 Prefix —在Prefix 框中输入前缀，在Counter 框中输入计数器的起始位，仪器会自动命名，如vwd0001，vwd0002……。
14、 从Instrument 菜单选择System on。
15、 等仪器Ready ，基线平稳，从Method 菜单中选择“Run method”，进样。
（三）、数据分析方法编辑: 1、 从“View”菜单中，单击“Data analysis”进入数据分析画面。
2、 从“File”菜单选择“Load signal”，选中您的数据文件名，如下图所示。单击Ok 。
3、做谱图优化, 从“Graphics(图形) ”菜单中选择“Signal options”选项，。从Ranges 中选择Auto scale及合适的显示时间，单击ok, 或选择”Use Ranges” 调整。反复进行，直到图的比例合适为止。
4、积分: (1)、从“Integration(积分) ”中选择 “Auto integrate”,如积分结果不理想, 再从菜单中选择“Integration Events”选项，选择合适的Slope sensitivity，Peak width，Area reject，Height reject。
(2)、从“Integration”菜单中选择“Integrate”选项， 则数据被积分。
(3)、如积分结果不理想，则修改相应的积分参数，直到满意为止。
(4)、单击左边“√”图标，将积分参数存入方法。
5、打印报告: (1)、从“Report”菜单中选择“Specify(指定) report”选项，进入如上画面。
(2)、单击“Quantitative(定量的) Results”框中Calculate(计算) 右侧的黑三角，选中Percent （面积百分比），其它选项不变。
(3)、单击Ok.
(4)、从“Report”菜单中选择“Print report”，则报告结果将打印到屏幕上，如想输出到打印机上，则单击Report 底部的“Print”钮。
(四) 、关机：关机前，用 100%的水冲洗系统20分钟，然后用有机溶剂冲洗系统10分钟（如ACN ），然后关泵，（适于反相色谱柱）。[正相色谱柱用适当的溶剂冲洗] ，退出化学工作站，及其它窗口，关闭计算机（用shut down关）。 关掉Agilent 1100电源开关。
(五) 、Agilent 1100 LC维护保养：
1、色谱柱长时间不用，存放时，柱内应充满溶剂，两端封死（如ACN 适于反相色谱柱，正相色谱柱用相应的有机相）
2、对于手动进样器，当使用缓冲溶液时，要用水冲洗进样口，同时搬动进样阀数次，每次数毫升。
3、流动相使用前必须过滤，不要使用多日存放的蒸馏水（易长菌）。
4、带seal-wash 的 1100，要配制90%水+10%异丙醇，以每分2—3滴的速度虹吸排出，溶剂不能干涸。