家庭组织培养

家庭组织培养

植物的组织培养没有最基本的条件和物品是搞不成的,当时合理的利用一些最简单的用具也并非无法办到。

一、最必需的物品

1、. 家用高压锅 1个最好大一点的,装的东西多一点。用于培养基、无菌水等的消毒

2、接种箱 (无菌箱)1个 ,需要自己自制,用一些木板和一块玻璃和二尺布料。用于接种和转移。

3、药用天平1架 最好是500g 称量的,小一点也可以,主要用来称琼脂、糖等物品。

4、不锈钢锅或铝锅。用于煮制培养基用的。

5、搅拌和分装培养基用的调羹一个,用于煮制和分装培养基。

6、培养用的瓶子若干,

7、制棉塞用的棉花、纱布和线若干,用于做瓶口的塞子,要注意的是,棉花要使用普通做棉衣的棉花,不要用医院用的脱脂棉,这样容易穿塞污染。

8、牛皮纸、橡皮圈若干,用于包瓶头和扎包头纸用。

9、酒精灯1盏、解剖刀1把,刀片若干、镊子2把、10ml 、100ml 量筒各一个,2ml 移液管1只、药棉若干。

二、怎样解决蒸馏水和基本药品

培养基的用水在一般人的心目总是觉的十分重要的,其实是多余的担心。冷开水、清洁的河水都是给以用的,并不影响培养的效果。市场上出售的纯净水更是一般 培养基理想的用水。最常用、最必要、用量最大的只需购买以下几种就行了。

1、MS 培养基的大量元素共5种。也可以买市售的MS 培养基

(1)、硝酸铵

(2)、硝酸钾

(3)、 氯化钙

(4)、硝酸镁

(5)、磷酸二氢钾

2、酒精

3、精密试纸(PH 5.4-7.0)

4、漂白粉或漂白精

5、琼脂

6、白糖

7、福尔马林

8、高锰酸钾(可以到医院或药材商店去买)

9、微量元素、铁盐、维生素类以及激素类药品应用量极少。比如一些激素、维生素类的药品及有针剂也有片剂,他们都有比较准确的含量,你可以去按你的需要去配制比例。

爱好者在家庭环境下进行组织培养的探讨与建议植物组织培养技术,尤其是快速繁殖,并非只有专业人员和专业实验室才能够完成的。作为对多肉植物和组织培养有着浓厚兴趣的爱好者,在充分利用家庭条件的基础上,同样可以制备出自己的试管苗来的。在我们进行多肉植物的栽培中认识到,一些比较名贵的园艺品种,比如:万象、玉扇、寿、高纹鹰爪等十二卷属品种,还是缤纷橄榄、何鲁牵牛等块茎类植物,甚至于星球属、岩牡丹属等等,这些植物的常规繁殖系数很低,他们都可以采用组织培养来解决其繁殖问题,并且可以得到相当数量的幼苗。对于奇想天外等种子萌发困难的植物,同样可以借助组织培养来进行无菌播种。在进行组织培养过程中,不但可以对培养的植物有更深一层的认识,对常规的栽培有着相当大的意义。许多搞组织培养的专家,最初都不是专业学组培的,就是凭着兴趣和探索精神取得辉煌成绩的。关键是,爱好者有着浓厚的兴趣,非凡的观察力和细致入微的操作,这些都可以弥补非专业的缺陷,并且可以充分利用日常生活中的各种可利用资源,这些就足以让爱好者在家庭环境下完成组织培养了。同时这也不仅仅满足了自己的兴趣,还可以有一定的经济收益,甚至可以有所创新和发明。

一、如何解决场地和基本设备:

进行组织培养,没有一定的设备是无法开展的。正规实验室的组织培养设备是昂贵的,不适合家庭消费,但如果能有途径买到廉价的实验室设备,那就在好不过了。如果没有办法搞到实验室设备,就不妨动手自己制作一些简单的设备。

1. 无菌操作的主要设备——接种箱和压力锅:

接种箱:植物组织培养的主题操作需要在一个相对密闭的无菌环境中进行。那么说我们首先要创造一个密闭的环境,可以利用一些木料、塑料板、有机玻璃、铝合金骨架等等廉价的材料,动手粘合一个小巧的接种箱。具体的参数可以找一本“食用菌栽培”的书籍,模仿种蘑菇的接种箱做一个即可。需要注意的是,组织培养的接种箱的密闭性要求比较高,尽量避免腐朽的木材和易生锈的材料,箱子的顶端按放两盏灯:20w 的紫外线灯和20w 的日光灯。箱体的周边尽量采用玻璃材料,因为这样便于观察,有时候接种箱还可以借用为培养箱,周边采用玻璃材料更方便于观察和培养。

高压锅:主要用来对培养基和其他材料的灭菌。在实验室通常使用医用高压灭菌器,然而在

家庭要充分利用厨房使用的高压锅,高压锅的压力要低于灭菌器,但是适当延长灭菌时间,还是可以取得较好的效果的。比如:对培养基灭菌40分钟就基本上可以达到灭菌效果;无菌水采用间歇灭菌法,先用高压锅压40分钟,放置24小时,再压20分钟即可达到效果。

2. 场地:

这个就因人而易了,总体的要求就是进行组织培养操作的地方要尽量无尘,减少空气流动,最好有一定的阳光。比如书房、写字间都可以用来进行无菌操作。

进行培养基的配制可以借用一下厨房,但所使用的器具必须和厨具分开。一般说,组织培养中的几乎全部化学物质对人体是无害的,除了少数激素类物质和灭菌剂。对于有毒害的物质,需要认真保管,以免发生危险。

3. 辅助设备:

主要指冰箱,它是用来储存化学物质和培养基的。天平,可以采用感量在100克的托盘天平,甚至用中药的药衡都可以代替。培养架,这个就更简单了,采用铝合金-玻璃的培养箱既可以满足要求,如果日光不足,可配合日光灯补光等。

4. 化学试剂:

化学试剂是不可缺少的,因为组织培养的核心就是培养基的成分,而并不是简单的无菌操作。一些用量较大的化学物质是有必要买的,比如大量元素(、高锰酸钾、甲醛、酒精、白砂糖、琼脂等等。微量元素和有机复合物不需要购买,因为它们的用量很小,我们可以用蔬菜浸汁或者马铃薯浸汁来代替。激素是必不可少的,他们的称量需要借助分析天平,但这是家庭条件所不允许的,如果有条件可以借助关系单位代替配成母液,每次取一些使用即可。最好的办法是到农资商店,它们一般出售农业用的激素,有的是用安瓿装的,按照一定的比例加入到培养基当中即可。近几年来,有些化学品公司开始生产植物组织培养基原粉,只需要称取一定量加水即可,很方便。比如泛生化学品公司生产的ms 原粉,只需要称量40克,加1升水,用微波炉加热5分钟即可分装,相当简便。

消毒剂通常采用氯化汞(剧毒),如果不容易搞到,可以用漂白粉代替。

调节酸碱度时,可以采用家庭常用的纯碱和白醋。

5. 培养容器和玻璃仪器:

组织培养的容器要求并不高,只要玻璃颜色为透明色即可。

我们可以到垃圾站去看看,捡回一些废旧的果酱瓶就可以了。比较好用的是阿香婆辣酱瓶,我们实验室也是采用的这种瓶子。瓶子的封口膜采用聚丙烯塑料即可,如果不好找到,可以采用微波炉专用的锡箔纸甚至方便面的袋子,折叠成双层,用橡皮圈固定即可。

其它玻璃仪器,比如烧杯、玻璃棒都可以用家庭的杯子和筷子代替;一些度量仪器,如量筒和移液管最好到玻璃仪器商店购买,恐怕花不了20元钱就可以配置一套相当棒的组培玻璃仪器。

6. 其它:

还有一些用品是必需的。比如精密ph 试纸(5.4~7.0),需要买一本,大约花1.5元即可搞定;酒精灯也不需要买,用墨水瓶配上一个玻璃环,再加上一个棉花芯,最后用农夫山泉矿泉水的瓶盖做灯冒,这样的酒精灯很小巧,适合接种箱使用。刀子剪子镊子是必需的,到花市的工具摊位上,花10元钱全部搞定,注意选比较小巧的工具。

关于用水,按理说应该使用蒸馏水,但是我们家庭饮用的纯净水比蒸馏水还要纯,那么说借用一些饮用水就可以了。我们曾经采用康师傅纯净水进行动物细胞的培养,效果都是很不错的,更何况于植物细胞培养了。

以上是组织培养的基本设备和试剂,主要突出了他们相关的替代品,因为作为组织培养中的快速繁殖,它的要求是相当低的。我们的家庭培养和工厂化是不同的,工厂化生产组培苗要追求高增殖率,所以它的要求就比较精细和标准。我们的家庭培养则不需要那么准确,只要达到培养成功的目的即可。当然,如果想提高增殖倍率和试管苗的品质,必须尽量贴近实验室的用具和器材,代用品总是有一定的缺陷的。

(一)必须的设施物品及代用品

1、代用品

家庭用的电冰箱,可用于贮存培养基母液(4℃)及需低温贮存的药品。

高压锅:它可用于培养基、无菌水、玻璃器皿及其他组培用具的消毒灭菌。如所用水硬度大可用凉白开水,进行消毒灭菌。避免被消毒灭菌物品表面结垢。

不锈钢锅或铝锅:它可用于培养基、溶化琼脂及组培用具消毒灭菌。

刷净的废弃食油桶:它可以用来贮存蒸馏水。

小白瓷碟:可以用于接种及盛放消毒液。

日光灯:它可用于组培过程中光源补充。

洗净废弃的罐头瓶:它可以用于组培培养之用,代替锥形瓶、试管。

组培场地可在自己的房间内进行。在配制培养基和接种时,不要赶在家庭成员较多时进行,如室内已安装了空调,那么在初代培养和继代培养、乃至小苗过渡时均有好处。

2、自制用具

(1)接种箱的制作:组培过程中的超净工作台是很贵重的设备。如果我们用自制的接种箱来代替,就可以大大节省开支,有利于普及。

自制的接种箱的用料,可以是胶合板、纤维板、玻璃(3毫米厚)、木条甚至可以用使纸板的包装箱,也可以用有机玻璃。

其接种箱的大小,可以根据各自的家庭条件制作。制作太小不便于操作,但相对来说消毒容

易,且占地较少;制作较大的便于操作,但消毒工作显得不易,且占地面积较多。一般来说作成70厘米长、45厘米宽。50厘米高较为合适。

(2)培养箱的制作:培养箱可代替培养室,也可以用于过渡苗使用。它可以用玻璃制作,或利用长方形鱼缸。因此,可用玻璃粘结制作。其大小可按自己家庭居室面积和组培的量来决定。

3、需购置用具

普通天平(500克):用于称量配制培养基药品,或用称量金银、中药的戥子称,用于称量配制培养基药品、微量元素及生物调节剂;或购买微量元素及生物调节剂时,买已分装的。酒精灯1盏:用于接种时,灼烧消毒灭菌。漏斗:用于分装培养基用。长镊子2把:用于接种。解剖刀2把、刀片若干:用于接种。10、50、100毫升量筒各1个:用于配制培养基用。长把牛角勺2把:用于配制培养基取药品。1、2、5毫升移液管各1个:用于配制培养基用。

耐高温塑料膜或牛皮纸:用于包扎培养瓶口及表糊自制接种箱内部棱角处。橡胶圈:用于绑扎培养瓶口。脱脂棉:用于操作人员及组培用具酒精棉球消毒。pH(5~7)试纸1本:用时可剪成小条检测培养基pH 值。酒精1瓶:用于酒精灯及消毒。漂白粉1瓶:用于消毒。福尔马林1瓶:用于接种箱消毒(在每次操作前2~10小时,将10~20毫升福尔马林倒入小白瓷碟内,在操作前取出)。MS 培养基所需药品;用于配制培养基。盐酸及氢氧化钠:用于调pH 值。如若购置1盏紫外灯,进行室内及接种箱消毒更为理想。

(二)操作时注意事项

家庭操作与单位不同,因而要注意以下事项:要注意安全,妥善保管药品。特别对老人和小孩;操作时要消毒仔细严格,接种时操作人员戴好口罩、工作帽,避开电风扇及大风沙天气,家庭成员多时避免操作;消毒前后避免家庭所养宠物进人工作间;药品称量要准确无误;如果家庭不具备温度调控(如调温空调),应避免在盛夏、寒冬进行;红掌组培要一步步来作,可先作容易组培的花卉,待取得经验后再做难作的花卉。

1. 培养容器和玻璃仪器的准备:

进行培养基的配制首先要准备好培养瓶和配制使用的玻璃仪器。培养瓶一般使用各种果酱瓶,要先用洗洁精浸泡瓶子4~8小时,再用流水冲洗数次。其他的玻璃仪器同样需要这样清洁,直到玻璃壁上不挂水珠而是成为水膜为止。清洗完毕的玻璃容器要倒扣,空去瓶内的水。

清洗干净的容器要注意防尘,尽量放置在玻璃柜中。更简单的是用干净的毛巾将容器盖住。

移液管要用吸球来清洗,反复用蒸馏水吹吸直到洁净为止,将移液管放置在一个长筒中,便于使用。一般移液管只能使用一次,即要清洗,所以有多必要准备几只移液管,建议:10ml/2支,5ml/2支,1ml/5支。

2. 培养基的配制:

经典的组织培养用培养基是ms 配方,其基本上划分为:大量元素、微量元素、铁盐、有机

复合物、植物激素、糖和支持物。这些成分的用量都在毫克级,用普通天平是难以称量的,为了解决这个问题,我们可以按比例放大各成分的用量配制成母液,使用的时候按一定比例加入即可。

下面将一种ms 培养基的母液配制方案公布如下:

大量元素:硝酸铵66.0克;

硝酸钾76.0克;

无水氯化钙13.3克;

七水硫酸镁14.8克;

磷酸二氢钾6.8克。

以上分别溶解后合并定容到1升,每配制1升标准ms 培养基取25毫升。

铁盐:七水硫酸亚铁5.56克;

乙二胺四乙酸二钠(edtana )7.46克。

以上两种分别加热溶解,混合,定容到1升,调整ph 到5.5以下,每配制一升ms 取5毫升。

微量元素和有机复合物的用量过于微小,为了简便我们可以用蔬菜提取液或者马铃薯提取液代替。通常我们习惯用100克菠菜加100ml 的水煮沸10分钟,过滤留滤液,每配制1升ms 培养基加入20~50毫升提取液。同样也可以使用带皮马铃薯100克加200毫升水煮沸15分钟,过滤留滤液,每升ms 加入50~100毫升即可。

加入上述各组分后,每升ms 培养基还需要加入白砂糖30克,琼脂7克。

这里要说明的是,糖和琼脂都是可变的量,要根据需要调整。另外制作果冻用的卡拉胶也可以代替琼脂,透明度更好。

上述各成分加入后,定容到800毫升左右,用微波炉加热,直到琼脂全部溶解为止。此时加入所需的植物激素(通常配制成0.1%溶液,这样每取1毫升,换算到培养基中就是

1ppm )。然后加水定容到1100毫升(1.1升),之所以多出0.1升是为了抵消分装和消毒中的损耗。最后用酸碱调整ph 到5.8~6.0。

3. 使用ms 原粉配制培养基:

目前国内的一些化学品公司开发了简便的ms 培养基原粉,大大简便了培养基的配制,根据不同公司的说明选择培养基的种类。下面就以ms 原粉为例: ms 培养基原粉,包括了大量元素、微量元素、铁盐、有机复合物、糖和琼脂,一般按使用方法称量,微波炉加热溶解,加入激素,定容到1100毫升(1.1升),调整ph 值到5.8~6.0。

4. 分装:

将配制好的培养基分装在培养容器中,注意要趁热分装,因为琼脂在40度以下就会凝固。每个培养瓶装培养基大约是瓶容积的1/6~1/5,注意不要将培养基挂在瓶的外壁,这样容易造成污染。分装后用聚丙烯薄膜或着方便面的袋子封口,用胶圈固定(胶圈尽量选择自行车的内胎,这种胶圈比较耐热)。

5. 灭菌:

采用家庭压力锅消毒,建议到医疗器械用品商店买一些“灭菌效果试纸”,它们可以指示灭菌效果,当灭菌达到效果时会变色。把试纸和培养基同时放入锅内,加热到有大量蒸汽冒出,再加上压力伐,维持小火30~40分钟。

灭菌完毕后自然冷却,将培养基取出,放在阴凉无尘处备用。

6. 接种箱的准备:

新制作的接种箱必须要清洁干净,尽量做到无死角。每次使用前2小时,将操作所需要的全部物品放入接种箱,再用一个小烧杯加入3~5克高锰酸钾放入接种箱内,在箱内向烧杯中倒入2~3毫升的甲醛溶液,大约几秒钟后会看到甲醛蒸汽出现,这样可以对接种箱内的所有物品进行初次消毒;同时打开紫外线灯照射。紫外线灯是高电压穿激汞蒸汽产生的,紫外线进行第二道灭菌,在紫外线照射大约15分钟后,会激发氧气形成臭氧,臭氧作为第三道灭菌防线,这样经过三次灭菌,接种箱基本上可以达到无菌标准。

在操作前15分钟内,向刚才蒸发甲醛用的烧杯中倒入5毫升浓氨水,因为甲醛对人体有毒害作用,氨水可以和甲醛形成一种叫做“六亚甲基四胺”的固体物质,从而中和了甲醛的刺激性蒸汽。这个时候紫外灯不要关掉,要继续照射,直到操作前5分钟关闭,维持黑暗5分钟,然后再打开日光灯进行操作。维持5分钟黑暗的原因是,紫外光对微生物的杀灭是作用于dna 的胸腺嘧啶,形成四聚体,但是微生物具有一种光复活蛋白,可以在有可见光的环境下还原胸腺四聚体,而使微生物复活,这个作用叫做“光复活作用”,所以在关掉紫外灯后必须维持黑暗几分钟,避免光复活作用的出现。

怎样在家庭开展组培工作

制备

家庭组培因受到条件的限制,不可能配置大量的配养基,,一般每次配置1升为宜。煮制后用PH 试纸测定后,分装成35-40瓶,塞好棉塞,包好包头纸。(棉塞一定要用作棉衣的棉花卷制,不能使用脱脂棉,然后用纱布包紧,用棉线扎好。棉塞的松紧以手提棉塞瓶子不滑落为宜。)然后放入高压锅里高压灭菌,待高压锅喷嘴喷出蒸汽时,扣上压力阀,从压力阀喷气时起计时,连续维持15-20分钟后关火,压力消失后,打开锅盖,取出配养基,放入接种箱内待用。初次实验时,灭菌后的培养基应放置三五天后,观察无霉菌生长时才能使用。如有霉菌长出,这说明灭菌时间不够,,需要适当增加灭菌时间。

接种

将灭菌后的配养基、无菌水、消毒药水及使用的器材放入接种箱内,因接种箱内的体积相对较小,所以所用的一切物品都要有序地摆放在相应的位置上,不能随意摆放,箱内湿度较大,点酒精灯一定要是用打火机,不要使用火柴。要特别注意准备好装污水、污物的容器,尽可能地大一些,因为操作时是不容许开箱取物的。把所有的物品放置好以后,将一装有10-20ml 福尔马林的磁杯放入箱内(最好不要使用玻璃杯,因反应时温度较高,容易炸裂。),倒入2-5g 高锰酸钾(PP 粉),使其蒸气充满箱内,达到灭菌的效果。这时要将接种箱的通气孔和操作孔封闭好,避免甲醛蒸气很快散尽。待箱内蒸气散尽后,才能开始接种工作,这段时间大约需要5-10个小时。

接种时,揭去密封在接种箱通气孔和操作孔上的密封物,取出熏蒸用的磁杯,将接种用的材料送入接种箱内,开启紫外线灯,十五分钟后关闭紫外线灯,开启照明灯,即可开始工作。操作时一定要树立无菌观念,要把一切物品都看成是带菌的,要时时都注意防范。工作是由于箱内温度较高,湿度较大,手容易出汗,所以每接种一瓶后都要用酒精擦拭手指,也可以戴指套。另外,操作时要注意防火,由于空间较小,一不小心就容易烧伤手指或引起酒精起火。打开瓶塞时,要将瓶口置于酒精灯上方,用右手的无名指和小指夹住棉塞尾,轻轻将棉塞拔出,棉塞不能置于箱内物品上,应用手指夹住,接种后,将瓶口在酒精灯上烧灼一下,棉塞也烧灼一下,,然后在酒精灯火焰上方轻轻塞好,扎好包头纸,用铅笔标明品种、接种日期、编号等,然后重复下一瓶。

其实,用接种箱接种与超净工作台相比较,工作时人要感觉舒适得多。污染率也是很低的,操作熟练后几乎没有什么污染发生。接种后愈伤组织分化、小苗分化、生长状态与在超净台上接种的没有什么两样。

培养

在家庭的业余条件下培养培养的条件不可能得到专控,所以要充分的利用自然条件,接种后的培养瓶可以放在有较强散射光的地方,如靠窗的书柜、写字台上,但要避免日光直射,一般室温在22-28摄氏度时都能正常生长,不是特殊的品种不需要特殊的护理。如室温太低,可以用纸板、木条、塑料薄膜做一个简单的培养箱,里面装一两个15-25瓦的白织灯,既可以补助光照也可以提高培养的温度。夏天温度过高时,有条件的可以摆放在空调室内,,没有空调室的,降温虽然困难一些,但大多数试管苗是可以耐受的,不至于死去。小苗长出后,摆放在书柜或工作台上,感到自己培养出来的生机勃勃的小生灵,无疑是一种享受。

栽培

当小苗长到一定的时候,就可以配置一些生根配养基将小苗转移培养生根,待长出一定根系时,就可以出瓶种植了。小苗出瓶种植的时候一定要注意以下几个方面,一是要适当降低温度;二是要增大湿度;三是要严格控制杂菌危害;四是要保证种植介质的疏松透气;五是要保证适当的光照。我通常是用跖石、木屑、稻谷壳混合作基质,把小苗种植后用百菌清喷雾浇根,盖上塑料薄膜,少量的小苗干脆用玻璃杯盖住,大约15天后就能揭去覆盖物,便可进行正常管理了。

家庭开展组培其实也并不是一件什么很困难的事情,只要多开动脑筋,多想一些办法,做起

来也是很容易地。万事开头难,办法总比困难多。我1974年在一个县烤烟研究所里当所长,原来条件不允许,科研经费很紧张,刚开始的时候,一年的科研经费只有3000元,那年我做过烟草的花药单倍体、水稻花药培养、柑桔胚乳培养、黑皮果蔗茎尖组织培养、田三七愈伤组织培养、黑节草(石斛)种子的无菌培养、体细胞融合,都获得了很好的成绩,我们就是用这种方法做的,当时北京、上海很多的研究单位来看了很吃惊,他们认为很珍贵的组培小苗,被我们丢得到处都是,觉的不可思议,他们做不出来的,竟然在我们一个十分闭塞的山区里可以做出来。我说这个话的意思不是为自己吹嘘摆功,而是告诉想从事这个行业的朋友,不要自己把自己的能量看得太低,也不要迷信权威、只要自己有信心,严格地按照科学的规律去做,没有什么做不了的,没有什么办不到的。

家庭组培培养基的选择与效果评价

选择合适的培养基是植物组织培养成功的基础。

选择合适的培养基主要从以下两个方面考虑:一是基本培养基;二是各种激素的浓度及相对比例。

MS 培养基适合于大多数双子叶植物,B5和N6培养基适合与许多单子叶植物,特别是N6培养基对禾本科植物小麦、水稻等很有效,White 培养基适合于根的培养。

首先试用这些培养基进行初步实验,可以少走弯路,大大;减少时间、人力和物力的消耗。当通过一系列初试之后,可再根据实际情况对其中的某些成分做小范围调整。

在进行调整时,以下情况可供参考。一是当用一种化合物作为氮源时,硝酸盐的作用比铵盐好,但单独使用硝酸盐会使培养基的PH 向碱性方向漂移,若同时加入硝酸盐和少量铵盐,会使这种漂移得到克服。二是当某些元素供应不足时,培养的植物会表现出一些症状,可根据症状加以调整,如氮不足时,培养的组织常表现出花色苷的颜色(红、紫红色),愈伤组织内部很难看到导管分子的分化;当氮、钾或磷不足时,细胞会明显过度生长,形成一些十分蓬松,甚至呈透明状的愈伤组织;铁、硫缺少时组织会失绿,细胞分裂停滞,愈伤组织出现褐色衰老症状;缺硼时细胞分裂趋势缓慢,过度伸长;缺少锰或钼时细胞生长受到影响。

家庭组织培养

植物的组织培养没有最基本的条件和物品是搞不成的,当时合理的利用一些最简单的用具也并非无法办到。

一、最必需的物品

1、. 家用高压锅 1个最好大一点的,装的东西多一点。用于培养基、无菌水等的消毒

2、接种箱 (无菌箱)1个 ,需要自己自制,用一些木板和一块玻璃和二尺布料。用于接种和转移。

3、药用天平1架 最好是500g 称量的,小一点也可以,主要用来称琼脂、糖等物品。

4、不锈钢锅或铝锅。用于煮制培养基用的。

5、搅拌和分装培养基用的调羹一个,用于煮制和分装培养基。

6、培养用的瓶子若干,

7、制棉塞用的棉花、纱布和线若干,用于做瓶口的塞子,要注意的是,棉花要使用普通做棉衣的棉花,不要用医院用的脱脂棉,这样容易穿塞污染。

8、牛皮纸、橡皮圈若干,用于包瓶头和扎包头纸用。

9、酒精灯1盏、解剖刀1把,刀片若干、镊子2把、10ml 、100ml 量筒各一个,2ml 移液管1只、药棉若干。

二、怎样解决蒸馏水和基本药品

培养基的用水在一般人的心目总是觉的十分重要的,其实是多余的担心。冷开水、清洁的河水都是给以用的,并不影响培养的效果。市场上出售的纯净水更是一般 培养基理想的用水。最常用、最必要、用量最大的只需购买以下几种就行了。

1、MS 培养基的大量元素共5种。也可以买市售的MS 培养基

(1)、硝酸铵

(2)、硝酸钾

(3)、 氯化钙

(4)、硝酸镁

(5)、磷酸二氢钾

2、酒精

3、精密试纸(PH 5.4-7.0)

4、漂白粉或漂白精

5、琼脂

6、白糖

7、福尔马林

8、高锰酸钾(可以到医院或药材商店去买)

9、微量元素、铁盐、维生素类以及激素类药品应用量极少。比如一些激素、维生素类的药品及有针剂也有片剂,他们都有比较准确的含量,你可以去按你的需要去配制比例。

爱好者在家庭环境下进行组织培养的探讨与建议植物组织培养技术,尤其是快速繁殖,并非只有专业人员和专业实验室才能够完成的。作为对多肉植物和组织培养有着浓厚兴趣的爱好者,在充分利用家庭条件的基础上,同样可以制备出自己的试管苗来的。在我们进行多肉植物的栽培中认识到,一些比较名贵的园艺品种,比如:万象、玉扇、寿、高纹鹰爪等十二卷属品种,还是缤纷橄榄、何鲁牵牛等块茎类植物,甚至于星球属、岩牡丹属等等,这些植物的常规繁殖系数很低,他们都可以采用组织培养来解决其繁殖问题,并且可以得到相当数量的幼苗。对于奇想天外等种子萌发困难的植物,同样可以借助组织培养来进行无菌播种。在进行组织培养过程中,不但可以对培养的植物有更深一层的认识,对常规的栽培有着相当大的意义。许多搞组织培养的专家,最初都不是专业学组培的,就是凭着兴趣和探索精神取得辉煌成绩的。关键是,爱好者有着浓厚的兴趣,非凡的观察力和细致入微的操作,这些都可以弥补非专业的缺陷,并且可以充分利用日常生活中的各种可利用资源,这些就足以让爱好者在家庭环境下完成组织培养了。同时这也不仅仅满足了自己的兴趣,还可以有一定的经济收益,甚至可以有所创新和发明。

一、如何解决场地和基本设备:

进行组织培养,没有一定的设备是无法开展的。正规实验室的组织培养设备是昂贵的,不适合家庭消费,但如果能有途径买到廉价的实验室设备,那就在好不过了。如果没有办法搞到实验室设备,就不妨动手自己制作一些简单的设备。

1. 无菌操作的主要设备——接种箱和压力锅:

接种箱:植物组织培养的主题操作需要在一个相对密闭的无菌环境中进行。那么说我们首先要创造一个密闭的环境,可以利用一些木料、塑料板、有机玻璃、铝合金骨架等等廉价的材料,动手粘合一个小巧的接种箱。具体的参数可以找一本“食用菌栽培”的书籍,模仿种蘑菇的接种箱做一个即可。需要注意的是,组织培养的接种箱的密闭性要求比较高,尽量避免腐朽的木材和易生锈的材料,箱子的顶端按放两盏灯:20w 的紫外线灯和20w 的日光灯。箱体的周边尽量采用玻璃材料,因为这样便于观察,有时候接种箱还可以借用为培养箱,周边采用玻璃材料更方便于观察和培养。

高压锅:主要用来对培养基和其他材料的灭菌。在实验室通常使用医用高压灭菌器,然而在

家庭要充分利用厨房使用的高压锅,高压锅的压力要低于灭菌器,但是适当延长灭菌时间,还是可以取得较好的效果的。比如:对培养基灭菌40分钟就基本上可以达到灭菌效果;无菌水采用间歇灭菌法,先用高压锅压40分钟,放置24小时,再压20分钟即可达到效果。

2. 场地:

这个就因人而易了,总体的要求就是进行组织培养操作的地方要尽量无尘,减少空气流动,最好有一定的阳光。比如书房、写字间都可以用来进行无菌操作。

进行培养基的配制可以借用一下厨房,但所使用的器具必须和厨具分开。一般说,组织培养中的几乎全部化学物质对人体是无害的,除了少数激素类物质和灭菌剂。对于有毒害的物质,需要认真保管,以免发生危险。

3. 辅助设备:

主要指冰箱,它是用来储存化学物质和培养基的。天平,可以采用感量在100克的托盘天平,甚至用中药的药衡都可以代替。培养架,这个就更简单了,采用铝合金-玻璃的培养箱既可以满足要求,如果日光不足,可配合日光灯补光等。

4. 化学试剂:

化学试剂是不可缺少的,因为组织培养的核心就是培养基的成分,而并不是简单的无菌操作。一些用量较大的化学物质是有必要买的,比如大量元素(、高锰酸钾、甲醛、酒精、白砂糖、琼脂等等。微量元素和有机复合物不需要购买,因为它们的用量很小,我们可以用蔬菜浸汁或者马铃薯浸汁来代替。激素是必不可少的,他们的称量需要借助分析天平,但这是家庭条件所不允许的,如果有条件可以借助关系单位代替配成母液,每次取一些使用即可。最好的办法是到农资商店,它们一般出售农业用的激素,有的是用安瓿装的,按照一定的比例加入到培养基当中即可。近几年来,有些化学品公司开始生产植物组织培养基原粉,只需要称取一定量加水即可,很方便。比如泛生化学品公司生产的ms 原粉,只需要称量40克,加1升水,用微波炉加热5分钟即可分装,相当简便。

消毒剂通常采用氯化汞(剧毒),如果不容易搞到,可以用漂白粉代替。

调节酸碱度时,可以采用家庭常用的纯碱和白醋。

5. 培养容器和玻璃仪器:

组织培养的容器要求并不高,只要玻璃颜色为透明色即可。

我们可以到垃圾站去看看,捡回一些废旧的果酱瓶就可以了。比较好用的是阿香婆辣酱瓶,我们实验室也是采用的这种瓶子。瓶子的封口膜采用聚丙烯塑料即可,如果不好找到,可以采用微波炉专用的锡箔纸甚至方便面的袋子,折叠成双层,用橡皮圈固定即可。

其它玻璃仪器,比如烧杯、玻璃棒都可以用家庭的杯子和筷子代替;一些度量仪器,如量筒和移液管最好到玻璃仪器商店购买,恐怕花不了20元钱就可以配置一套相当棒的组培玻璃仪器。

6. 其它:

还有一些用品是必需的。比如精密ph 试纸(5.4~7.0),需要买一本,大约花1.5元即可搞定;酒精灯也不需要买,用墨水瓶配上一个玻璃环,再加上一个棉花芯,最后用农夫山泉矿泉水的瓶盖做灯冒,这样的酒精灯很小巧,适合接种箱使用。刀子剪子镊子是必需的,到花市的工具摊位上,花10元钱全部搞定,注意选比较小巧的工具。

关于用水,按理说应该使用蒸馏水,但是我们家庭饮用的纯净水比蒸馏水还要纯,那么说借用一些饮用水就可以了。我们曾经采用康师傅纯净水进行动物细胞的培养,效果都是很不错的,更何况于植物细胞培养了。

以上是组织培养的基本设备和试剂,主要突出了他们相关的替代品,因为作为组织培养中的快速繁殖,它的要求是相当低的。我们的家庭培养和工厂化是不同的,工厂化生产组培苗要追求高增殖率,所以它的要求就比较精细和标准。我们的家庭培养则不需要那么准确,只要达到培养成功的目的即可。当然,如果想提高增殖倍率和试管苗的品质,必须尽量贴近实验室的用具和器材,代用品总是有一定的缺陷的。

(一)必须的设施物品及代用品

1、代用品

家庭用的电冰箱,可用于贮存培养基母液(4℃)及需低温贮存的药品。

高压锅:它可用于培养基、无菌水、玻璃器皿及其他组培用具的消毒灭菌。如所用水硬度大可用凉白开水,进行消毒灭菌。避免被消毒灭菌物品表面结垢。

不锈钢锅或铝锅:它可用于培养基、溶化琼脂及组培用具消毒灭菌。

刷净的废弃食油桶:它可以用来贮存蒸馏水。

小白瓷碟:可以用于接种及盛放消毒液。

日光灯:它可用于组培过程中光源补充。

洗净废弃的罐头瓶:它可以用于组培培养之用,代替锥形瓶、试管。

组培场地可在自己的房间内进行。在配制培养基和接种时,不要赶在家庭成员较多时进行,如室内已安装了空调,那么在初代培养和继代培养、乃至小苗过渡时均有好处。

2、自制用具

(1)接种箱的制作:组培过程中的超净工作台是很贵重的设备。如果我们用自制的接种箱来代替,就可以大大节省开支,有利于普及。

自制的接种箱的用料,可以是胶合板、纤维板、玻璃(3毫米厚)、木条甚至可以用使纸板的包装箱,也可以用有机玻璃。

其接种箱的大小,可以根据各自的家庭条件制作。制作太小不便于操作,但相对来说消毒容

易,且占地较少;制作较大的便于操作,但消毒工作显得不易,且占地面积较多。一般来说作成70厘米长、45厘米宽。50厘米高较为合适。

(2)培养箱的制作:培养箱可代替培养室,也可以用于过渡苗使用。它可以用玻璃制作,或利用长方形鱼缸。因此,可用玻璃粘结制作。其大小可按自己家庭居室面积和组培的量来决定。

3、需购置用具

普通天平(500克):用于称量配制培养基药品,或用称量金银、中药的戥子称,用于称量配制培养基药品、微量元素及生物调节剂;或购买微量元素及生物调节剂时,买已分装的。酒精灯1盏:用于接种时,灼烧消毒灭菌。漏斗:用于分装培养基用。长镊子2把:用于接种。解剖刀2把、刀片若干:用于接种。10、50、100毫升量筒各1个:用于配制培养基用。长把牛角勺2把:用于配制培养基取药品。1、2、5毫升移液管各1个:用于配制培养基用。

耐高温塑料膜或牛皮纸:用于包扎培养瓶口及表糊自制接种箱内部棱角处。橡胶圈:用于绑扎培养瓶口。脱脂棉:用于操作人员及组培用具酒精棉球消毒。pH(5~7)试纸1本:用时可剪成小条检测培养基pH 值。酒精1瓶:用于酒精灯及消毒。漂白粉1瓶:用于消毒。福尔马林1瓶:用于接种箱消毒(在每次操作前2~10小时,将10~20毫升福尔马林倒入小白瓷碟内,在操作前取出)。MS 培养基所需药品;用于配制培养基。盐酸及氢氧化钠:用于调pH 值。如若购置1盏紫外灯,进行室内及接种箱消毒更为理想。

(二)操作时注意事项

家庭操作与单位不同,因而要注意以下事项:要注意安全,妥善保管药品。特别对老人和小孩;操作时要消毒仔细严格,接种时操作人员戴好口罩、工作帽,避开电风扇及大风沙天气,家庭成员多时避免操作;消毒前后避免家庭所养宠物进人工作间;药品称量要准确无误;如果家庭不具备温度调控(如调温空调),应避免在盛夏、寒冬进行;红掌组培要一步步来作,可先作容易组培的花卉,待取得经验后再做难作的花卉。

1. 培养容器和玻璃仪器的准备:

进行培养基的配制首先要准备好培养瓶和配制使用的玻璃仪器。培养瓶一般使用各种果酱瓶,要先用洗洁精浸泡瓶子4~8小时,再用流水冲洗数次。其他的玻璃仪器同样需要这样清洁,直到玻璃壁上不挂水珠而是成为水膜为止。清洗完毕的玻璃容器要倒扣,空去瓶内的水。

清洗干净的容器要注意防尘,尽量放置在玻璃柜中。更简单的是用干净的毛巾将容器盖住。

移液管要用吸球来清洗,反复用蒸馏水吹吸直到洁净为止,将移液管放置在一个长筒中,便于使用。一般移液管只能使用一次,即要清洗,所以有多必要准备几只移液管,建议:10ml/2支,5ml/2支,1ml/5支。

2. 培养基的配制:

经典的组织培养用培养基是ms 配方,其基本上划分为:大量元素、微量元素、铁盐、有机

复合物、植物激素、糖和支持物。这些成分的用量都在毫克级,用普通天平是难以称量的,为了解决这个问题,我们可以按比例放大各成分的用量配制成母液,使用的时候按一定比例加入即可。

下面将一种ms 培养基的母液配制方案公布如下:

大量元素:硝酸铵66.0克;

硝酸钾76.0克;

无水氯化钙13.3克;

七水硫酸镁14.8克;

磷酸二氢钾6.8克。

以上分别溶解后合并定容到1升,每配制1升标准ms 培养基取25毫升。

铁盐:七水硫酸亚铁5.56克;

乙二胺四乙酸二钠(edtana )7.46克。

以上两种分别加热溶解,混合,定容到1升,调整ph 到5.5以下,每配制一升ms 取5毫升。

微量元素和有机复合物的用量过于微小,为了简便我们可以用蔬菜提取液或者马铃薯提取液代替。通常我们习惯用100克菠菜加100ml 的水煮沸10分钟,过滤留滤液,每配制1升ms 培养基加入20~50毫升提取液。同样也可以使用带皮马铃薯100克加200毫升水煮沸15分钟,过滤留滤液,每升ms 加入50~100毫升即可。

加入上述各组分后,每升ms 培养基还需要加入白砂糖30克,琼脂7克。

这里要说明的是,糖和琼脂都是可变的量,要根据需要调整。另外制作果冻用的卡拉胶也可以代替琼脂,透明度更好。

上述各成分加入后,定容到800毫升左右,用微波炉加热,直到琼脂全部溶解为止。此时加入所需的植物激素(通常配制成0.1%溶液,这样每取1毫升,换算到培养基中就是

1ppm )。然后加水定容到1100毫升(1.1升),之所以多出0.1升是为了抵消分装和消毒中的损耗。最后用酸碱调整ph 到5.8~6.0。

3. 使用ms 原粉配制培养基:

目前国内的一些化学品公司开发了简便的ms 培养基原粉,大大简便了培养基的配制,根据不同公司的说明选择培养基的种类。下面就以ms 原粉为例: ms 培养基原粉,包括了大量元素、微量元素、铁盐、有机复合物、糖和琼脂,一般按使用方法称量,微波炉加热溶解,加入激素,定容到1100毫升(1.1升),调整ph 值到5.8~6.0。

4. 分装:

将配制好的培养基分装在培养容器中,注意要趁热分装,因为琼脂在40度以下就会凝固。每个培养瓶装培养基大约是瓶容积的1/6~1/5,注意不要将培养基挂在瓶的外壁,这样容易造成污染。分装后用聚丙烯薄膜或着方便面的袋子封口,用胶圈固定(胶圈尽量选择自行车的内胎,这种胶圈比较耐热)。

5. 灭菌:

采用家庭压力锅消毒,建议到医疗器械用品商店买一些“灭菌效果试纸”,它们可以指示灭菌效果,当灭菌达到效果时会变色。把试纸和培养基同时放入锅内,加热到有大量蒸汽冒出,再加上压力伐,维持小火30~40分钟。

灭菌完毕后自然冷却,将培养基取出,放在阴凉无尘处备用。

6. 接种箱的准备:

新制作的接种箱必须要清洁干净,尽量做到无死角。每次使用前2小时,将操作所需要的全部物品放入接种箱,再用一个小烧杯加入3~5克高锰酸钾放入接种箱内,在箱内向烧杯中倒入2~3毫升的甲醛溶液,大约几秒钟后会看到甲醛蒸汽出现,这样可以对接种箱内的所有物品进行初次消毒;同时打开紫外线灯照射。紫外线灯是高电压穿激汞蒸汽产生的,紫外线进行第二道灭菌,在紫外线照射大约15分钟后,会激发氧气形成臭氧,臭氧作为第三道灭菌防线,这样经过三次灭菌,接种箱基本上可以达到无菌标准。

在操作前15分钟内,向刚才蒸发甲醛用的烧杯中倒入5毫升浓氨水,因为甲醛对人体有毒害作用,氨水可以和甲醛形成一种叫做“六亚甲基四胺”的固体物质,从而中和了甲醛的刺激性蒸汽。这个时候紫外灯不要关掉,要继续照射,直到操作前5分钟关闭,维持黑暗5分钟,然后再打开日光灯进行操作。维持5分钟黑暗的原因是,紫外光对微生物的杀灭是作用于dna 的胸腺嘧啶,形成四聚体,但是微生物具有一种光复活蛋白,可以在有可见光的环境下还原胸腺四聚体,而使微生物复活,这个作用叫做“光复活作用”,所以在关掉紫外灯后必须维持黑暗几分钟,避免光复活作用的出现。

怎样在家庭开展组培工作

制备

家庭组培因受到条件的限制,不可能配置大量的配养基,,一般每次配置1升为宜。煮制后用PH 试纸测定后,分装成35-40瓶,塞好棉塞,包好包头纸。(棉塞一定要用作棉衣的棉花卷制,不能使用脱脂棉,然后用纱布包紧,用棉线扎好。棉塞的松紧以手提棉塞瓶子不滑落为宜。)然后放入高压锅里高压灭菌,待高压锅喷嘴喷出蒸汽时,扣上压力阀,从压力阀喷气时起计时,连续维持15-20分钟后关火,压力消失后,打开锅盖,取出配养基,放入接种箱内待用。初次实验时,灭菌后的培养基应放置三五天后,观察无霉菌生长时才能使用。如有霉菌长出,这说明灭菌时间不够,,需要适当增加灭菌时间。

接种

将灭菌后的配养基、无菌水、消毒药水及使用的器材放入接种箱内,因接种箱内的体积相对较小,所以所用的一切物品都要有序地摆放在相应的位置上,不能随意摆放,箱内湿度较大,点酒精灯一定要是用打火机,不要使用火柴。要特别注意准备好装污水、污物的容器,尽可能地大一些,因为操作时是不容许开箱取物的。把所有的物品放置好以后,将一装有10-20ml 福尔马林的磁杯放入箱内(最好不要使用玻璃杯,因反应时温度较高,容易炸裂。),倒入2-5g 高锰酸钾(PP 粉),使其蒸气充满箱内,达到灭菌的效果。这时要将接种箱的通气孔和操作孔封闭好,避免甲醛蒸气很快散尽。待箱内蒸气散尽后,才能开始接种工作,这段时间大约需要5-10个小时。

接种时,揭去密封在接种箱通气孔和操作孔上的密封物,取出熏蒸用的磁杯,将接种用的材料送入接种箱内,开启紫外线灯,十五分钟后关闭紫外线灯,开启照明灯,即可开始工作。操作时一定要树立无菌观念,要把一切物品都看成是带菌的,要时时都注意防范。工作是由于箱内温度较高,湿度较大,手容易出汗,所以每接种一瓶后都要用酒精擦拭手指,也可以戴指套。另外,操作时要注意防火,由于空间较小,一不小心就容易烧伤手指或引起酒精起火。打开瓶塞时,要将瓶口置于酒精灯上方,用右手的无名指和小指夹住棉塞尾,轻轻将棉塞拔出,棉塞不能置于箱内物品上,应用手指夹住,接种后,将瓶口在酒精灯上烧灼一下,棉塞也烧灼一下,,然后在酒精灯火焰上方轻轻塞好,扎好包头纸,用铅笔标明品种、接种日期、编号等,然后重复下一瓶。

其实,用接种箱接种与超净工作台相比较,工作时人要感觉舒适得多。污染率也是很低的,操作熟练后几乎没有什么污染发生。接种后愈伤组织分化、小苗分化、生长状态与在超净台上接种的没有什么两样。

培养

在家庭的业余条件下培养培养的条件不可能得到专控,所以要充分的利用自然条件,接种后的培养瓶可以放在有较强散射光的地方,如靠窗的书柜、写字台上,但要避免日光直射,一般室温在22-28摄氏度时都能正常生长,不是特殊的品种不需要特殊的护理。如室温太低,可以用纸板、木条、塑料薄膜做一个简单的培养箱,里面装一两个15-25瓦的白织灯,既可以补助光照也可以提高培养的温度。夏天温度过高时,有条件的可以摆放在空调室内,,没有空调室的,降温虽然困难一些,但大多数试管苗是可以耐受的,不至于死去。小苗长出后,摆放在书柜或工作台上,感到自己培养出来的生机勃勃的小生灵,无疑是一种享受。

栽培

当小苗长到一定的时候,就可以配置一些生根配养基将小苗转移培养生根,待长出一定根系时,就可以出瓶种植了。小苗出瓶种植的时候一定要注意以下几个方面,一是要适当降低温度;二是要增大湿度;三是要严格控制杂菌危害;四是要保证种植介质的疏松透气;五是要保证适当的光照。我通常是用跖石、木屑、稻谷壳混合作基质,把小苗种植后用百菌清喷雾浇根,盖上塑料薄膜,少量的小苗干脆用玻璃杯盖住,大约15天后就能揭去覆盖物,便可进行正常管理了。

家庭开展组培其实也并不是一件什么很困难的事情,只要多开动脑筋,多想一些办法,做起

来也是很容易地。万事开头难,办法总比困难多。我1974年在一个县烤烟研究所里当所长,原来条件不允许,科研经费很紧张,刚开始的时候,一年的科研经费只有3000元,那年我做过烟草的花药单倍体、水稻花药培养、柑桔胚乳培养、黑皮果蔗茎尖组织培养、田三七愈伤组织培养、黑节草(石斛)种子的无菌培养、体细胞融合,都获得了很好的成绩,我们就是用这种方法做的,当时北京、上海很多的研究单位来看了很吃惊,他们认为很珍贵的组培小苗,被我们丢得到处都是,觉的不可思议,他们做不出来的,竟然在我们一个十分闭塞的山区里可以做出来。我说这个话的意思不是为自己吹嘘摆功,而是告诉想从事这个行业的朋友,不要自己把自己的能量看得太低,也不要迷信权威、只要自己有信心,严格地按照科学的规律去做,没有什么做不了的,没有什么办不到的。

家庭组培培养基的选择与效果评价

选择合适的培养基是植物组织培养成功的基础。

选择合适的培养基主要从以下两个方面考虑:一是基本培养基;二是各种激素的浓度及相对比例。

MS 培养基适合于大多数双子叶植物,B5和N6培养基适合与许多单子叶植物,特别是N6培养基对禾本科植物小麦、水稻等很有效,White 培养基适合于根的培养。

首先试用这些培养基进行初步实验,可以少走弯路,大大;减少时间、人力和物力的消耗。当通过一系列初试之后,可再根据实际情况对其中的某些成分做小范围调整。

在进行调整时,以下情况可供参考。一是当用一种化合物作为氮源时,硝酸盐的作用比铵盐好,但单独使用硝酸盐会使培养基的PH 向碱性方向漂移,若同时加入硝酸盐和少量铵盐,会使这种漂移得到克服。二是当某些元素供应不足时,培养的植物会表现出一些症状,可根据症状加以调整,如氮不足时,培养的组织常表现出花色苷的颜色(红、紫红色),愈伤组织内部很难看到导管分子的分化;当氮、钾或磷不足时,细胞会明显过度生长,形成一些十分蓬松,甚至呈透明状的愈伤组织;铁、硫缺少时组织会失绿,细胞分裂停滞,愈伤组织出现褐色衰老症状;缺硼时细胞分裂趋势缓慢,过度伸长;缺少锰或钼时细胞生长受到影响。


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