一、亚硫酸氢钠修饰过程中可能出现的问题及应对措施
亚硫酸氢钠修饰DNA 的目的是将DNA 序列中未甲基化的胞嘧啶完全转化为尿嘧啶，而甲基化的5一甲基胞嘧啶保持不变。影响此过程的主要因素有修饰试剂的浓度、反应温度、反应环境的pH 值及反应时间。其中任何一个环节出现问题都将导致MSP 扩增失败，体会如下：
(1)亚硫酸氢钠的浓度最好控制在3．0～3．9 mol/L为好，其pH 值必须用NaOH 精确调整至5．0；
(2)修饰时间应掌握在10～16 h ，修饰时间过长会导致甲基化胞嘧啶也会转化成尿嘧啶且DNA 模板破坏加剧，而时间过短会导致修饰不彻底；
(3)反应温度应控制在50～55℃(若用国产恒温水浴箱建议温度设定在53℃为好) ；
(4)DNA模板量应控制在
只要遵循以上几点基本上能保证99％ 未甲基化的胞嘧啶转化尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。但是，此修饰过程中模板DNA 有约96％已经降解 。当DNA 样品较少时(如石蜡包埋组织、血清DNA) ，在纯化回收时可加人适量鲑鱼精DNA 或糖原(约1 g)作为载体，有利于DNA 沉淀(加入载体后轻轻晃动Ependof 管可见絮状DNA 富集现象) 。
二、甲基化特异PCR 可能出现的问题与对策
1．引物因素分析MSP 的引物设计的质量是扩增成败的关键性因素。
MSP 的引物设计与普通的PCR 引物设计不同，MSP 的引物设计原理是：模板DNA 在经过亚硫酸盐处理后，发生甲基化的基因启动子区域CpG 岛内CpG 位
点5 一端胞嘧啶保持不变；而未发生甲基化的CpG 岛内CpG 位点5 一端胞嘧啶转化为尿嘧啶，即C —U 。针对修饰前后的序列差异用MethPrimer 软件设计甲基化与未甲基引物，进行PCR 扩增。MSP 的引物序列中至少含有1个以上CpG 位点，最好是含有多个CpG 位点，这样可保证引物的特异性，同时可以提高DNA 启动子甲基化碱基的检出率。
二、MSP 的引物必须按亚硫酸氢钠处理后的DNA 序列设计，同时也应该尽可能与
普通PCR 的引物设计原则相符合。按MSP 的要求，任意DNA 序列在做MSP 扩增时，至少要合成2对引物，即甲基化引物与未甲基化引物。在MSP 的未甲基化引物序列中前导引物不含鸟嘌呤碱基，反向引物不含胞嘧啶碱基。初涉及MSP 者最好用文献引物进行研究。如果是为了筛选新的甲基化的抑癌基因而文献中无法找到的相应MSP 引物，可用在线MethPrimer 软件在线设计引物，网址为http ：／／www ．urogene ．org ／methprimer ／index1．html 。根据软件提示可以找到所需要的MSP 引物。但MSP 所遇到的困难是，要扩增的是启动子或部分第一外显子序列，其CG 含量相对较高，MSP 扩增难度加大，因此设计好的引物最好用引物软件如Primer5．0从理论上推测其扩增效率，对于扩增效率
2．MSP 的反应体系问题MSP 的反应体系的成分与普通PCR 一样，反应体系的优化也与普通类似，反应体系的优化与普通PCR 的反应体系中最大的区别是DNA 模板不同。经过修饰后的模板为单链状态，MSP 的DNA 模板在抽提后应检测其纯度和含量，其纯度要求A260／A280在1．8～2．0之间；其含量要准确检测，否则在亚硫酸盐处理时因DNA 模板加的太多而导致DNA 处理不完全而导致MSP 扩增失败；而加的DNA 模板太少则一方面浪费试剂，另一方面会因为目的片段太少导致MSP 假阴性。Mg“浓度一般在2．0～2．5 mmoL ／L 为宜，过低过高都不利于扩增。此外，PCR 的缓冲液及Taq 酶的来源也很重要，一般的PCR 缓冲液常常会导致结果不稳定，不同来源的Taq 酶也会影响结果的重复性。我们建议用Taka —ra 公司针对富含CG 等复杂二级结构
模板的TaKaRa IATaq with GC Buffer效果较好。而一旦选用某一厂家Taq 酶后，不要轻易更换，以免MSP 因重新优化而引起的时间和成本的浪费。
3．MSP 的反应温度分析MSP 扩增的结果有3种情况：(1)产物电泳为阴性；
(2)产物电泳出现多条非特异性条带(含目的基因条带) ；(3)产物电泳为阳性(仅目的基因条带) 。出现前2种情况时，可在保证反应体系和引物没有问题的情况下，通过调整MSP 的反应温度而得到目的基因带。方法如下：PCR 反应中，Tm 的高低与CG 含量呈正相关。因甲基化与未甲基化引物序列差异，在扩增过程中可能会出现PCR 偏性。我们建议，提高预变性温度(一般应>95。C ，10 rain)和变性温度(>95℃ ，1 min)，退火温度以60℃作梯度或70℃作降落PCR 。
总之，在MSP 全过程中，影响结果的因素较普通PCR 要多得多，只要对实验过程每一步认真控制可完全提高MSP 的准确度和精密度。
一、亚硫酸氢钠修饰过程中可能出现的问题及应对措施
亚硫酸氢钠修饰DNA 的目的是将DNA 序列中未甲基化的胞嘧啶完全转化为尿嘧啶，而甲基化的5一甲基胞嘧啶保持不变。影响此过程的主要因素有修饰试剂的浓度、反应温度、反应环境的pH 值及反应时间。其中任何一个环节出现问题都将导致MSP 扩增失败，体会如下：
(1)亚硫酸氢钠的浓度最好控制在3．0～3．9 mol/L为好，其pH 值必须用NaOH 精确调整至5．0；
(2)修饰时间应掌握在10～16 h ，修饰时间过长会导致甲基化胞嘧啶也会转化成尿嘧啶且DNA 模板破坏加剧，而时间过短会导致修饰不彻底；
(3)反应温度应控制在50～55℃(若用国产恒温水浴箱建议温度设定在53℃为好) ；
(4)DNA模板量应控制在
只要遵循以上几点基本上能保证99％ 未甲基化的胞嘧啶转化尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。但是，此修饰过程中模板DNA 有约96％已经降解 。当DNA 样品较少时(如石蜡包埋组织、血清DNA) ，在纯化回收时可加人适量鲑鱼精DNA 或糖原(约1 g)作为载体，有利于DNA 沉淀(加入载体后轻轻晃动Ependof 管可见絮状DNA 富集现象) 。
二、甲基化特异PCR 可能出现的问题与对策
1．引物因素分析MSP 的引物设计的质量是扩增成败的关键性因素。
MSP 的引物设计与普通的PCR 引物设计不同，MSP 的引物设计原理是：模板DNA 在经过亚硫酸盐处理后，发生甲基化的基因启动子区域CpG 岛内CpG 位
点5 一端胞嘧啶保持不变；而未发生甲基化的CpG 岛内CpG 位点5 一端胞嘧啶转化为尿嘧啶，即C —U 。针对修饰前后的序列差异用MethPrimer 软件设计甲基化与未甲基引物，进行PCR 扩增。MSP 的引物序列中至少含有1个以上CpG 位点，最好是含有多个CpG 位点，这样可保证引物的特异性，同时可以提高DNA 启动子甲基化碱基的检出率。
二、MSP 的引物必须按亚硫酸氢钠处理后的DNA 序列设计，同时也应该尽可能与
普通PCR 的引物设计原则相符合。按MSP 的要求，任意DNA 序列在做MSP 扩增时，至少要合成2对引物，即甲基化引物与未甲基化引物。在MSP 的未甲基化引物序列中前导引物不含鸟嘌呤碱基，反向引物不含胞嘧啶碱基。初涉及MSP 者最好用文献引物进行研究。如果是为了筛选新的甲基化的抑癌基因而文献中无法找到的相应MSP 引物，可用在线MethPrimer 软件在线设计引物，网址为http ：／／www ．urogene ．org ／methprimer ／index1．html 。根据软件提示可以找到所需要的MSP 引物。但MSP 所遇到的困难是，要扩增的是启动子或部分第一外显子序列，其CG 含量相对较高，MSP 扩增难度加大，因此设计好的引物最好用引物软件如Primer5．0从理论上推测其扩增效率，对于扩增效率
2．MSP 的反应体系问题MSP 的反应体系的成分与普通PCR 一样，反应体系的优化也与普通类似，反应体系的优化与普通PCR 的反应体系中最大的区别是DNA 模板不同。经过修饰后的模板为单链状态，MSP 的DNA 模板在抽提后应检测其纯度和含量，其纯度要求A260／A280在1．8～2．0之间；其含量要准确检测，否则在亚硫酸盐处理时因DNA 模板加的太多而导致DNA 处理不完全而导致MSP 扩增失败；而加的DNA 模板太少则一方面浪费试剂，另一方面会因为目的片段太少导致MSP 假阴性。Mg“浓度一般在2．0～2．5 mmoL ／L 为宜，过低过高都不利于扩增。此外，PCR 的缓冲液及Taq 酶的来源也很重要，一般的PCR 缓冲液常常会导致结果不稳定，不同来源的Taq 酶也会影响结果的重复性。我们建议用Taka —ra 公司针对富含CG 等复杂二级结构
模板的TaKaRa IATaq with GC Buffer效果较好。而一旦选用某一厂家Taq 酶后，不要轻易更换，以免MSP 因重新优化而引起的时间和成本的浪费。
3．MSP 的反应温度分析MSP 扩增的结果有3种情况：(1)产物电泳为阴性；
(2)产物电泳出现多条非特异性条带(含目的基因条带) ；(3)产物电泳为阳性(仅目的基因条带) 。出现前2种情况时，可在保证反应体系和引物没有问题的情况下，通过调整MSP 的反应温度而得到目的基因带。方法如下：PCR 反应中，Tm 的高低与CG 含量呈正相关。因甲基化与未甲基化引物序列差异，在扩增过程中可能会出现PCR 偏性。我们建议，提高预变性温度(一般应>95。C ，10 rain)和变性温度(>95℃ ，1 min)，退火温度以60℃作梯度或70℃作降落PCR 。
总之，在MSP 全过程中，影响结果的因素较普通PCR 要多得多，只要对实验过程每一步认真控制可完全提高MSP 的准确度和精密度。