大豆蛋白的功能性测定

大豆蛋白的功能性测定

专业：生物工程 班级：08一班 学号：060508131 姓名：戴璐 成绩：

摘要：利用考马斯亮蓝G250测定样品中蛋白含量为百分之十左右远不及样品包装上所说的82%的含量；紫外分光光度计测定大豆蛋白紫外吸收特征，其紫外光谱显示含较多无法除尽的杂质，荧光光度计观察其荧光效应，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其相对分子质量 关键词：大豆蛋白 蛋白含量测定 紫外吸收 电泳 功能性

1. 概述 蛋白质是组成人体的重要物质。是人体生命活动的物质基础，是食品的第一大营养素。大豆是重要的粮油兼用作物，它富含蛋白质、脂肪，是一种营养平衡的食物。其籽粒含蛋白质一般为40%左右，比一般谷物高2-4被，也比牛奶、鸡蛋和瘦猪肉的蛋白质含量高。 大豆是豆科植物中最有营养而又易于消化的食物，是蛋白质最丰富最廉价的来源 。另外，大豆蛋白不含淀粉，氨基酸也组成比较平衡。所以，目前许多蛋白质营养品都是用的大豆蛋白。

2. 材料与方法

1. 考马斯亮蓝G250测定蛋白含量

【材料】 标准蛋白液，样品蛋白，722型分光光度计

【方法】

1>.标准曲线的制作

取7支干净试管，按表一进行编号并加入试管

混匀，室温静置3分钟，以第1管委空白，于波长595nm 处比色，读取吸光度，以吸光度为纵坐标，各标准浓度作为横坐标作图的标准曲线

2>.样液的测定

另一支干净试管，加入样液1.0ml 及考马斯亮蓝染液4.0ml ，混匀，室温静置3min ，于波长595nm 处比色，读取吸光度，由样液的吸光度查标准曲线即可求出蛋白含量

2. 大豆蛋白质的紫外吸收特征

【材料】 标准蛋白液，样品蛋白，UV-9100型紫外分光光度计

【方法】 将大豆蛋白溶于1mol/L PH值为8.0的Tris-HCl 溶液中，配制成2.0mg/mL的蛋白质溶液，以对应的Tris-HCl 作参比，做紫外-可见扫描，速度10nm/s，范围200-400nm 之间

3. 大豆蛋白质的疏水性及荧光光谱

【材料】 标准蛋白液，样品蛋白，日本岛津RF-5310PC 型荧光光度计，离心机，100mL 烧杯2个，玻璃棒1个

【方法】 将大豆蛋白溶于1mol/L PH值为8.0的Tris-HCl 溶液中，配制成0.5，1.0，2.0mg/mL的蛋白质溶液，3000r/min离心10min ，以以相对应的Tris-HCl 作参比，采用日本岛津RF-5310PC 型荧光光度计进行荧光测定，激发波长280nm, 发射波长300-800nm 之间

4.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

【材料】 直流稳压电泳仪，垂直平板电泳槽

⑴ 分离胶缓冲液 1.5mol/L Tris-HCl (pH8.8)

取18.15g Tris, 加80ml 重蒸水，用1mol/L的HCL 调pH 至8.8，用重蒸水稀释至最终体积为100ml ，4℃冰箱保存。

⑵ 浓缩胶缓冲液 0.5mol/L Tris-HCl (pH6.8)

取6g Tris, 用1mol/L的HCL 调pH 至6.8，用重蒸水稀释至最终体积为100ml ，4℃冰箱保存。

⑶ 10% (w/v) SDS ⑷ 凝胶储备液：29.2g 丙烯酰胺，0.8g 亚甲基双丙烯酰胺，加重蒸水至100ml 。外包锡纸，4℃冰箱保存，30天内使用。

⑸ 两类样品缓冲液

A 2倍还原缓冲液：0.5mol/L Tris-HCl (pH6.8)2.5ml,甘油2.0ml ，质量浓度10%SDS 4.0ml, 质量浓度0.1%溴酚蓝0.5ml ，β-巯基乙醇1.0ml

B 2倍非还原缓冲液：重蒸水1.0ml,0.5mol/L Tris-HCl (pH6.8)2.5ml,甘油2.0ml ，质量浓度10%SDS 4.0ml,质量浓度0.1%溴酚蓝0.5ml

⑹ 电泳缓冲液PH8.3

3g Tris，14.4g 甘氨酸，1g SDS，加重蒸水至1L,4℃冰箱保存 ⑺ 低相对分子质量标准蛋白（已配好） ⑻ 质量浓度10%过硫酸铵：此溶液需临用前配制 ⑼ 染色液：0.25g 考马斯亮蓝R-250，加入91ml 50%甲醇，9ml 冰醋酸即成。 ⑽ 脱色液：将50ml 甲醇，75ml 冰醋酸，875ml 重蒸水混匀。

⑾ 蛋白样品提取方法同前三个实验

【方法】

1>将垂直平板电泳槽装好，用水检漏

2>分离胶的灌制

根据待测蛋白质样品的相对分子质量选择合适的分离胶浓度，本实验选用大豆蛋白样品为待测相对分子质量的样品，用12%的分离胶

在15mL 试管中依次加入重蒸水3.35mL ，1.5mol/L Tris-HCL(PH8.8)缓冲液

2.5mL,10%SDS 0.1mL, 凝胶储备液4.0mL ，10%过硫酸铵50μl 和TEMED 5μl, 由于加入TEMED 后凝胶就开始聚合，所以应立即混匀混合液，然后用滴管吸取分离胶，在电泳槽的两玻璃板之间灌注，留出梳齿的齿高1cm 的空间以便灌注浓缩胶。用滴管小心地在溶液上覆盖一层重蒸水，将电泳槽垂直静置于室温下30-60min ，分离胶则聚合，待分离胶聚合完全后，除去覆盖的重蒸水，尽可能去干净

3>浓缩胶的配制和灌制

一般采用5%的浓缩胶，配制方法:重蒸水2.92mL ，0.5mol/L Tris-HCl (pH6.8)缓冲液

1.25mL,10%SDS 0.05mL,凝胶储备液0.8mL ，10%过硫酸铵25μl 和TEMED 5μl, 在试管中混匀，灌注在分离胶上。小心插入梳齿，避免混入气泡，将电泳槽垂直静置于室温下至浓缩胶完全聚合，约30min

4>样品的制备

⑴ 标准蛋白样品的制备

取出一管预先分装好的20μl 低相对分子质量标准蛋白，放入沸水浴中加热3-5min ，取出冷至室温

⑵ 待测蛋白样品的制备

a.10μl 蛋白质样品加10μl 2倍还原缓冲液

b.10μl 蛋白质样品加10μl 2倍非还原缓冲液

以上a,b 两管均为同标准蛋白样品一样，在沸水浴中加热3-5min ，取出冷至室温

5>电泳

⑴ 带浓缩胶完全聚合后，小心拔出梳齿，用电极缓冲液洗涤加样孔数次，然后将电泳槽注满电极缓冲液

⑵ 用微量注射器按号向凝胶梳孔内加样

⑶ 接上电泳仪，打开电泳仪，调节电流至20-30A 并保持恒定，待蓝色溴酚蓝条带迁移至距凝胶下端1cm 时，停止电泳

6>染色与脱色

小心将胶取出，置于一培养皿中，加染色液0.5h ，倾出染色液，加入脱色液，数小时更换一次，直至背景清晰

7>相对分子质量的计算

相对迁移率 = 样品迁移距离 / 染料迁移距离

根据待测样品相对迁移率，从标准曲线上查出相对分子质量

3. 结果与分析

1.考马斯亮蓝G250测定蛋白含量

【实验结果】

其标准曲线为图1

图1 考马斯亮蓝法测定蛋白浓度--标准曲线图

考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。考马斯亮蓝G250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm 。当它与蛋白质结合形成复合物时，呈蓝色，其最大吸收峰改变为595nm, 考马斯亮蓝G250-蛋白质复合物的高消光效用导致了蛋白质定量测定的高敏感度。

在一定范围内，考马斯亮蓝G250-蛋白质复合物呈色后，在595nm 下，吸光度与蛋白质含量呈线性，可用于蛋白质浓度的测定

测得样品的吸光度为0.126, 根据所得公式计算出被测蛋白质浓度为15.847µg/ml

【实验分析】

所配蛋白粉溶液浓度为50µg/ml，由于其蛋白质含量为82%，所以所得蛋白质溶液浓度为42µg/ml，于所测定的结果有较大区别，但所作多次结果基本相同，所以可能原因有 ⑴ 所用1mol/L PH值为8.0的Tris-HCl 溶液的PH 不是8.0，所以导致溶解度变小 ⑵ 培养时静置时间不够长，导致有部分蛋白质还未溶解

⑶ 应同时进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，可能有SDS 混入其中

⑷ 可能是样品真的存在问题

【注意事项】

⑴ 在使用分光光度计之前必须预热10min 以上

⑵ 样品蛋白质含量应在10-100µg 为宜。一些阳离子如K+、Na+、Mg+、乙醇等物质对测定无影响，而大量的去污剂如SDS 等会严重干扰

2. 大豆蛋白质的紫外吸收特征

【实验结果】 所测紫外吸收特征如图

2

图2 大豆蛋白质的紫外吸收特征图

蛋白质在紫外光吸收为：1. 肽键在

实验时测了200-600nm 的吸光度，测得在280nm 处有最大吸收峰，可在200～220nm 处的吸收峰过多，没特别明显的峰，无法判断肽键的峰，所以没能计算含量

【实验分析】

本实验在200-600nm 处有两个峰，但所测峰杂乱，且不是很光滑，说明样品液中存在较多杂质无法判断肽键的存在 ；在280nm 处则比较清晰明显，，也说明色氨酸残基和酪氨酸残基分子内部存在着共轭双键。可能存在以下原因：

⑴ 配制样品时没离心，而是用过滤，所以除杂效果不够好

⑵ 培养时静置时间过长，导致有部分杂质未溶解

⑶ 应同时进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，可能有SDS 混入其中

【注意事项】

样品需用1mol/L PH值为8.0的Tris-HCl 溶液溶解并静置1-2h

3. 大豆蛋白质的疏水性及荧光光谱

【实验结果】 大豆蛋白质的荧光光谱如图3

图3 大豆蛋白质的荧光光谱

对于稀溶液（A=εcl ≤0.05）而言，其荧光强度F=2.3JI0εcl 。式中j 是荧光物质的荧光效率，I0为入射光强度，ε为荧光物质的摩尔吸光系数，c 为荧光物质的浓度，l 为样品池的厚度。该式表明在I0及l 一定的情况下荧光强度与该物质的浓度呈正比，还受到溶剂，温度，PH 值的影响。

Trp、Tyr 以及Phe 由于其侧链生色基团的不同而有不同的荧光激发和发射光谱。其中T rp 的荧光强度最大, Tyr 次之, Phe 最小。因为蛋白质的荧光通常在280 nm 或更长的波长被激发,Phe 在绝大多数实验条件下不被激发, 所以很少能观察到Phe 的发射。这样蛋白质的内源荧光主要来自T rp 和Tyr 残基。T rp 残基对微环境的变化很敏感, 并且大多数蛋白质中都含有几个不同种类的T rp 残基, 而且在Trp 存在的条件下，Tyr 吸收的能量常常不是自己通过荧光发射释放出来，而是传递给Trp ，由Trp 发出荧光。因而常将Trp 作为内源荧光探针来研究溶液状态下蛋白质的构象。

图3中，左边高峰由上至下分别为浓度2.0， 1.0， 0.5 mg/mL。左边高峰为Trp 的图像，右边低峰则为Tyr 的峰，也由于上述原因没有Phe 的峰

【实验分析】

本实验所得曲线比较清晰，能明确得显示出Trp 及Tyr 的峰，虽然在峰之间的吸收曲线不够平滑。但仍然可能有产生误差的地方，例如：

⑴ 取用比色皿是没有清洗干净，导致杂质进入

⑵ 样品蛋白制取时没有离心，而是用过滤，所以除杂效果不够好

【注意事项】

⑴ 荧光一般随温度上升而减弱，所以荧光实验需要恒温

⑵ Tyr的吸收谱与pH 有关与环境的极性有关

4.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

【实验结果】 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图

图4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图

SDS —聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。该法主要依据蛋白质的分子量对其进行分离。SDS 与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其稳定地存在于一个广泛均一的溶液中。SDS —蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。SDS —PAGE 因易于操作和广泛的用途，使它成为许多研究领域中一种重要的分析技术。

SDS 是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS 的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质—SDS 复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。

脱色后的聚丙烯酰胺凝胶上只见2条不明显条带（如图2）

【实验分析】

未有跑出样的原因可能有：

⑴ PH控制的不够好导致胶跑的不好

⑵ 浓缩胶太短，这样就使得样没聚合好就进入分离胶，导致其散开

⑶ 所配溶液放置时间过长，使得有杂质进入

⑷ 进样量可能过少

⑸ 由于跑电泳时，没有明显的溴酚蓝的条带以至于没有准确掌握好跑带时间

【注意事项】

⑴ 胶面整齐，分离胶距梳尺1cm 即可

⑵ PH严格控制，不能漏胶，不能有气泡，水封胶

⑶ 样品需用1mol/L PH值为8.0的Tris-HCl 溶液溶解并静置1-2h

4. 参考文献

1 王守业; 徐小龙; 刘清亮; 解永树：荧光光谱在蛋白质分子构象研究中的应用；化学进展（Progress In Chemistry）;2001年 04期;

2 如何正确估计蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳样品加样量 高重天 孙群 生物2009/03 3 大豆分离蛋白的凝胶性及其应用的研究进展 王丽 张英华 中国粮油学报2009 4（美）韦弗 著，郑用琏等编译：《分子生物学（第三版）》，科学出版社，2008年版

大豆蛋白的功能性测定

专业：生物工程 班级：08一班 学号：060508131 姓名：戴璐 成绩：

摘要：利用考马斯亮蓝G250测定样品中蛋白含量为百分之十左右远不及样品包装上所说的82%的含量；紫外分光光度计测定大豆蛋白紫外吸收特征，其紫外光谱显示含较多无法除尽的杂质，荧光光度计观察其荧光效应，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其相对分子质量 关键词：大豆蛋白 蛋白含量测定 紫外吸收 电泳 功能性

1. 概述 蛋白质是组成人体的重要物质。是人体生命活动的物质基础，是食品的第一大营养素。大豆是重要的粮油兼用作物，它富含蛋白质、脂肪，是一种营养平衡的食物。其籽粒含蛋白质一般为40%左右，比一般谷物高2-4被，也比牛奶、鸡蛋和瘦猪肉的蛋白质含量高。 大豆是豆科植物中最有营养而又易于消化的食物，是蛋白质最丰富最廉价的来源 。另外，大豆蛋白不含淀粉，氨基酸也组成比较平衡。所以，目前许多蛋白质营养品都是用的大豆蛋白。

2. 材料与方法

1. 考马斯亮蓝G250测定蛋白含量

【材料】 标准蛋白液，样品蛋白，722型分光光度计

【方法】

1>.标准曲线的制作

取7支干净试管，按表一进行编号并加入试管

混匀，室温静置3分钟，以第1管委空白，于波长595nm 处比色，读取吸光度，以吸光度为纵坐标，各标准浓度作为横坐标作图的标准曲线

2>.样液的测定

另一支干净试管，加入样液1.0ml 及考马斯亮蓝染液4.0ml ，混匀，室温静置3min ，于波长595nm 处比色，读取吸光度，由样液的吸光度查标准曲线即可求出蛋白含量

2. 大豆蛋白质的紫外吸收特征

【材料】 标准蛋白液，样品蛋白，UV-9100型紫外分光光度计

【方法】 将大豆蛋白溶于1mol/L PH值为8.0的Tris-HCl 溶液中，配制成2.0mg/mL的蛋白质溶液，以对应的Tris-HCl 作参比，做紫外-可见扫描，速度10nm/s，范围200-400nm 之间

3. 大豆蛋白质的疏水性及荧光光谱

【材料】 标准蛋白液，样品蛋白，日本岛津RF-5310PC 型荧光光度计，离心机，100mL 烧杯2个，玻璃棒1个

【方法】 将大豆蛋白溶于1mol/L PH值为8.0的Tris-HCl 溶液中，配制成0.5，1.0，2.0mg/mL的蛋白质溶液，3000r/min离心10min ，以以相对应的Tris-HCl 作参比，采用日本岛津RF-5310PC 型荧光光度计进行荧光测定，激发波长280nm, 发射波长300-800nm 之间

4.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

【材料】 直流稳压电泳仪，垂直平板电泳槽

⑴ 分离胶缓冲液 1.5mol/L Tris-HCl (pH8.8)

取18.15g Tris, 加80ml 重蒸水，用1mol/L的HCL 调pH 至8.8，用重蒸水稀释至最终体积为100ml ，4℃冰箱保存。

⑵ 浓缩胶缓冲液 0.5mol/L Tris-HCl (pH6.8)

取6g Tris, 用1mol/L的HCL 调pH 至6.8，用重蒸水稀释至最终体积为100ml ，4℃冰箱保存。

⑶ 10% (w/v) SDS ⑷ 凝胶储备液：29.2g 丙烯酰胺，0.8g 亚甲基双丙烯酰胺，加重蒸水至100ml 。外包锡纸，4℃冰箱保存，30天内使用。

⑸ 两类样品缓冲液

A 2倍还原缓冲液：0.5mol/L Tris-HCl (pH6.8)2.5ml,甘油2.0ml ，质量浓度10%SDS 4.0ml, 质量浓度0.1%溴酚蓝0.5ml ，β-巯基乙醇1.0ml

B 2倍非还原缓冲液：重蒸水1.0ml,0.5mol/L Tris-HCl (pH6.8)2.5ml,甘油2.0ml ，质量浓度10%SDS 4.0ml,质量浓度0.1%溴酚蓝0.5ml

⑹ 电泳缓冲液PH8.3

3g Tris，14.4g 甘氨酸，1g SDS，加重蒸水至1L,4℃冰箱保存 ⑺ 低相对分子质量标准蛋白（已配好） ⑻ 质量浓度10%过硫酸铵：此溶液需临用前配制 ⑼ 染色液：0.25g 考马斯亮蓝R-250，加入91ml 50%甲醇，9ml 冰醋酸即成。 ⑽ 脱色液：将50ml 甲醇，75ml 冰醋酸，875ml 重蒸水混匀。

⑾ 蛋白样品提取方法同前三个实验

【方法】

1>将垂直平板电泳槽装好，用水检漏

2>分离胶的灌制

根据待测蛋白质样品的相对分子质量选择合适的分离胶浓度，本实验选用大豆蛋白样品为待测相对分子质量的样品，用12%的分离胶

在15mL 试管中依次加入重蒸水3.35mL ，1.5mol/L Tris-HCL(PH8.8)缓冲液

2.5mL,10%SDS 0.1mL, 凝胶储备液4.0mL ，10%过硫酸铵50μl 和TEMED 5μl, 由于加入TEMED 后凝胶就开始聚合，所以应立即混匀混合液，然后用滴管吸取分离胶，在电泳槽的两玻璃板之间灌注，留出梳齿的齿高1cm 的空间以便灌注浓缩胶。用滴管小心地在溶液上覆盖一层重蒸水，将电泳槽垂直静置于室温下30-60min ，分离胶则聚合，待分离胶聚合完全后，除去覆盖的重蒸水，尽可能去干净

3>浓缩胶的配制和灌制

一般采用5%的浓缩胶，配制方法:重蒸水2.92mL ，0.5mol/L Tris-HCl (pH6.8)缓冲液

1.25mL,10%SDS 0.05mL,凝胶储备液0.8mL ，10%过硫酸铵25μl 和TEMED 5μl, 在试管中混匀，灌注在分离胶上。小心插入梳齿，避免混入气泡，将电泳槽垂直静置于室温下至浓缩胶完全聚合，约30min

4>样品的制备

⑴ 标准蛋白样品的制备

取出一管预先分装好的20μl 低相对分子质量标准蛋白，放入沸水浴中加热3-5min ，取出冷至室温

⑵ 待测蛋白样品的制备

a.10μl 蛋白质样品加10μl 2倍还原缓冲液

b.10μl 蛋白质样品加10μl 2倍非还原缓冲液

以上a,b 两管均为同标准蛋白样品一样，在沸水浴中加热3-5min ，取出冷至室温

5>电泳

⑴ 带浓缩胶完全聚合后，小心拔出梳齿，用电极缓冲液洗涤加样孔数次，然后将电泳槽注满电极缓冲液

⑵ 用微量注射器按号向凝胶梳孔内加样

⑶ 接上电泳仪，打开电泳仪，调节电流至20-30A 并保持恒定，待蓝色溴酚蓝条带迁移至距凝胶下端1cm 时，停止电泳

6>染色与脱色

小心将胶取出，置于一培养皿中，加染色液0.5h ，倾出染色液，加入脱色液，数小时更换一次，直至背景清晰

7>相对分子质量的计算

相对迁移率 = 样品迁移距离 / 染料迁移距离

根据待测样品相对迁移率，从标准曲线上查出相对分子质量

3. 结果与分析

1.考马斯亮蓝G250测定蛋白含量

【实验结果】

其标准曲线为图1

图1 考马斯亮蓝法测定蛋白浓度--标准曲线图

考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。考马斯亮蓝G250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm 。当它与蛋白质结合形成复合物时，呈蓝色，其最大吸收峰改变为595nm, 考马斯亮蓝G250-蛋白质复合物的高消光效用导致了蛋白质定量测定的高敏感度。

在一定范围内，考马斯亮蓝G250-蛋白质复合物呈色后，在595nm 下，吸光度与蛋白质含量呈线性，可用于蛋白质浓度的测定

测得样品的吸光度为0.126, 根据所得公式计算出被测蛋白质浓度为15.847µg/ml

【实验分析】

所配蛋白粉溶液浓度为50µg/ml，由于其蛋白质含量为82%，所以所得蛋白质溶液浓度为42µg/ml，于所测定的结果有较大区别，但所作多次结果基本相同，所以可能原因有 ⑴ 所用1mol/L PH值为8.0的Tris-HCl 溶液的PH 不是8.0，所以导致溶解度变小 ⑵ 培养时静置时间不够长，导致有部分蛋白质还未溶解

⑶ 应同时进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，可能有SDS 混入其中

⑷ 可能是样品真的存在问题

【注意事项】

⑴ 在使用分光光度计之前必须预热10min 以上

⑵ 样品蛋白质含量应在10-100µg 为宜。一些阳离子如K+、Na+、Mg+、乙醇等物质对测定无影响，而大量的去污剂如SDS 等会严重干扰

2. 大豆蛋白质的紫外吸收特征

【实验结果】 所测紫外吸收特征如图

2

图2 大豆蛋白质的紫外吸收特征图

蛋白质在紫外光吸收为：1. 肽键在

实验时测了200-600nm 的吸光度，测得在280nm 处有最大吸收峰，可在200～220nm 处的吸收峰过多，没特别明显的峰，无法判断肽键的峰，所以没能计算含量

【实验分析】

本实验在200-600nm 处有两个峰，但所测峰杂乱，且不是很光滑，说明样品液中存在较多杂质无法判断肽键的存在 ；在280nm 处则比较清晰明显，，也说明色氨酸残基和酪氨酸残基分子内部存在着共轭双键。可能存在以下原因：

⑴ 配制样品时没离心，而是用过滤，所以除杂效果不够好

⑵ 培养时静置时间过长，导致有部分杂质未溶解

⑶ 应同时进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，可能有SDS 混入其中

【注意事项】

样品需用1mol/L PH值为8.0的Tris-HCl 溶液溶解并静置1-2h

3. 大豆蛋白质的疏水性及荧光光谱

【实验结果】 大豆蛋白质的荧光光谱如图3

图3 大豆蛋白质的荧光光谱

对于稀溶液（A=εcl ≤0.05）而言，其荧光强度F=2.3JI0εcl 。式中j 是荧光物质的荧光效率，I0为入射光强度，ε为荧光物质的摩尔吸光系数，c 为荧光物质的浓度，l 为样品池的厚度。该式表明在I0及l 一定的情况下荧光强度与该物质的浓度呈正比，还受到溶剂，温度，PH 值的影响。

Trp、Tyr 以及Phe 由于其侧链生色基团的不同而有不同的荧光激发和发射光谱。其中T rp 的荧光强度最大, Tyr 次之, Phe 最小。因为蛋白质的荧光通常在280 nm 或更长的波长被激发,Phe 在绝大多数实验条件下不被激发, 所以很少能观察到Phe 的发射。这样蛋白质的内源荧光主要来自T rp 和Tyr 残基。T rp 残基对微环境的变化很敏感, 并且大多数蛋白质中都含有几个不同种类的T rp 残基, 而且在Trp 存在的条件下，Tyr 吸收的能量常常不是自己通过荧光发射释放出来，而是传递给Trp ，由Trp 发出荧光。因而常将Trp 作为内源荧光探针来研究溶液状态下蛋白质的构象。

图3中，左边高峰由上至下分别为浓度2.0， 1.0， 0.5 mg/mL。左边高峰为Trp 的图像，右边低峰则为Tyr 的峰，也由于上述原因没有Phe 的峰

【实验分析】

本实验所得曲线比较清晰，能明确得显示出Trp 及Tyr 的峰，虽然在峰之间的吸收曲线不够平滑。但仍然可能有产生误差的地方，例如：

⑴ 取用比色皿是没有清洗干净，导致杂质进入

⑵ 样品蛋白制取时没有离心，而是用过滤，所以除杂效果不够好

【注意事项】

⑴ 荧光一般随温度上升而减弱，所以荧光实验需要恒温

⑵ Tyr的吸收谱与pH 有关与环境的极性有关

4.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

【实验结果】 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图

图4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图

SDS —聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。该法主要依据蛋白质的分子量对其进行分离。SDS 与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其稳定地存在于一个广泛均一的溶液中。SDS —蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。SDS —PAGE 因易于操作和广泛的用途，使它成为许多研究领域中一种重要的分析技术。

SDS 是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS 的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质—SDS 复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。

脱色后的聚丙烯酰胺凝胶上只见2条不明显条带（如图2）

【实验分析】

未有跑出样的原因可能有：

⑴ PH控制的不够好导致胶跑的不好

⑵ 浓缩胶太短，这样就使得样没聚合好就进入分离胶，导致其散开

⑶ 所配溶液放置时间过长，使得有杂质进入

⑷ 进样量可能过少

⑸ 由于跑电泳时，没有明显的溴酚蓝的条带以至于没有准确掌握好跑带时间

【注意事项】

⑴ 胶面整齐，分离胶距梳尺1cm 即可

⑵ PH严格控制，不能漏胶，不能有气泡，水封胶

⑶ 样品需用1mol/L PH值为8.0的Tris-HCl 溶液溶解并静置1-2h

4. 参考文献

1 王守业; 徐小龙; 刘清亮; 解永树：荧光光谱在蛋白质分子构象研究中的应用；化学进展（Progress In Chemistry）;2001年 04期;

2 如何正确估计蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳样品加样量 高重天 孙群 生物2009/03 3 大豆分离蛋白的凝胶性及其应用的研究进展 王丽 张英华 中国粮油学报2009 4（美）韦弗 著，郑用琏等编译：《分子生物学（第三版）》，科学出版社，2008年版