动物双歧杆菌，分离自trubiotics，分离利用BS固体培养基，液体发酵利用TPY液体培养基
BS培养基100ml
蛋白胨 1g TPY液体培养基 100ml
肝浸粉 0.5g 胰蛋白胨 1g
牛肉膏 0.3g 酵母粉 0.25
酵母粉 0.5g 大豆蛋白冻 0.5g
胰酪蛋白胨 0.8g 吐温80 100ul
可溶性淀粉 0.05 葡萄糖 0.5g
氯化钠 0.1 磷酸氢二钾 0.2g
磷酸氢二钾 0.1 氯化镁 0.05g
磷酸二氢钾 0.1 硫酸锌 0.025g
葡萄糖 1g 氯化钙 0.015
FeSO4.7H2O 0.01 氯化铁 微量
MnSO4 0.005 盐酸半胱氨酸 0.05g
L-半胱氨酸 0.05 PH 6.5
琼脂 2g
PH 7.0
分离方法：
1、取trubiotics一粒加入9ml灭菌水中，稀释成10-1，按此方法依次稀释到10-7，
从10-7中取100ul稀释液于MRS培养基上涂布均匀。37℃厌氧培养48h。 2、48h后从平板上挑取单菌落划线分离纯化，37℃厌氧培养，获得纯的单菌落。 鉴定方法
鉴定方法：
1、显微观察：载玻片中央滴一滴水，用接种环挑取单菌落于载玻片水中，镜检观察，显微镜（400×）下菌体短杆状，有的弯曲，或呈v型
2、 革兰氏染色：
a) 取菌涂片，涂片要薄而均匀，否则菌体群集往往呈现假阳性。
b) 滴结晶紫液于固定的涂片上，染色约1min,用水冲洗。
c) 用媒染剂碘液冲去残水，并覆盖1min,水洗，吸干。
d) 倾斜载玻片，尽量减少玻片上残留的水分，流滴95%乙醇脱色20～30s，
至无紫色，并立刻用水缓缓冲洗饿，脱色时间不可过长，以免呈现假阴性。
e) 用番红液复染1～2mi，使已脱色的细胞重新着色，便于鉴定观察。水洗，
待干，镜检。
f) 镜检（400×）观察单独分散的菌体，菌体呈蓝紫色，为革兰氏阳性细菌。
3、液体发酵，提取DNA。
1）配置TPY液体培养基，分装于试管中，每管大约10ml，用接种环挑取单菌落，接种于液体培养基中，37℃过夜培养。
发酵之后取发酵液300ul加入300ul50%的甘油，保存三管。
2）按照试剂盒操作步骤提取菌体的基因组DNA。
4、利用细菌的16s rDNA的保守区引物（引物:27F 5' AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 3'；1492R 5' TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T 3'）利用聚合酶链式反应进行PCR，获得所筛菌的16s rDNA。
Taq 酶（5u/ul） 0.125ul
10×PCR buffer (含镁离子) 2.5ul
Primer1（10uM） 1ul
Primer2 （10uM） 1ul
dNTP （2.5mM） 2ul
模板 2ul
ddH2O 16.5ul
25ul体系
Pcr 扩增程序为：
PCR程序：94℃ 4min
94℃ 30s
60℃ 40s 30个循环
72℃ 1.5min
72℃ 10min
PCR结束后进行电泳检测:将PCR反应各产物5ul上样于1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。与NCBI核酸数据库进行blast,为所筛得到菌进行归类。
D：动物双歧杆菌
5、经电泳检测合格后，并送交华大基因测序，测序结果经拼接，得到16srDNA序列:
GGCCCGGGAACGCATTCACCGCGGCGTTGCTGATCCGCGATTACTAGCGACTCCGCCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGACCGGTTTTCAGCGATCCGCCCCACGTCACCGTGTCGCACCGCGTTGTACCGGCCATTGTAGCATGCGTGAAGCCCTGGACGTAAGGGGCATGATGATCTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCGGTCCCACATGAGTTCCCGGCATCACCCGCTGGCAACATGCGGCGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACGACCATGCACCACCTGTGAACCGGCCCCGAAGGGAAACCGTGTCTCCACGGCGATCCGGCACATGTCAAGCCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCGCATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTTCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGATGCTTAACGCGTTGGCTCCGACACGGGACCCGTGGAAAGGGCCCCACATCCAGCATCCACCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTGACGGCCCAGAGACCTGCCTTCGCCATTGGTGTTCTTCCCGATATCTACACATTCCACCGTTACACCGGGAATTCCAGTCTCCCCTACCGCACTCCAGCCCGCCCGTACCCGGCGCAGATCCACCGTTAGGCGATGGACTTTCACACCGGACGCGACGAACCGCCTACGAGCCCTTTACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTCGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTATTCGAACAATCCACTCAACACGGCCGAAACCGTGCCTTGCCCTTGAACAAAAGCGGTTTACAACCCGAAGGCCTCCATCCCGCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTATCTCAGTCCCAATGTGGCCGGTCACCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCAACGCCTTGGTGGGCCATCACCCCGCCAACAAGCTGATAGGACGCGACCCCATCCCATGCCGCAAAAGCATTTCCCACCCCACCATGCGATGGAGCGGAGCATCCGGTATTACCACCCGTTTCCAGGAGCTATTCCGGTGCACAGGGCAGGTTGGTCACGCAT
与NCBI核酸数据库进行blast,经比对结果为动物双歧乳亚种。
菌种保存：将提取DNA之前保存的菌种贴好标签，于-80℃冰箱保存。
动物双歧杆菌，分离自trubiotics，分离利用BS固体培养基，液体发酵利用TPY液体培养基
BS培养基100ml
蛋白胨 1g TPY液体培养基 100ml
肝浸粉 0.5g 胰蛋白胨 1g
牛肉膏 0.3g 酵母粉 0.25
酵母粉 0.5g 大豆蛋白冻 0.5g
胰酪蛋白胨 0.8g 吐温80 100ul
可溶性淀粉 0.05 葡萄糖 0.5g
氯化钠 0.1 磷酸氢二钾 0.2g
磷酸氢二钾 0.1 氯化镁 0.05g
磷酸二氢钾 0.1 硫酸锌 0.025g
葡萄糖 1g 氯化钙 0.015
FeSO4.7H2O 0.01 氯化铁 微量
MnSO4 0.005 盐酸半胱氨酸 0.05g
L-半胱氨酸 0.05 PH 6.5
琼脂 2g
PH 7.0
分离方法：
1、取trubiotics一粒加入9ml灭菌水中，稀释成10-1，按此方法依次稀释到10-7，
从10-7中取100ul稀释液于MRS培养基上涂布均匀。37℃厌氧培养48h。 2、48h后从平板上挑取单菌落划线分离纯化，37℃厌氧培养，获得纯的单菌落。 鉴定方法
鉴定方法：
1、显微观察：载玻片中央滴一滴水，用接种环挑取单菌落于载玻片水中，镜检观察，显微镜（400×）下菌体短杆状，有的弯曲，或呈v型
2、 革兰氏染色：
a) 取菌涂片，涂片要薄而均匀，否则菌体群集往往呈现假阳性。
b) 滴结晶紫液于固定的涂片上，染色约1min,用水冲洗。
c) 用媒染剂碘液冲去残水，并覆盖1min,水洗，吸干。
d) 倾斜载玻片，尽量减少玻片上残留的水分，流滴95%乙醇脱色20～30s，
至无紫色，并立刻用水缓缓冲洗饿，脱色时间不可过长，以免呈现假阴性。
e) 用番红液复染1～2mi，使已脱色的细胞重新着色，便于鉴定观察。水洗，
待干，镜检。
f) 镜检（400×）观察单独分散的菌体，菌体呈蓝紫色，为革兰氏阳性细菌。
3、液体发酵，提取DNA。
1）配置TPY液体培养基，分装于试管中，每管大约10ml，用接种环挑取单菌落，接种于液体培养基中，37℃过夜培养。
发酵之后取发酵液300ul加入300ul50%的甘油，保存三管。
2）按照试剂盒操作步骤提取菌体的基因组DNA。
4、利用细菌的16s rDNA的保守区引物（引物:27F 5' AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 3'；1492R 5' TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T 3'）利用聚合酶链式反应进行PCR，获得所筛菌的16s rDNA。
Taq 酶（5u/ul） 0.125ul
10×PCR buffer (含镁离子) 2.5ul
Primer1（10uM） 1ul
Primer2 （10uM） 1ul
dNTP （2.5mM） 2ul
模板 2ul
ddH2O 16.5ul
25ul体系
Pcr 扩增程序为：
PCR程序：94℃ 4min
94℃ 30s
60℃ 40s 30个循环
72℃ 1.5min
72℃ 10min
PCR结束后进行电泳检测:将PCR反应各产物5ul上样于1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。与NCBI核酸数据库进行blast,为所筛得到菌进行归类。
D：动物双歧杆菌
5、经电泳检测合格后，并送交华大基因测序，测序结果经拼接，得到16srDNA序列:
GGCCCGGGAACGCATTCACCGCGGCGTTGCTGATCCGCGATTACTAGCGACTCCGCCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGACCGGTTTTCAGCGATCCGCCCCACGTCACCGTGTCGCACCGCGTTGTACCGGCCATTGTAGCATGCGTGAAGCCCTGGACGTAAGGGGCATGATGATCTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCGGTCCCACATGAGTTCCCGGCATCACCCGCTGGCAACATGCGGCGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACGACCATGCACCACCTGTGAACCGGCCCCGAAGGGAAACCGTGTCTCCACGGCGATCCGGCACATGTCAAGCCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCGCATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTTCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGATGCTTAACGCGTTGGCTCCGACACGGGACCCGTGGAAAGGGCCCCACATCCAGCATCCACCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTGACGGCCCAGAGACCTGCCTTCGCCATTGGTGTTCTTCCCGATATCTACACATTCCACCGTTACACCGGGAATTCCAGTCTCCCCTACCGCACTCCAGCCCGCCCGTACCCGGCGCAGATCCACCGTTAGGCGATGGACTTTCACACCGGACGCGACGAACCGCCTACGAGCCCTTTACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTCGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTATTCGAACAATCCACTCAACACGGCCGAAACCGTGCCTTGCCCTTGAACAAAAGCGGTTTACAACCCGAAGGCCTCCATCCCGCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTATCTCAGTCCCAATGTGGCCGGTCACCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCAACGCCTTGGTGGGCCATCACCCCGCCAACAAGCTGATAGGACGCGACCCCATCCCATGCCGCAAAAGCATTTCCCACCCCACCATGCGATGGAGCGGAGCATCCGGTATTACCACCCGTTTCCAGGAGCTATTCCGGTGCACAGGGCAGGTTGGTCACGCAT
与NCBI核酸数据库进行blast,经比对结果为动物双歧乳亚种。
菌种保存：将提取DNA之前保存的菌种贴好标签，于-80℃冰箱保存。