实验二细菌的接种、培养及代谢产物
（Bacterial Inoculetion and Artifical Culture and
Metaboic products）
一、细菌的人工培养（Artifical Culture of Bacteria） 在适当条件下，绝大多数细菌可用人工方法培养，使其繁殖，通过人工培养，获得纯种细菌，是进一步观察研究各种细菌具有不同特性的基础。
(一)常用培养基的制备
1、肉汤培养基：
是常用的液体培养基，也是制备某些其他培养基的基础。
材料：
（制备100ml肉汤培养基的用量）
(1)培养基的成分：
牛肉50g
蛋白脂1g
氯化钠0.5g
磷酸氢二钾(K2HP04·12H20)0.1g
蒸馏水100m1
(2)玻皿、试剂、比色管、比色架、吸管、1N与1／20N的NaOH、三角烧瓶、漏斗、中试管、酚红指示剂、滤纸、卷筒、天平、蒸馏水。
方法：
（1）将已去筋膜脂肪并经绞碎鲜牛肉50g，加蒸馏水100ml，放入冰箱中过夜。
（2）加热45—50℃一小时，并煮沸半小时，用数层纱布或滤纸过滤，滤液用蒸馏水补足其量为100m1。
（3）于滤液中加氯化钠0.5g，蛋白脂1g、磷酸氢二钾0.1g，加热使之完全溶化。
（4）测定酸碱度并调整至PH7.6，必要时用滤纸过滤。
（5）按需要分装于试管或烧瓶内，加棉花塞并包装后，置高压蒸汽灭菌器内经15磅／寸220—30分钟灭菌。
（6）灭菌后置37℃温箱，孵育24h，无杂菌生长，即可应用。或放冰箱备用。
2、普通琼脂培养基
它是最常用的固体培养基。
材料：肉汤、琼脂
方法：
(1)在肉汤中加入2％琼脂，熔化后调整PH7.6，必要时用棉花纱布过滤。
(2)于琼脂凝固前，分装于试管或小烧瓶内，然后加棉塞并包装。
(3)放入高压蒸汽灭菌器内，经15磅/寸220分钟灭菌。
(4)取出，将试管斜摆，琼脂凝固后即成普通琼脂斜面。将烧瓶内琼脂培养基在未凝固前以无菌操作注入无菌平皿内，凝固后即成普通琼脂平板，倾注时应严格要求无菌操作。琼脂的温度应在50℃左右为宜。如温度过高则平皿内凝水过多。易致污染：过低则琼脂凝固而致培养基表面不平滑。
(5)将琼脂斜面及平板放入37℃温箱内，孵育24h，若无菌生长，即可应用或放入冰箱保存备用。
3、半固体培养基
材料：肉汤、琼脂
方法：在肉汤中加入0.5％的琼脂，熔化后分装于小试管中，每管约2m1，加棉塞及包装。然后放入高压蒸汽灭菌器内，经15磅/寸230分钟灭菌。取出直立，待凝固后即成半固体培养基，放37℃温箱24小时，若无菌生长，即可应用，或放入冰箱保存备用。
4、血液琼脂培养基
有些细菌营养要求较高，在普通琼脂培养基上生长不良，可用血液琼脂培养基进行培养。
材料：普通琼脂培养基、血液。
方法：将制好的普通琼脂培养基加热熔化，待冷至50℃时以无菌操作加入5—10％脱纤维兔血或羊血，混匀，分注于灭菌试管或平皿中，制成血液琼脂斜面或血液琼脂平板，放37℃温箱24小时，若无菌生长，即可应用，或放入冰箱保存备用。
(二)细菌的接种方法
1、普通方法
(1)用灭菌接种环取细菌培养物少许。
(2)左手握斜面培养基下端，斜面向上，用右手小指和无名指拔出斜面培养基棉塞，管口经火焰灭菌，将沾有细菌的接种环伸入管内，自下而上在琼脂上蜿蜒划线。注意勿划破培养基。
(3)接种后，管口在火焰上灭菌，塞好棉塞，接种环灭菌。
2、液体培养基接种法
(1)用灭菌接种环取细菌培养物少许。
(2)以无菌操作将沾有细菌的接种环伸入肉汤管中，将环上细菌轻轻研磨于接近液面的管壁上，然后将试管稍倾斜，使细菌混于液体中即可。
3、半固体培养基接种法
左手持半固体培养基，右手持接种针，火焰灭菌冷却后，挑取细菌，垂直刺入半固体中心，至近管底部，然后沿穿刺线退出。塞回棉塞，接种针重新灭菌。接种完毕，于37℃培养18—24h，观察生长情况。
4、平板划线接种法
本法要求通过划线将标本中混杂的细菌在平板表面分散开，并在其生长繁殖形成菌落。以达到分离培养的目的。其操作方法是：
(1)右手将接种环按灭菌操作法沾取少许标本或培养物，左手拿平板略开盖，将标本涂于平板表面之一侧边缘，运用腕力作连续划线(但不要重叠，切勿划破琼脂)，约占平板面积1／4。
(2)先旋转平板约70—90度，将接种环火焰灭菌，冷却后通过第一次划线取2—3次。再作同样连续划线又占平板面积约1／4。
(3)重复上述操作，划完整个平板。
(4)将平板倒放于37℃温箱内，18—24h，观察各菌落情况。
(三)细菌的培养方法
欲使细菌生长繁殖，除了适宜的培养基外，尚需适当的温度，及一定的环境条件，例如有的细菌生长需要氧，有的则需要在无氧环境下才能生长，因此培养细菌时通常用以下几种方法：
需氧培养法：将已接种的试管或平板培养基置
37℃温箱中培养18-24h。
2、厌氧培养法：将细菌生长环境中的空气排出或用其它理化方法使细菌与氧隔离，造成无氧环境。（具体方法见后）
3、二氧化碳（CO2）培养法：使细菌生长环境保持有5-10%CO2，这样有助于某些细菌生长。（具体方法见后）
(四)细菌在培养基中的生长情况
在液体培养基的生长情况
⑴表面生长：液体清晰，细菌生长在液面形成菌膜。 ⑵混浊生长：液体均匀混浊，或有少量沉淀。
⑶沉淀生长：液体清晰，细菌生长在管底，形成沉淀。
在固体培养基上的生长情况
⑴在琼脂斜面上长成菌苔
⑵在平板上形成肉眼可见的细菌集团，即菌落。
观察菌落的大小、形状、边缘、表面、颜色、溶血等情况。
3、在半固体培养基上的生长情况：有鞭毛的细菌，由于能运动，在半固体培养基内沿穿刺线弥漫生长，原来的穿刺线不清。无鞭毛的细菌，因不能运动，接种后仍沿穿刺线生长，穿刺线与周围界限清楚。
二、细菌的代谢产物（MetabolicProductsofBateria） 细菌在新陈代谢过程中，除使自身得以生长繁殖外，往往还能产生一些代谢产物。一般细菌的代谢产物大致分为三类：一为可供鉴别细菌的代谢产物；二为与细菌致病性有关的代谢产物；三为可供治疗用的代谢产物。
（一）细菌的糖发酵试验
不同的细菌具有不同的糖酶以分解相应糖类，而且分解各种糖类后的终末产物也不一致，有的产酸，有的还产生气体，籍此可以作为鉴别细菌的一种依据，对肠道细菌鉴定尤为常用。
材料：
培养基：葡萄糖发酵管、乳糖发酵管；
大肠杆菌、伤寒杆菌。
方法：一种细菌接种一种糖发酵管后，再取该菌接种另一种糖发酵管（注意一支管只能接种一种菌）。接种后做好标记，集中放37℃孵育，次日观察结果。 结果：
在未接种细菌前，培养管应澄清、紫色、小倒立管内无气泡。接种细菌后观察结果时，应先确定细菌是否生长，生长时则培养基变混浊。若能发酵培养基中所含的糖而产酸，则该培养基变黄色，记录结果以“+”号表示之。如该菌发酵糖时产酸兼产气，则培养基除变黄色外，其中倒立之小玻璃管有气泡（见图3），此时以“⊕”号记录之。如不发酵时，培养基不变色，则用“-”号记录之。
结果举例
培养基种类
乳糖
细菌
大肠杆菌
伤寒杆菌 - + 糖 葡萄
记录你组的实验结果。
（二）靛基质产生试验
有些细菌能分解培养基中蛋白胨内的色氨酸形成靛基质（又称吲哚），靛基质为无色，不能直接观察，当加靛基质试剂（欧氏柯氏试剂）时，试剂中的对二甲基氨基苯甲醛与靛基质结合而成红色的玫瑰靛基质，则可为肉眼识别。
方法：
取大肠杆菌蛋白胨水培养物及伤寒杆菌蛋白胨水培养物各一管，沿管壁徐徐加入靛基质试剂（约0.3ml），如在试剂与培养物接触面之间有玫瑰红色出现者为阳性。
结果：
大肠杆菌靛基质试验阳性，而伤寒杆菌为阴性。
（三）甲基红试验
许多细菌如大肠杆菌等，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再被分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等。这样使培养基的pH降至4.5以下，这时加入甲基红试剂便呈红色。
甲基红为指示剂，变色范围为pH4.4（红色）—6.2（黄色）。若细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其它物质（如醇、醛、酮、气体和水等），则培养基的酸碱度仍在pH6.2以上，故加入甲基红指示剂呈黄色。红色为阳性反应，黄色为阴性反应。 材料：
葡萄糖蛋白胨水；
大肠杆菌、产气杆菌；
甲基红试剂、毛细吸管。
方法：分别接种大肠杆菌及产气杆菌于两支葡萄糖蛋白胨水中，置37℃孵育
18—24小时，滴加甲基红试剂数滴，立即观察结果。
（四）V—P（Voges-Proslauer）试验
某些细菌能分解葡萄糖，产生丙酮酸，再将丙酮酸脱羧变为中性的乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性环境下，被空气中的氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨水中的精氨酸所含的胍基起反应，生成红色的化合物，
即为V—P试验阳性。若培养基中胍基不多，可加入少量含胍基的化合物（如肌酸、肌酐等）以加速反应。
化学反应式
材料：
葡萄糖蛋白胨水；
大肠杆菌、产气杆菌；
李（Leifson）氏试剂。
方法：
将大肠杆菌、产气杆菌分别接种于2支葡萄糖蛋
白胨水。
2、37℃孵育48小时后，分别加入等量李氏（Leifson）试剂，摇匀后不加塞，静置30分钟观察结果，出现红色者为阳性反应。
（五）枸椽酸盐利用试验
在枸椽酸盐培养基中，枸椽酸钠为碳的唯一来源，磷酸二氢铵为氨的唯一来源。有的细菌如产气杆菌等，可利用枸椽酸盐作为碳源，能在此培养基上生长，并分解枸椽酸盐而最后产生碳酸，使培养基变碱性，这样培养基中的澳麝香草酚蓝指标由绿色变深蓝色，即为枸椽酸盐利用试验阳性。若细菌不能利用枸椽酸盐为碳源，在此培养基上就不生长，培养基则不变色，则为枸椽酸盐利用试验阴性。
材料：
枸椽酸盐培养基；
大肠杆菌、产气杆菌。
方法：
分别接种大肠杆菌、产气杆菌于2支枸椽酸盐培养基；37℃孵育24-48小时，观察结果，若有菌苔出现，培养基变为深蓝色则为阳性。
（六）硫化氢产生试验
某些细菌能分解培养基中胱氨酸等含硫氨基酸，生成硫化氢，硫化氢遇铅盐（或铁盐如硫酸亚铁）则形成黑褐色硫化铅或硫化亚铁的沉淀物。黑色沉淀愈多，表示生成的硫化氢量亦愈多。
材料：醋酸铅培养基。
菌种：大肠杆菌、变形杆菌琼脂斜面18—24小时培养物。
方法：
分别穿刺接种大肠杆菌、变形杆菌至两管醋酸铅培养基中，37℃孵育24小时后观察，穿刺线部位呈黑褐色者为阳性，不变色者为阴性。
（七）细菌菌落的色素及溶血现象观察
有些细菌能产生色素，有些细菌能产生溶血素，当接种于普通平板或血平板培养基上可形成有色菌落或在
菌落周围形成溶血环。菌落的色素和溶血环可作为鉴别某些细菌的根据。
1、观察金黄色葡萄球菌在普通平板上产生的色素。该色素只局限于菌落，属脂溶性色素。
2、观察绿脓杆菌在普通斜面上产生的色素。该色素可扩散至菌苔周围的培养基中，属水溶性色素。
3、观察金黄色葡萄球菌在血平板上出现的溶血环。
附录
一、胨水培养基
取蛋白胨1克，氯化钠0.5克，溶于蒸馏水100ml中；调整酸碱度至pH7.6，分装小试管，高压蒸汽15磅灭菌20分钟。
二、单糖发酵管培养基
在100 ml蛋白胨水中加入1.6%溴甲酚紫酒精液指示剂0.1ml及各种单糖0.5-1克，溶解后分装试管，内置一玻璃小倒管。每试管约2-3ml培养基（以使小倒管完全浸没为度），高压蒸汽8磅灭菌20分钟。取出后，
在各种糖管上分别以不同颜色作标记，以资区别。如红色代表葡萄糖，黄色代表乳糖，蓝色代表麦芽糖，白色代表甘露醇，黑色代表蔗糖等。
三、葡萄糖蛋白胨水培养基
取葡萄糖0.5克，蛋白胨0.5克，磷酸氢二钾0.5克溶于100ml蒸馏水中，矫正pH至7.2，高压灭菌后备用。
四、醋酸铅培养基
将制好的普通琼脂培养基100ml，加热溶化，冷至60℃，加入备好的无菌硫代硫酸钠及醋酸铅水溶液（硫代硫酸钠及醋酸各0.25克，分别用1ml水溶化，高压蒸汽灭菌）。摇匀后，无菌分装于小试管，每管约1.5ml。经37℃孵育24小时，无菌者可应用。
五、枸椽酸盐琼脂培养基
取枸椽酸钠0.23克，磷酸二氢铵0.1克，硫酸镁0.02克，磷酸氢二钾0.1克，氯化钠0.5克，琼脂2克，蒸馏水100ml加热熔化，矫正pH为6.8，加入0.5%溴麝香草酚蓝酒精溶液2ml，混匀，分装试管，高压灭菌。灭菌后趁热取出置成斜面。
六、靛基质试剂（Ehrlich氏试剂）
取对二甲基氨基苯甲醛2克，溶于95%酒精190ml中，再加入浓盐酸40ml混匀。
七、甲基红试剂
取甲基红0.02克，95%酒精60ml，混合溶解后加入蒸馏水至100ml。
八、李（Leifson）氏试剂
取硫酸铜溶于10ml蒸馏水中，然后加入浓氨水40ml，混匀，再加入10%NaOH溶液至1000ml。
实验二细菌的接种、培养及代谢产物
（Bacterial Inoculetion and Artifical Culture and
Metaboic products）
一、细菌的人工培养（Artifical Culture of Bacteria） 在适当条件下，绝大多数细菌可用人工方法培养，使其繁殖，通过人工培养，获得纯种细菌，是进一步观察研究各种细菌具有不同特性的基础。
(一)常用培养基的制备
1、肉汤培养基：
是常用的液体培养基，也是制备某些其他培养基的基础。
材料：
（制备100ml肉汤培养基的用量）
(1)培养基的成分：
牛肉50g
蛋白脂1g
氯化钠0.5g
磷酸氢二钾(K2HP04·12H20)0.1g
蒸馏水100m1
(2)玻皿、试剂、比色管、比色架、吸管、1N与1／20N的NaOH、三角烧瓶、漏斗、中试管、酚红指示剂、滤纸、卷筒、天平、蒸馏水。
方法：
（1）将已去筋膜脂肪并经绞碎鲜牛肉50g，加蒸馏水100ml，放入冰箱中过夜。
（2）加热45—50℃一小时，并煮沸半小时，用数层纱布或滤纸过滤，滤液用蒸馏水补足其量为100m1。
（3）于滤液中加氯化钠0.5g，蛋白脂1g、磷酸氢二钾0.1g，加热使之完全溶化。
（4）测定酸碱度并调整至PH7.6，必要时用滤纸过滤。
（5）按需要分装于试管或烧瓶内，加棉花塞并包装后，置高压蒸汽灭菌器内经15磅／寸220—30分钟灭菌。
（6）灭菌后置37℃温箱，孵育24h，无杂菌生长，即可应用。或放冰箱备用。
2、普通琼脂培养基
它是最常用的固体培养基。
材料：肉汤、琼脂
方法：
(1)在肉汤中加入2％琼脂，熔化后调整PH7.6，必要时用棉花纱布过滤。
(2)于琼脂凝固前，分装于试管或小烧瓶内，然后加棉塞并包装。
(3)放入高压蒸汽灭菌器内，经15磅/寸220分钟灭菌。
(4)取出，将试管斜摆，琼脂凝固后即成普通琼脂斜面。将烧瓶内琼脂培养基在未凝固前以无菌操作注入无菌平皿内，凝固后即成普通琼脂平板，倾注时应严格要求无菌操作。琼脂的温度应在50℃左右为宜。如温度过高则平皿内凝水过多。易致污染：过低则琼脂凝固而致培养基表面不平滑。
(5)将琼脂斜面及平板放入37℃温箱内，孵育24h，若无菌生长，即可应用或放入冰箱保存备用。
3、半固体培养基
材料：肉汤、琼脂
方法：在肉汤中加入0.5％的琼脂，熔化后分装于小试管中，每管约2m1，加棉塞及包装。然后放入高压蒸汽灭菌器内，经15磅/寸230分钟灭菌。取出直立，待凝固后即成半固体培养基，放37℃温箱24小时，若无菌生长，即可应用，或放入冰箱保存备用。
4、血液琼脂培养基
有些细菌营养要求较高，在普通琼脂培养基上生长不良，可用血液琼脂培养基进行培养。
材料：普通琼脂培养基、血液。
方法：将制好的普通琼脂培养基加热熔化，待冷至50℃时以无菌操作加入5—10％脱纤维兔血或羊血，混匀，分注于灭菌试管或平皿中，制成血液琼脂斜面或血液琼脂平板，放37℃温箱24小时，若无菌生长，即可应用，或放入冰箱保存备用。
(二)细菌的接种方法
1、普通方法
(1)用灭菌接种环取细菌培养物少许。
(2)左手握斜面培养基下端，斜面向上，用右手小指和无名指拔出斜面培养基棉塞，管口经火焰灭菌，将沾有细菌的接种环伸入管内，自下而上在琼脂上蜿蜒划线。注意勿划破培养基。
(3)接种后，管口在火焰上灭菌，塞好棉塞，接种环灭菌。
2、液体培养基接种法
(1)用灭菌接种环取细菌培养物少许。
(2)以无菌操作将沾有细菌的接种环伸入肉汤管中，将环上细菌轻轻研磨于接近液面的管壁上，然后将试管稍倾斜，使细菌混于液体中即可。
3、半固体培养基接种法
左手持半固体培养基，右手持接种针，火焰灭菌冷却后，挑取细菌，垂直刺入半固体中心，至近管底部，然后沿穿刺线退出。塞回棉塞，接种针重新灭菌。接种完毕，于37℃培养18—24h，观察生长情况。
4、平板划线接种法
本法要求通过划线将标本中混杂的细菌在平板表面分散开，并在其生长繁殖形成菌落。以达到分离培养的目的。其操作方法是：
(1)右手将接种环按灭菌操作法沾取少许标本或培养物，左手拿平板略开盖，将标本涂于平板表面之一侧边缘，运用腕力作连续划线(但不要重叠，切勿划破琼脂)，约占平板面积1／4。
(2)先旋转平板约70—90度，将接种环火焰灭菌，冷却后通过第一次划线取2—3次。再作同样连续划线又占平板面积约1／4。
(3)重复上述操作，划完整个平板。
(4)将平板倒放于37℃温箱内，18—24h，观察各菌落情况。
(三)细菌的培养方法
欲使细菌生长繁殖，除了适宜的培养基外，尚需适当的温度，及一定的环境条件，例如有的细菌生长需要氧，有的则需要在无氧环境下才能生长，因此培养细菌时通常用以下几种方法：
需氧培养法：将已接种的试管或平板培养基置
37℃温箱中培养18-24h。
2、厌氧培养法：将细菌生长环境中的空气排出或用其它理化方法使细菌与氧隔离，造成无氧环境。（具体方法见后）
3、二氧化碳（CO2）培养法：使细菌生长环境保持有5-10%CO2，这样有助于某些细菌生长。（具体方法见后）
(四)细菌在培养基中的生长情况
在液体培养基的生长情况
⑴表面生长：液体清晰，细菌生长在液面形成菌膜。 ⑵混浊生长：液体均匀混浊，或有少量沉淀。
⑶沉淀生长：液体清晰，细菌生长在管底，形成沉淀。
在固体培养基上的生长情况
⑴在琼脂斜面上长成菌苔
⑵在平板上形成肉眼可见的细菌集团，即菌落。
观察菌落的大小、形状、边缘、表面、颜色、溶血等情况。
3、在半固体培养基上的生长情况：有鞭毛的细菌，由于能运动，在半固体培养基内沿穿刺线弥漫生长，原来的穿刺线不清。无鞭毛的细菌，因不能运动，接种后仍沿穿刺线生长，穿刺线与周围界限清楚。
二、细菌的代谢产物（MetabolicProductsofBateria） 细菌在新陈代谢过程中，除使自身得以生长繁殖外，往往还能产生一些代谢产物。一般细菌的代谢产物大致分为三类：一为可供鉴别细菌的代谢产物；二为与细菌致病性有关的代谢产物；三为可供治疗用的代谢产物。
（一）细菌的糖发酵试验
不同的细菌具有不同的糖酶以分解相应糖类，而且分解各种糖类后的终末产物也不一致，有的产酸，有的还产生气体，籍此可以作为鉴别细菌的一种依据，对肠道细菌鉴定尤为常用。
材料：
培养基：葡萄糖发酵管、乳糖发酵管；
大肠杆菌、伤寒杆菌。
方法：一种细菌接种一种糖发酵管后，再取该菌接种另一种糖发酵管（注意一支管只能接种一种菌）。接种后做好标记，集中放37℃孵育，次日观察结果。 结果：
在未接种细菌前，培养管应澄清、紫色、小倒立管内无气泡。接种细菌后观察结果时，应先确定细菌是否生长，生长时则培养基变混浊。若能发酵培养基中所含的糖而产酸，则该培养基变黄色，记录结果以“+”号表示之。如该菌发酵糖时产酸兼产气，则培养基除变黄色外，其中倒立之小玻璃管有气泡（见图3），此时以“⊕”号记录之。如不发酵时，培养基不变色，则用“-”号记录之。
结果举例
培养基种类
乳糖
细菌
大肠杆菌
伤寒杆菌 - + 糖 葡萄
记录你组的实验结果。
（二）靛基质产生试验
有些细菌能分解培养基中蛋白胨内的色氨酸形成靛基质（又称吲哚），靛基质为无色，不能直接观察，当加靛基质试剂（欧氏柯氏试剂）时，试剂中的对二甲基氨基苯甲醛与靛基质结合而成红色的玫瑰靛基质，则可为肉眼识别。
方法：
取大肠杆菌蛋白胨水培养物及伤寒杆菌蛋白胨水培养物各一管，沿管壁徐徐加入靛基质试剂（约0.3ml），如在试剂与培养物接触面之间有玫瑰红色出现者为阳性。
结果：
大肠杆菌靛基质试验阳性，而伤寒杆菌为阴性。
（三）甲基红试验
许多细菌如大肠杆菌等，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再被分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等。这样使培养基的pH降至4.5以下，这时加入甲基红试剂便呈红色。
甲基红为指示剂，变色范围为pH4.4（红色）—6.2（黄色）。若细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其它物质（如醇、醛、酮、气体和水等），则培养基的酸碱度仍在pH6.2以上，故加入甲基红指示剂呈黄色。红色为阳性反应，黄色为阴性反应。 材料：
葡萄糖蛋白胨水；
大肠杆菌、产气杆菌；
甲基红试剂、毛细吸管。
方法：分别接种大肠杆菌及产气杆菌于两支葡萄糖蛋白胨水中，置37℃孵育
18—24小时，滴加甲基红试剂数滴，立即观察结果。
（四）V—P（Voges-Proslauer）试验
某些细菌能分解葡萄糖，产生丙酮酸，再将丙酮酸脱羧变为中性的乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性环境下，被空气中的氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨水中的精氨酸所含的胍基起反应，生成红色的化合物，
即为V—P试验阳性。若培养基中胍基不多，可加入少量含胍基的化合物（如肌酸、肌酐等）以加速反应。
化学反应式
材料：
葡萄糖蛋白胨水；
大肠杆菌、产气杆菌；
李（Leifson）氏试剂。
方法：
将大肠杆菌、产气杆菌分别接种于2支葡萄糖蛋
白胨水。
2、37℃孵育48小时后，分别加入等量李氏（Leifson）试剂，摇匀后不加塞，静置30分钟观察结果，出现红色者为阳性反应。
（五）枸椽酸盐利用试验
在枸椽酸盐培养基中，枸椽酸钠为碳的唯一来源，磷酸二氢铵为氨的唯一来源。有的细菌如产气杆菌等，可利用枸椽酸盐作为碳源，能在此培养基上生长，并分解枸椽酸盐而最后产生碳酸，使培养基变碱性，这样培养基中的澳麝香草酚蓝指标由绿色变深蓝色，即为枸椽酸盐利用试验阳性。若细菌不能利用枸椽酸盐为碳源，在此培养基上就不生长，培养基则不变色，则为枸椽酸盐利用试验阴性。
材料：
枸椽酸盐培养基；
大肠杆菌、产气杆菌。
方法：
分别接种大肠杆菌、产气杆菌于2支枸椽酸盐培养基；37℃孵育24-48小时，观察结果，若有菌苔出现，培养基变为深蓝色则为阳性。
（六）硫化氢产生试验
某些细菌能分解培养基中胱氨酸等含硫氨基酸，生成硫化氢，硫化氢遇铅盐（或铁盐如硫酸亚铁）则形成黑褐色硫化铅或硫化亚铁的沉淀物。黑色沉淀愈多，表示生成的硫化氢量亦愈多。
材料：醋酸铅培养基。
菌种：大肠杆菌、变形杆菌琼脂斜面18—24小时培养物。
方法：
分别穿刺接种大肠杆菌、变形杆菌至两管醋酸铅培养基中，37℃孵育24小时后观察，穿刺线部位呈黑褐色者为阳性，不变色者为阴性。
（七）细菌菌落的色素及溶血现象观察
有些细菌能产生色素，有些细菌能产生溶血素，当接种于普通平板或血平板培养基上可形成有色菌落或在
菌落周围形成溶血环。菌落的色素和溶血环可作为鉴别某些细菌的根据。
1、观察金黄色葡萄球菌在普通平板上产生的色素。该色素只局限于菌落，属脂溶性色素。
2、观察绿脓杆菌在普通斜面上产生的色素。该色素可扩散至菌苔周围的培养基中，属水溶性色素。
3、观察金黄色葡萄球菌在血平板上出现的溶血环。
附录
一、胨水培养基
取蛋白胨1克，氯化钠0.5克，溶于蒸馏水100ml中；调整酸碱度至pH7.6，分装小试管，高压蒸汽15磅灭菌20分钟。
二、单糖发酵管培养基
在100 ml蛋白胨水中加入1.6%溴甲酚紫酒精液指示剂0.1ml及各种单糖0.5-1克，溶解后分装试管，内置一玻璃小倒管。每试管约2-3ml培养基（以使小倒管完全浸没为度），高压蒸汽8磅灭菌20分钟。取出后，
在各种糖管上分别以不同颜色作标记，以资区别。如红色代表葡萄糖，黄色代表乳糖，蓝色代表麦芽糖，白色代表甘露醇，黑色代表蔗糖等。
三、葡萄糖蛋白胨水培养基
取葡萄糖0.5克，蛋白胨0.5克，磷酸氢二钾0.5克溶于100ml蒸馏水中，矫正pH至7.2，高压灭菌后备用。
四、醋酸铅培养基
将制好的普通琼脂培养基100ml，加热溶化，冷至60℃，加入备好的无菌硫代硫酸钠及醋酸铅水溶液（硫代硫酸钠及醋酸各0.25克，分别用1ml水溶化，高压蒸汽灭菌）。摇匀后，无菌分装于小试管，每管约1.5ml。经37℃孵育24小时，无菌者可应用。
五、枸椽酸盐琼脂培养基
取枸椽酸钠0.23克，磷酸二氢铵0.1克，硫酸镁0.02克，磷酸氢二钾0.1克，氯化钠0.5克，琼脂2克，蒸馏水100ml加热熔化，矫正pH为6.8，加入0.5%溴麝香草酚蓝酒精溶液2ml，混匀，分装试管，高压灭菌。灭菌后趁热取出置成斜面。
六、靛基质试剂（Ehrlich氏试剂）
取对二甲基氨基苯甲醛2克，溶于95%酒精190ml中，再加入浓盐酸40ml混匀。
七、甲基红试剂
取甲基红0.02克，95%酒精60ml，混合溶解后加入蒸馏水至100ml。
八、李（Leifson）氏试剂
取硫酸铜溶于10ml蒸馏水中，然后加入浓氨水40ml，混匀，再加入10%NaOH溶液至1000ml。