dna粗提取和鉴定

实验用具

洋葱或其他植物、洗洁精、食盐、搅拌机或研钵(我们采用的是家用豆浆机)、纱布、漏斗、烧杯、玻璃棒、量筒(10mL一支)、滴管、试管(20mL两支)、天平。95%酒精、蒸馏水、0.015mol/L的NaCl溶液、二苯胺试剂。

实验材料的选取

凡是含有DNA的生物材料都可以考虑,但是使用DNA含量相对较高的生物组织,成功的可能性更大。

原理

①加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂

蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体,水分可以大量进入血细胞内,使血细胞胀裂,再加上搅拌的机械作用,就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂),从而释放出DNA。

②加入洗涤剂和食盐的作用

洗涤剂是一些离子去污剂,能溶解细胞膜,有利于DNA的释放;食盐的主要成分是NaCl,有利于DNA的溶解。

③研磨不充分,对实验结果产生的影响

研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全,提取的DNA量变少,影响实验结果,导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。

④此步骤获得的滤液中可能含有的细胞成分?

可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质。

实验步骤

1.破碎细胞,获取含DNA的滤液

动物细胞的破碎比较容易,以鸡血细胞为例,在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水,同时用玻璃棒搅拌,过滤后收集滤液即可。如果实验材料是植物细胞,需要先用洗涤剂溶解细胞膜。例如,提取洋

.

葱的DNA时,在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐,进行充分的搅拌和研磨,过滤后收集研磨液。

2. 去除滤液中的杂质

方案一的原理是DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同;方案二的原理是蛋白酶分解蛋白质,不分解DNA;方案三的原理是蛋白质和DNA的变性温度不同。

注意事项

①用高盐浓度的溶液溶解DNA,能除去在高盐中不能溶解的杂质;用低盐浓度使DNA析出,能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此,通过反复溶解与析出DNA,就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。

②方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白,从而使提取的DNA与蛋白质分开;方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同,从而使蛋白质变性,与DNA分离。

DNA的析出与鉴定

将处理后的溶液过滤,加入与滤液体积相等、冷却的酒精溶液,静置2~3min,溶液中会出现白色丝状物,这就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌,卷起丝状物,并用滤纸吸取上面的水分。

取两支20ml的试管,各加入物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液5ml,将丝状物放入其中一支试管中,用玻璃棒搅拌,使丝状物溶解。然后,向两支试管中各加入4ml的二苯胺试剂。混合均匀后,将试管置于沸水中加热5min,待试管冷却后,比较两支试管溶液颜色的变化,看看溶解有DNA的溶液是否变蓝。

实验步骤

1.称取30克已切碎的洋葱,放入研钵中,加入少量石英砂助研,倒入10mL 2mol/L的氯化钠溶液,充分研磨。

洋葱含有挥发性刺激物,有效减少刺激,才能使实验顺利进行。上课前,教师可先将洋葱放入冰箱冷冻一会儿,使其凉透但又不能结冰;或将洋葱切成几大块,放入清水泡一会儿,让其挥发性刺激物溶于水,可以减轻刺激。然后将洋葱切碎备用。研磨的目的主要是使洋葱细胞破裂,使DNA溶于2mol/L的氯化钠溶液,没必要将洋葱研成粥糊状,后者既浪费时间又影响实验效果。研磨时,切忌使用搅拌器(榨汁机)。使用搅拌器虽可以提高研磨效率,但搅拌器将洋葱切成极细小的颗粒,无法通过过滤将洋葱颗粒剔除。只能将酒精直接倒入滤液中,许多洋葱小颗粒因为轻会漂浮起来,DNA藏在其中,无法分辨。学生看不到白色纤维状粘稠物的DNA。

2.研磨后,用漏斗和纱布将汁液过滤到小烧杯中,得到滤液。

3.向滤液中加入95%的酒精溶液20mL,沿烧杯壁缓缓倒入,不要震动或搅拌。

此时,烧杯中的液体分为上、下两层,下层较浑浊,上层澄清,很快上层溶液中就会有白色纤维状粘稠物析出,用玻璃棒可将其轻轻卷起。这就是记录生命遗传信息的重要物质——DNA。DNA析出的过程中,切忌震动和搅拌(不震动易于分层,我们就能很容易观察到上清液中的丝状物;搅拌会使非常柔软的DNA断裂成小段,不易取出)。如果用玻璃棒DNA不易卷起,可改用表面打毛的牙签,DNA提取物就缠绕在牙签上了。

4.鉴定:取两支试管,编为1、2号,各加入2mol/L的氯化钠溶液2mL,向1号试管中加入一些白色纤维状物,振荡使其溶解,然后向两支试管中各加入2mL二苯胺试剂,沸水浴加热5分钟。

注意事项

1.以血液为实验材料时,每100ml血液中需要加入3g柠檬酸钠防止血液凝固。

2.加入洗涤剂后,动作要轻缓、柔和,否则容易产生大量的泡沫,不利于后续步骤地操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时,动作要轻缓,以免DNA分子的断裂,导致DNA分子不能形成絮状沉淀。

3.二苯胺试剂要现配现用,否则会影响鉴定的效果。

4.DNA的溶解度与NaCl溶液浓度的关系:

当NaCl溶液浓度低于0.14mol/L时,随浓度的升高,DNA的溶解度降低;当NaCl溶液浓度高于0.14mol/L时,随浓度升高,DNA的溶解度升高。

5.盛放鸡血细胞液的容器,最好是塑料容器。

鸡血细胞破碎以后释放出的DNA,容易被玻璃容器吸附,由于细胞内DNA的含量本来就比较少,再被玻璃容器吸附去一部分,提取到的DNA就会更少。因此,实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管,这样可以减少提取过程的DNA的损失。

实验用具

洋葱或其他植物、洗洁精、食盐、搅拌机或研钵(我们采用的是家用豆浆机)、纱布、漏斗、烧杯、玻璃棒、量筒(10mL一支)、滴管、试管(20mL两支)、天平。95%酒精、蒸馏水、0.015mol/L的NaCl溶液、二苯胺试剂。

实验材料的选取

凡是含有DNA的生物材料都可以考虑,但是使用DNA含量相对较高的生物组织,成功的可能性更大。

原理

①加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂

蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体,水分可以大量进入血细胞内,使血细胞胀裂,再加上搅拌的机械作用,就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂),从而释放出DNA。

②加入洗涤剂和食盐的作用

洗涤剂是一些离子去污剂,能溶解细胞膜,有利于DNA的释放;食盐的主要成分是NaCl,有利于DNA的溶解。

③研磨不充分,对实验结果产生的影响

研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全,提取的DNA量变少,影响实验结果,导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。

④此步骤获得的滤液中可能含有的细胞成分?

可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质。

实验步骤

1.破碎细胞,获取含DNA的滤液

动物细胞的破碎比较容易,以鸡血细胞为例,在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水,同时用玻璃棒搅拌,过滤后收集滤液即可。如果实验材料是植物细胞,需要先用洗涤剂溶解细胞膜。例如,提取洋

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葱的DNA时,在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐,进行充分的搅拌和研磨,过滤后收集研磨液。

2. 去除滤液中的杂质

方案一的原理是DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同;方案二的原理是蛋白酶分解蛋白质,不分解DNA;方案三的原理是蛋白质和DNA的变性温度不同。

注意事项

①用高盐浓度的溶液溶解DNA,能除去在高盐中不能溶解的杂质;用低盐浓度使DNA析出,能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此,通过反复溶解与析出DNA,就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。

②方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白,从而使提取的DNA与蛋白质分开;方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同,从而使蛋白质变性,与DNA分离。

DNA的析出与鉴定

将处理后的溶液过滤,加入与滤液体积相等、冷却的酒精溶液,静置2~3min,溶液中会出现白色丝状物,这就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌,卷起丝状物,并用滤纸吸取上面的水分。

取两支20ml的试管,各加入物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液5ml,将丝状物放入其中一支试管中,用玻璃棒搅拌,使丝状物溶解。然后,向两支试管中各加入4ml的二苯胺试剂。混合均匀后,将试管置于沸水中加热5min,待试管冷却后,比较两支试管溶液颜色的变化,看看溶解有DNA的溶液是否变蓝。

实验步骤

1.称取30克已切碎的洋葱,放入研钵中,加入少量石英砂助研,倒入10mL 2mol/L的氯化钠溶液,充分研磨。

洋葱含有挥发性刺激物,有效减少刺激,才能使实验顺利进行。上课前,教师可先将洋葱放入冰箱冷冻一会儿,使其凉透但又不能结冰;或将洋葱切成几大块,放入清水泡一会儿,让其挥发性刺激物溶于水,可以减轻刺激。然后将洋葱切碎备用。研磨的目的主要是使洋葱细胞破裂,使DNA溶于2mol/L的氯化钠溶液,没必要将洋葱研成粥糊状,后者既浪费时间又影响实验效果。研磨时,切忌使用搅拌器(榨汁机)。使用搅拌器虽可以提高研磨效率,但搅拌器将洋葱切成极细小的颗粒,无法通过过滤将洋葱颗粒剔除。只能将酒精直接倒入滤液中,许多洋葱小颗粒因为轻会漂浮起来,DNA藏在其中,无法分辨。学生看不到白色纤维状粘稠物的DNA。

2.研磨后,用漏斗和纱布将汁液过滤到小烧杯中,得到滤液。

3.向滤液中加入95%的酒精溶液20mL,沿烧杯壁缓缓倒入,不要震动或搅拌。

此时,烧杯中的液体分为上、下两层,下层较浑浊,上层澄清,很快上层溶液中就会有白色纤维状粘稠物析出,用玻璃棒可将其轻轻卷起。这就是记录生命遗传信息的重要物质——DNA。DNA析出的过程中,切忌震动和搅拌(不震动易于分层,我们就能很容易观察到上清液中的丝状物;搅拌会使非常柔软的DNA断裂成小段,不易取出)。如果用玻璃棒DNA不易卷起,可改用表面打毛的牙签,DNA提取物就缠绕在牙签上了。

4.鉴定:取两支试管,编为1、2号,各加入2mol/L的氯化钠溶液2mL,向1号试管中加入一些白色纤维状物,振荡使其溶解,然后向两支试管中各加入2mL二苯胺试剂,沸水浴加热5分钟。

注意事项

1.以血液为实验材料时,每100ml血液中需要加入3g柠檬酸钠防止血液凝固。

2.加入洗涤剂后,动作要轻缓、柔和,否则容易产生大量的泡沫,不利于后续步骤地操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时,动作要轻缓,以免DNA分子的断裂,导致DNA分子不能形成絮状沉淀。

3.二苯胺试剂要现配现用,否则会影响鉴定的效果。

4.DNA的溶解度与NaCl溶液浓度的关系:

当NaCl溶液浓度低于0.14mol/L时,随浓度的升高,DNA的溶解度降低;当NaCl溶液浓度高于0.14mol/L时,随浓度升高,DNA的溶解度升高。

5.盛放鸡血细胞液的容器,最好是塑料容器。

鸡血细胞破碎以后释放出的DNA,容易被玻璃容器吸附,由于细胞内DNA的含量本来就比较少,再被玻璃容器吸附去一部分,提取到的DNA就会更少。因此,实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管,这样可以减少提取过程的DNA的损失。


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