成都理工大学
硕士学位论文
穿心莲内酯的提取及纯化工艺研究
姓名：徐靓
申请学位级别：硕士
专业：分析化学
指导教师：安莲英
20070501
穿心莲内酯的提取及纯化工艺研究
作者简介：徐靓，女，１９８１年９月出生，２００４年９月师从于成都理工大学安莲英教授，于２００７年６月获硕士学位。
摘要
穿心莲为解毒消炎类临床常用药。大量的药理研究发现，穿心莲中的脂溶性成分穿心莲内酯不仅具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗癌、抗心血管疾病。
本论文以酶解前处理超声提取法作为穿心莲内酯的提取方法，以大孔树脂纯化法作为穿心莲提取液的纯化方法，以穿心莲内酯的提取率以及纯度为评价指标，具体的工艺条件与试验结论如下：
影响穿心莲内酯提取率的因素大小顺序为：乙醇浓度＞提取温度＞料液比＞提取时间。超声提取较优的工艺条件为：当温度为５０℃，每５０９穿心莲加入１３００Ｕ的纤维素酶，控制酶解环境ｐＨ＝４左右，酶解１００ｍｉｎ，酶解溶液滤过以后，往滤渣中加入浓度为７５％，体积为原料１０倍的乙醇超声提取２０ｒａｉｎ。未加酶解的超声提取的穿心莲内酯的提取率为７９．８４％，出膏率为７．４３％，酶解超声提取的穿心莲内酯的提取率达到９８．０９％，出膏率为８．９１％，与酶解前相比，内酯提取率有明显的提高，而出膏率并没有明显的增加，即药材中的水溶型杂质基本没有被提取出来，对后续的纯化工艺没有大的影响。
采用ＤＡ２０１－Ｂ型大孔树脂为纯化穿心莲内酯的最佳树脂，通过树脂动态吸附实验考察了吸附流速、解吸流速、上柱液ｐＨ、洗脱液浓度等因素对吸附效果的影响，最终确定最佳的吸附工艺条件为：吸附流速为１ＢＶ／ｈ，上柱液不调节ｐＨ，在最佳吸附工艺条件下，树脂对穿心莲提取液的处理量大约达到树脂体积的２ｌ倍，２２ＢＶ流出液内酯泄漏率达到９．７７％，所以从２２ＢＶ开始停止对上柱液进行吸附，此时树脂有效吸附量为１３．４２ｍｇ／ｍ１４树％，内酯得率为９０．２５％。最佳解吸工艺条件为：６０％ｐＨ＝５的乙醇，解吸流速为３ＢＶ／ｈ，解吸率为８４．９５％。提取液的干膏收率由纯化前的８．９１％降低到３％，而穿心莲内酯的纯度由纯化前２４．９８％提高到了６５％，本纯化工艺的内酯保留率为８５％以上。
本论文对穿心莲内酯的提取纯化工艺进行了相关研究，获取了相对以往方法提高提取率、缩短提取时间、提高内酯纯度的工艺路线，为穿心莲内酯进一步开发利用以及尽量减少临床使用不良反应提供了有益的参考。
关键词：穿心莲内酯超声波纤维素酶大孔树脂
ＴｈｅＥｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＡｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ
Ｐａｎｉｃｕｌｔａ
ＡＢＳＴＲＡＣＴ
ＡｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓＰａｎｉｅｕｌｔａｉｓｔｈｅｎｏｒｍａｌＣｈｉｎｅｓｅｈｅｒｂａｌｍｅｄｉｃｉｎｅｎｑｕａｎｔｉｔｉｅｓｏ：ｍｅｄｉｃａｌｒｅｓｅａｒｃｈｅｓｓｈｏｗｔｈａｔＡｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓＰａｎｉｃｕｌｔａｌａｃｔｏｎｅ，ｔｈｅｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｉｚＡｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓＰａｎｉｃｕｌｔａｈａｓｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ｂａｃｔｅｒｉａｌ，ｖｉｒｕｓ，ａｎ（ｄｉｓｅａｓｅｓｏｆＣａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｔ．
Ｔｈｉｓｔｈｅｓｉｓｔａｋｅｓｅｔｈｙｌａｌｃｏｈｏｌ
ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｏｌｉｄｅａｓａｓｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｓｏｌｖｅｎｔａｎｄｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｒａｔｉｏｏ：ａｓｓｅｓｓｉｎｇｓｔａｎｄａｒｄ，ｔｈｕｓｔｈｅｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｌｙｇｏｏｄｃｒａｆｔｃｏｎｄｉｔｉｏｉｓｈｏｕｌｄｂｅ：ｗｈｅｎｔｈｅｔｅｍｐｒｅｒａｔｕｒｅｉｓ５０。Ｃ，ｐＨ＝４，ａｄｄ１３００ＵＣｅｌｌｕｌａｓｅｉｎｔｏｅｖｅｒｙ５０｛ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓＰａｎｉｃｕｌｔａ，ａｎｄｇｅｔｐｒｏｃｅｓｓｅｄｆｏｒ１００ｍｉｎｕｔｅ；ｔｈｅｎａｄｄｅｔｈｙａｌｃｏｈｏｌ（７５％），１０ｔｉｍｅｓｖｏｌｕｍｏｆｔｈｅｒａｗｓｔｕｆｆ；ｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｒａｔｉｏｏｆａｎｄｒｏｇｒａｐｈｏｌｉｄ‘ａｔｔａｉｎｓ９８％，ｔｈｅｙｉｅｌｄｗｉｔｈｏｕｔｃｅｌｌｕｌａｓｅｉｓ７．４３％，ａｎｄｔｈｅｙｉｅｌｄｏｆ
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Ｐａｎｉｃｕｌｔａ１ａｃｔｏｎｅ．ｏｆａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ
ＫｅｙｗｏｒｄｓＡｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓｕｌｔｒａｓｏｎｉｃＣｅｌｌｕｌａｓｅｒｅｓｉｎⅡＩ
独创性声明
本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得盛叠理王太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。
学位论文作者导师签名：农啄学位论文作者签名：纨｛弛
。啊年ｆ月乃／日
学位论文版权使用授权书
本学位论文作者完全了解盛签理王太堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权盛壑堡王太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。
（保密的学位论文在解密后适用本授权书）
学位论文作者签名：徐舌ｊＬｌ
叼年ｙ月哆日
独创性声明
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叼年ｙ月哆日
第１章引言
第１章引
１．１研究意义言
穿心莲原产于菲律宾、印度、斯里兰卡、泰国等热带地区，２０世纪５０年代由华侨引入我国广东、福建栽培，后北移至陕西、北京、四川等地。穿心莲为ｌ临床用药，是抗病毒的首选药物之一。穿心莲以全草人药，有清热解毒、消炎、消肿止痛等功效，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗癌、抗心血管疾病等作用“’根据国内外最新研究，穿心莲内酯的衍生物因其对“类激素”与“类蛋白转换酶”的有效抑制性极有希望开发成为一种高效抗艾滋病的天然药物。１。２００５年，由于严重的临床使用不良反映，历来占据消炎抗菌类中药制剂最大市场的鱼腥草中药制剂被国家禁止使用，使得穿心莲类制剂的市场大大拓宽，需求也非常旺盛，但是另外一方面，通过对国内外穿心莲提取、纯化以及临床使用反应的研究，我们发现，穿心莲的研究也存在着诸如提取时间长、提取率比较低；对有效成分的应用还基本停留在粗提物的阶段，纯化效率比较低；对药材原材料使用率低以及临床使用上也发现了一些不良反应等问题。
针对传统的有机溶剂浸渍提取方法的提取率低、提取时间长的缺点，目前中药成分提取研究中广泛应用的超声波提取和酶解前处理提取都可以应用于穿心莲内酯的提取研究中以期提高内酯的提取率、缩短提取时间。超声波法主要通过超声波粉碎药材的细胞壁，加速了化合物在溶液中的溶解。由于整个系统的提取不需要很高，提取可以在室温下进行，可以免去高温对提取成分的影响，这个优点非常适合解决穿心莲内酯不耐热，在较高温度下容易分解损失的问题；而纤维素酶能有效地破坏植物的细胞壁，使细胞壁及其之间的纤维素发生降解，从而增大细胞内有效成分向提取介质扩散的传质面积，提高植物有效成分的溶出率。由于酶解法会大大提取植物中成分的溶出率，除了目标成分之外的其他成分如淀粉、蛋白质、粘液质、色素、树胶、果胶等杂质也会随之溶出，从而大大提高提取产物的干膏收率，为后续的纯化工作增加难度，但是对于脂溶性成分的穿心莲内酯就没有这个问题，因为大部分杂质都是水溶性的，经过酶解前处理的穿心莲提取液中杂质不会明显增加。
传统的穿心莲提取工艺一般为将药材粉碎以后直接加乙醇浸取，脱色以后浓缩结晶即得穿心莲内酯粗品，该工艺有效成分得率比较低，而且杂质祛除不完全，对穿心莲制剂特别穿心莲注射剂的质量影响很大，从而也导致了穿心莲注射剂临床使用的诸多不良反应”１。在目前的穿心莲内酯研究中，虽然也有部分提取方法报道，但是提取时间长，提取率最高也仅为５０％左右，纯化方面比较欠缺，也没１
成都理Ｔ大学硕士学位论文
有对前期分离与后期纯化工艺的系统研究，所以，改进现有的提取技术和分离方法，系统地研究穿心莲内酯的提取纯化工艺对科学合理地利用穿心莲资源，具有重大的现实意义。
本研究主要综合比较常规乙醇浸提、超声提取以及原料酶解与否对穿心莲内酯的收率的影响，利用大孔吸附树脂吸附法在药物提取液的纯化中的效果，以期探索穿心莲内酯最佳的提取纯化方法以及条件，为提高穿心莲制剂的质量提供参考价值。
１．２研究目标
目前穿心莲制剂市场旺盛，而传统的提取纯化工艺对穿一ＥＬ，莲药材利用率比较低，并且由于临床使用上多次出现的不良反应也给穿心莲提纯工艺提出了更高的要求。本论文旨在探索提高穿心莲药材的利用率和穿心莲制剂质量。・１．３研究内容
结合穿心莲内酯的溶于极性溶剂以及不耐热等化学特性，利用目前先进的酶解前处理超声波提取和大孔吸附树脂纯化提高穿心莲内酯的提取率和提取物纯度，为提高穿心莲药材的利用率和制剂质量提供有益的参考价值。
１．４研究现状
１．４１穿心莲的性状
多年生草本，高５０～１００厘米，茎立。有棱，多分枝，节呈膝状膨大。单叶对生，近无柄，叶披针形或尖卵形，先端渐尖，基部棱形；边全缘或浅波状，叶柄短或近于无柄。圆锥花序项生或腋生：花小，淡紫白色，二唇形，上唇内面有紫红色花斑：雄蕊２枚；子房上位，２室。蒴果线状长椭圆形，表面中间有一条纵沟，成熟时紫褐色，种子多数。花期７～１０月，果期８～１１月。主产于广东、福建等省，华中、华北、西北等地也有引种。
１．４。２穿心莲的化学成分
穿心莲Ｄｔ‘的化学成分主要含二萜内酯化合物．根主要含黄酮类化合物“１。二萜内酯成分主要有：穿心莲内酯、１４－去氧一１２－羟基穿心莲内酯、１４一去氧一ｌｌ，１２一双键穿心莲内酯、１４一去氧穿心莲内酯、新穿心莲内酯、１４一去氧一１ｌ，１２一双键穿心莲内酯葡萄糖苷、“去氧穿心莲内酯葡萄糖苷、异穿心莲内酯、穿心莲内酯葡萄糖苷和７，８一二甲氧基一５Ｂ－羟基黄酮葡萄糖苷等。王金兰等”１利用柱层析及高效液相色谱（ＨＰＬＣ）对穿心莲地上部分的乙酸乙酯提取物进行了分离，共得到９种二萜内酯类化合物和１种主要存在于根部的黄酮类化合物，利用ｃ—ＮｕＲＭ等
第１章引言
对各种化合物的结构进行了确证。张树军等“１利用柱色谱及高效液相色谱等方法对穿心莲地上部分的乙酸乙酯提取物进行分离，得到１个新化合物，经合成实验和核磁共振谱推知该新化合物为１４一去氧一１２一羟基穿心莲内酯的立体异构体。１．４．３穿心莲内酯的理化性质及结构
穿心莲内酯为穿心莲中发挥治疗作用的主要有效成分，化学名为
２（３Ｈ—ｆｕｒａｎｏｎｅ。３一［ｄｅｃａｈｙｄｒｄｄｒｏ一６一ｈｙｄｒｏｘｙ一５一（ｈｙｄｒｏｘｙｌ－ｍｅｔｈｙｌ）～５，８ａ－ｄｉｍｅｔｈｙｌ一２－ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ一卜ｎａｐｔｈａｌｅｎｙｌ］ｅｔｈｌｉｄｅｎｅ）ｄｉｈｙｄｒｏ一４一ｈｙｄｒｏｘｙ，化学式为ｃ胡耐０５，分子量为３５０．４４，外观为类白色或微黄色方形或长方形结晶，无臭，味苦。穿心莲内酯为酯类结构，在水溶液中易水解、开环、异构化，故影响药物稳定性。在对穿心莲内酯的稳定性研究中发现”１，在不同温度、不同ｐＨ值环境、不同的生物样品及不同有机溶剂中，穿心莲内酯稳定性都有较明显的差异。温度越低，穿心莲内酯的稳定性越好；该成分在碱性条件下不稳定，且随着碱性强度的增加，其不稳定性增强；在酸性条件下较稳定，但并非酸性越强，稳定性就越好。其最稳定的ｐｎ值Ｎ３～５；低于ｐＨ值３时，其稳定性反而降低。穿心莲内酯在氯仿中较为稳定，丽在质子性溶剂中稳定性较差；穿心莲内酯在小牛血清中最稳定，在小鼠肝匀浆中稳定性最差。
～啦，心蕾内ｎ
图１穿心莲内酯结构式
１．４．４穿心莲内酯的药理作用
穿心莲内酯有很重要的药理作用，主要为消炎、杀菌、抗癌等。
（１）对病原微生物的影响
穿心莲水提物（５０～ｌＯＯｍｇ／ｍ１）对经ＭｃＣｏｙ细胞培养的衣原体，能显著减少包涵体数目，镜下形态观察，包涵体体积变小，说明同样可降低感染性，特别在２００ｍｇ／ｍｌ浓度时抑菌率达９３％。用维持培养液稀释的穿心莲水提物对宿主ＭｃＣｏｙ
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细胞无破坏作用，故认为其抗衣原体活性无破坏宿主细胞的间接作用，而对衣原体生长具有直接抑制作用０１。
（２）解热，抗炎
穿心莲内酯３０ｍｇ／ｋｇ对注射Ｂｒｅｗｅｒｓ酵母引起的直肠温度升高没有明显的解热作用。而在剂量ｌＯＯｍｇ／ｋｇ、３００ｍｇ／ｋｇ时口服穿心莲内酯３ｈ后有明显的解热活性，并持续６ｈ。穿心莲内酯高剂量解热活性与阿司匹林（３００ｍｇ／ｋｇ，Ｐ．０）相当。穿心莲内酯的解热机理与抑制下丘脑的前列腺素合成是否有关，有待进一步研究”１。（３）抗心血管疾病
抗氧化作用穿心草ＳＡ酮（ＣＸ）对大鼠正常组织匀浆体外生成过氧化物的自氧化作用有显著的抑制作用，脂质过氧化产物丙二醛生成量减少。ｃｘ可抑制ｖｉｔＥ和ＦｅＳ仉激发的线粒体膨胀，进一步证明了其可抑制脂质过氧化，减少氧自由基对生物膜的破坏。一般认为，含酚羟基的化合物具有明显清除氧自由基的作用，如ＶｉｔａｍｉｎＥ、苯甲酸等。ｃｘ为黄酮类化合物，化学结构与ＶｉｔａｍｉｎＥ相似，提示其抗氧化作用与清除氧自由基有关“…。
促纤维溶解作用临床研究报告１３例缺血性心脑血管病患者，口服穿心莲制剂后分别测定了药前，药后ｌｈ，１ｗ的血组织型纤溶酶原活化物（１一ＰＡ）含量，结果显示ｔ—ＰＡ含量显著升高。故穿心莲的促纤溶作用与其升高ｔ—ＰＡ含量，激活纤溶系统有关“”。
降血压作用穿心莲注射液静脉注射，可使麻醉狗的血压产生快速而持久的下降，其降压作用具有快速耐受性，但不能翻转静脉注射肾上腺素引起的升压反应，说明该药无ａ一受体阻断作用“”。
（４）对消化系统的影响
对肝药酶的影响穿心莲水提物（０．５和１．Ｏｍｇ／ｋｇＰ．０）及穿心莲内酯（５．０和ｌＯｍｇ／ｋｇ，Ｐ．０），能抑制大鼠肝微粒体苯胺羟化酶、Ｎ一去甲基酶、０一去甲基酶的活性，其中沪去甲基酶最敏感。但对肝重、微粒体蛋白含量及细胞色素Ｐ－４５０浓度没有影响。其抑制作用是由于降低了酶的催化活性，而不是影响酶底物亲和力，说明药物的抑制作用为非竞争性“”。
保肝作用穿心莲内酯对四氯化碳、Ｄ半乳糖胺及扑热息痛所致肝损伤均有显著对抗作用，１０００ｍｇ／ｋｇ的穿心莲内酯能使四氯化碳所致血清ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＡＫＰ、ＢＩＬ和肝甘油ｊ酯的升高下降８５．２％、６６．９％、６９．８％、５９．７％及６５．８％，但穿心莲的甲醇浸膏反有毒性，促进肝损伤大鼠死亡“”。
对免疫系统的影响实验研究表明穿心莲注射液经腹腔注射，可提高小白鼠玫瑰花环形成率和腹腔巨噬细胞吞噬指数，其作用机制可能与促进吞噬细胞，Ｔ淋巴细胞表面膜受体的反应性有关“５Ｈ”１。４
第ｌ章引言
（５）抗肿瘤
穿心莲提取物的抗癌活性经过测试证明对乳腺癌细胞株ＭｃＦ７、肝癌细胞ＨＥＰＧ：、肠癌细胞株ＨＴ。和Ｉｓ。。均有不同程度的增殖抑制作用，其中对肝癌细胞株｝ＩＥＰＧ’的增殖抑制作用较为明显，且作用强度随药物浓度增加而增强。
近年来，对穿心莲内酯的结构修饰与药理报道较多“”，过去对其药理研究主要侧重在抗菌消炎方面，随着研究的深入，对其抗ＨＩＶ病毒的研究有了较大的进展，以穿心莲内酯为母核的新药筛选也在进行中。
１．４．５临床应用
有报道称，穿心莲片、胶丸在临床应用中，会发生药疹、肠道反应、过敏性心肌损伤、毒性反应、过敏性休克等不良反应。而出现这些不良反应也从侧面反映出中药有效成分的纯化工作有待进一步完善。
１．４．６穿心莲内酯提取工艺的研究进展
提取穿心莲内酯的方法很多，常用的方法有水提法、醇提法。近年来，不少新技术和工艺也应用于穿心莲内酯的提取过程中，现分析如下。
Ｉ．４．６．１乙醇直接提取法
张玲“”等将药材粉碎为粗粉后装入渗漉桶中，用８５％的乙醇浸渍４８ｈ后，以ｌ－３ｍｌ／ｍｉｎ的速度渗漉，结果收率高，克服了穿心莲内酯不耐热、不溶于水的缺点。聂凌云“”等考察了不同浓度乙醇渗漉提取内酯类成分的动态变化以及温度对穿心莲内酯类成分的影响，结果是乙醇浓度对穿心莲内酯类成分的提取有影响，低温浓缩以及减少加热时间可减少内酯类成分的变化。渗漉法由于保持一定的浓度差，所以提取效率较高，浸液杂质较少；但费时较长，溶剂用量大，操作麻烦。徐家敏汹１等采用９０％的乙醇浸渍提取穿心莲内酯，考察了浸泡、浸渍温度对穿心莲内酯的影响。结果表明，提取温度低，穿心莲内酯成分损失小，而且叶绿素、胶质等杂质少，不容易产生粘锅、结块等现象。该方法相对来说收率比较高，提取工艺科学、合理。
１．４．６．２水提法
吴俊伟。”等将药材加水浸泡，加Ｉｍｏｌ／ｌ稀硫酸调节ＰＨ至４后，加入５％亚硫酸氢钠浸泡２４ｄ，时，结果收率高，可以节约大量乙醇和能源，降低了生产成本。郭彬蚴等采用碱水法提取穿心莲内酯，还考察了不同浓度的碱水对穿心莲内酯的影响，结果选用０．０１％的碱水提取的穿心莲内酯含量最高，成本最低。酸、碱水法的最大缺点是ＰＨ不好控制而容易造成有效成分的损失。
１．４．６．３超声提取法金海英【２３】等将药材制成粗粉，加乙醇超声提取２次，加正己烷萃取后用中性
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氧化铝柱出去杂质。结果加快了溶出速率，提高了穿心莲内酯的浸出率，同时也保证了其稳定性。
１．４．６．４酶解前处理法
此方法是将酶作为浸提辅助剂，破坏植物细胞壁结构，提高提取效率。马桔云、吕芳、于喜水等ｏ”将传统的乙醇浸提工艺与纤维素酶解相结合对穿心莲进行提取，结果加酶组穿心莲内酯收率明显高于未加酶组，而且纤维素酶的加入对所提有效成分没有影响。
１．４．７有效成分纯化工艺研究进展
中药水提液中常含有淀粉、蛋白质、粘液质、色素、树胶、果胶等杂质，使制成的制剂服用量较大，并且影响液体制剂的澄明度，因此，在制备工艺中常采用一些精制方法来纯化中药制剂。通过查阅文献发现对穿心莲的研究中，对其药用成分的纯化研究比较少，研究工作大部分还处于穿心莲初提物的水平上，而新近发展起来的超临界流体萃取结晶法也有难于大规模应用于工业生产的缺点。１．４．７．１大孔树脂吸附法
大孔树脂是以苯大孔吸附树脂主要以苯乙烯、ａ一甲基苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯、丙腈等为原料加入一定量致孔剂二乙烯苯聚合而成，多为球状颗粒，直径一般在Ｏ．３—１．２５矾ｎ之间，通常分为非极性、弱极性和中极性，在溶剂中可溶胀，室温下对稀酸、稀碱稳定。从显微结构上看，大孔吸附树脂包含有许多具有微观小球的网状孔穴结构，颗粒的总表面积很大，具有一定的极性基团，使大孔树脂具有较大的吸附能力；另一方面，这些网状孔穴的孔径有一定的范围，使得它们对通过孔径的化合物根据其分子量的不同而具有一定的选择性。通过吸附性和分子筛原理，有机化合物根据吸附力的不同及分子量的大小，在大孔吸附树脂上经一定的溶剂洗脱而达到分离的目的。
（１）树脂结构的影响
大孔树脂的吸附性能主要取决于吸附剂的表面性质，即树脂的极性（功能基）和空间结构（孔径、比表面积、孔容），一般非极性化合物在水中可以为非极性树脂吸附，极性树脂则易在水中吸附极性物质
（２）被吸附的化合物结构的影响
一般来说，被吸附化合物的分子量大小和极性的强弱直接影响到吸附效果。同时，大孔树脂本身就是一种分子筛，可按分子量的大小将物质分离。（３）洗脱剂的影响
通常情况下洗脱剂极性越小，其洗脱能力越强，一般先用蒸馏水洗脱，再用浓度逐渐增高的乙醇、甲醇洗脱。多糖、蛋白质、鞣质等水溶性杂质会随着水流下，极性小的物质后下。对于有些具有酸碱性的物质还可以用不同浓度的酸、碱６
第１章引言
液结合有机溶剂进行洗脱。
（４）ｐＨ值的影响
中药中的许多成分有一定的酸碱性，在ｐＨ值不同的溶液中溶解性不同，在应用大孔树脂处理这一类成分时ｐＨ值的影响显得至关重要。对于碱性物质一般在碱液中吸附酸液中解吸，酸性物质一般在酸液中吸附碱液中解吸。但是也有的树脂在吸附某些物质的时候不受ｐＨ的影响。
（５）温度的影响
大孔树脂的吸附作用主要是由于它具有巨大的表面积，是一种物理吸附，低温不利于吸附，但在吸附过程中又会放出一定的热量，所以操作温度对其吸附也有一定的影响。
（６）原液浓度的影响
原液浓度也是影响吸附的重要因素，如果原液浓度过低提纯时间增加，效率降低；原液浓度过高则泄漏早，处理量小，树脂的再生周期短。但是树脂本身具有富集浓缩的作用，对于热不稳定性的水提有效成分，上柱前的浓缩反而会使有效成分损失。
（７）其它影响因素
药液在上柱之前一般要经过预处理，预处理不好则会使大孔树脂吸附的杂质过多，从而降低其对有效成分的吸附。洗脱液的流速、树脂的粒径、树脂柱的高度也会产生一些影响，通常较高的洗脱液流速、较小的树脂粒径和较低的树脂高度有利于增大吸附速度，但同时也使单柱的吸附量有所降低。玻璃柱的粗细也会影响分离效果，当柱子太细，洗脱时，树脂易结块，壁上易产生气泡，流速会逐渐降为零。
（８）大孔吸附树脂的预处理及再生
大孔树脂一般含有未聚合的单体、制孔剂、引发剂及其分解物、分散剂和防腐剂等脂溶性杂质，使用前应先预处理。一般选用甲醇、乙醇或丙酮连续洗涤数次，洗至加适量水至无白色浑浊现象，再用蒸馏水洗至无醇味即可。必要时还要用酸碱液洗涤，最后用蒸馏水洗至中性即可。树脂用久了吸附的杂质就会增多，降低其吸附能力，故使用一段时间后需要再生。树脂的再生通常可以用溶剂来实现，乙醇是常用的再生剂。采用８０％左右的含水醇、酮或含有酸、碱的含水醇、酮进行洗涤，再生效果也很好。
目前，大孔树脂作为一种有机高聚吸附剂，具有选择性吸附有机化合物的能力，可应用于皂苷１２５１、黄酮【２６１、葸醌【绷、生物碱【２８】、水溶性酚性成份１２９】及中药提取、分离及纯化。范云鸽、张秀丽【３０１等研究了大孔树脂提取纯化穿心莲内酯的方法，最后确定ＡＤＳ．７型大孔吸附树脂提取分离穿心莲内酯的效果最好。
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Ｉ．４．７．２超临界流体萃取结晶法
超临界流体（ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌｆｌｕｉｄ，ＳＣＦ）萃取结晶技术”“，是以ＳＣＦ为萃取剂和展开剂，在一定压力和温度下，ＳＣＦ与多组分溶液混合，在萃取的同时进行结晶分离，由于萃取、层析、吸附和重力沉降等作用使各溶质结晶析出，并在结晶器上呈梯度分布。其特点是动态的ＳＣＦ与静态的天然产物活性成分接触，形成的ＳＣＦ溶液遇到外界障碍物——结晶器的扰动、表面场效应，使各组分在其上结晶析出，并形成梯度分布；产生类似于以ＳＣＦ为展开剂的薄层层析效果，在结晶器的上部或下部可得到较高纯度的组分：同时缩短了分离纯化时间。张文成、潘见ｍ１等采用单因素试验法探讨超临界ＣＯ：梯度结晶压力、温度、时间对穿心莲内酯纯度的影响，并利用高效液相色谱进行纯度检测。结果表明，超Ｉ临界ｃ０：在萃取穿心莲内酯时，出现同步结晶，且在结晶板上呈梯度分布；选择较佳纯化工艺参数为压力２０ＭＰａ，温度５５。Ｃ，时间９０ｍｉｎ，Ｃ０２流量１５Ｌ／ｍｉｎ时，得到穿心莲内酯的纯度达到８０％以上。该技术的主要特点是提取率高、产品不含有害物质、无污染。但是由于超临界提取所需设备价格昂贵生产成本高，因此目前仍不能进行规模化生产。
１．４．８萜内酯提取纯化研究进展
由于穿心莲内酯的提取纯化研究比较少，本文综合比较了同为萜类内酯的其他物质比如银杏内酯、青蒿素、薏苡内酯等提取以及纯化方法，以探索穿心莲内酯提取纯化更好的途径。郝金玉、韩伟等【３３１利用间歇微波辐射提取黄花蒿中的青蒿素，结果表明，微波辅助提取比传统的索氏提取大大提高了提取速度，对青蒿素的提取率也高于超临界Ｃ０２法。此外，利用超声提取技术Ⅲ１，青蒿素的提取率可达至Ｕ９０％，提取时间却缩短到Ｏ．５～１小时。刘春兰、周宜军、周恒彦等ｐ５Ｊ利用内酯易溶于特定有机溶剂的特点，采用有机溶剂萃取和柱层析相结合的方法，对薏苡中有效成分薏苡内酯进行提取，结果发现，在层析的过程中改变溶剂的组成和比例，对内酯的提取有很大影响。王成章、郁青、谭卫红等１３６Ｊ采用不同溶剂对银杏叶进行萃取，实验表明内酯对不同的有机溶剂选择性逐次减小，通过调节ＰＨ，增加盐离子改变相密度等方法萜内酯的富集率可达３５０／ｒ，－４０％。何捃１３７１等用ＤＡ２０１型大孔吸附树脂对白果内酯进行纯化，结果只需要一次柱分离，结晶纯化就可制得９５％以上的白果内酯。卢锦花、胡小玲、岳红等ｐ酬采用吸附树脂精制银杏提取物，得到的银杏萜内酯不仅纯度高，产率高，而且产品安全，不存在重金属、有机溶剂残留等问题。
１．４．９定量测定方法研究进展
１．４．９．１薄层色谱扫描法（ＴＬＣＳ）８
第１章引言
王海龙…３等用双波长ＴＬＣＳ钡ＪＪ定消炎利胆片中穿心莲内酯的含量，波长２２５ｎｍ，结果穿心莲内酯含量线性范围２．０２～１０．１０嵋，平均加样回收率为９８．８６％，ＲＳＤ为０．５０％。王泽芳…１等采用ＴＬＣＳ澳Ｊ定消炎利胆片中穿心莲内酯的含量，样品以乙醇直接提取，氯仿一乙酸乙酯一甲醇（１０：ｌＯ：１）为展开剂，测定波长为２３５ｎｍ，平均回收率为１０２．５％，测定方法简便、准确、灵敏度高。李玲玲““等采用双波长ＴＬＣＳ对复方炎得平胶囊中穿心莲内酯的含量进行测定，应用硅胶ＧＦ。板，紫外灯下定位，避免显色所引起的误差，检测波长为２２３ｎｍ，平均加样回收率９７．１２％。
１．４．９．２高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）
本法对含穿心莲中成药的含量测定非常有效。赵庆华“２１等用ＨＰＬＣ法测定消炎利胆片中穿心莲内酯的含量，色谱条件为，流动相：甲醇一水（５０：５０），检测波长２２５ｎｍ．外标峰面积定量，进样量在２．０２～１０．１０９９范围内线性关系良好，平均加样回收率为１００．３０％，ＲＳＤ＝Ｏ．７３％。赵登飞“”等用ＨＰＬＣ法测定清火栀麦片中穿心莲内酯的含量，以甲醇：水（５０：５０，ｐＨ＝４．５）为流动相，检测波长为２２５ｎｍ，加样回收率为９８．４％，ＲＳＤ＝２．０３％。黄捷ｍ１等采用ＨＰＬＣ法测定清火栀麦胶囊中穿心莲内酯的含量并对其进行稳定性考察，紫外检测波长为２２５ｎｍ，加速稳定性试验环境：３９。Ｃ、相对湿度７５％，每月考核１次，放置３月，穿心莲内酯含量下降了约５０％。杨建国“”等用ＨＰＬＣ法，选用ｃ。。柱和甲醇一水为流动相，测定痢泻灵片中穿心莲内酯的含量，穿心莲内酯的线性范围为ｌＯ～ｌｏｏｕ∥１１ｌｌ，变异系数＜２．３％。傅欣彤“”等采用ＨＰＬＣ法，外标法计算．测定粉刺水中穿心莲内酯的含量，ＹＷＧ－Ｃ。。柱，检测波长为２２５ｎｍ，甲醇～水（３８：６２）为流动相，平均回收率为９８．４２％，ＲＳＤ为ｌｒ６９％。
１．４．９．３电位滴定法
韦娟“７’等采用剩余碱水解一电位滴定法测定复方穿心莲片中穿心莲总内酯的含量，结果平均回收率为９６，９３％，ＲＳＤ为２．２４％（ｎ＝５）对于颜色较深的提取液，本法不受溶液的颜色和浑浊的限制。
１．４．９．４化学发光法
本法适应临床药学中研究穿心莲内酯的血药浓度。汪宗琪“”等用间接化学发光法监测兔血中穿心莲内酯的血药浓度，利用穿心莲内酯结构中羟基能被氧化的特点，将过氧化氢氧化穿心莲内酯的氧化还原反应与Ｌｕｍｉｎｏｌ－Ｈ。０２－Ｃ０：化学反应相偶合，实现了对免血中穿心莲内酯的定量监测，还采用高灵敏的有机偶合化学发光法对穿心莲内酯的血药浓度进行监测，求出系列药动学参数。
本实验采用２００５版药典规定之穿心莲内酯含量的检测方法即高效液相色谱分析方法作为实验中所有内酯含量测定的方法。
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１．５研究目标
穿心莲制剂以其卓越的抗炎抗菌等功效，一直是抗病毒类首选药物之一。特别是鱼腥草制剂由于不良的临床反应于２００５年被国家禁止使用以来，穿心莲制剂的需求被进一步放大。但是通过对国内外穿心莲提取、纯化以及ｌ临床使用反应的研究，我们发现，穿心莲的研究也存在着诸如提取时间长、提取率比较低；对有效成分的应用还基本停留在粗提物的阶段，纯化效率比较低；对药材原材料使用率低以及临床使用上也发现了一些不良反应“”“”１，而这些不良反应从另一个角度也说明了穿心莲药物制剂的纯化工作有待完善。所以，本课题利用目前在中药提取纯化领域应用效果很好的先进方法，通过实验，以２００５年版中国药典规定的高效液相色谱法为定性和定量检测方法，以穿心莲内酯的提取率以及纯度为考察指标，以期探索出提高穿心莲内酯提取率以及纯度的提取、纯化工艺。１．６论文的课题来源和主要成果
本论文的课题来源为自选课题，试验在研究生经费和导师大力支持下，在成都理工大学测试楼实验室和成都理工大学理化楼高效液相色谱实验室完成。研究成果为：试验探讨出将中药提取新技术酶解前处理超声波提取法应用于穿心莲药材中有效成分穿心莲内酯的提取工艺中的各个因素对内酯提取率的影响大小为乙醇浓度＞提取温度＞料液比＞提取时间，酶解前处理过程对穿心莲内酯提取率影响的因素大小顺序为：酶解时间＞酶解ｐＨ＞加酶量＞酶解温度。提取较优的工艺条件为：当温度为５０＂Ｃ，每５０９穿心莲加入１３００ｕ的纤维素酶，控制酶解环境ｐＨ＝４左右，酶解１００ｍｉｎ后将酶解液滤过，往滤渣中加入浓度为７５％，体积为原料ｌＯ倍的乙醇超声提取２０ｍｉｎ，使穿心莲内酯的提取率从传统浸渍提取的５０％左右提高到了９８％左右，提取时间也从４天缩短到了９０ｍｉｎ。论文还确定了最佳的吸附工艺条件为：吸附流速为１ＢＶ，ｌｌ，上柱液不调节ｐＨ，试验在室温下完成。在最佳吸附工艺条件下，树脂对穿心莲提取液的处理量大约达到树脂体积的２ｌ倍，２２ＢＶ流出液内酯泄漏率达到９．７７％，所以从２２ＢＶ开始停止对上柱液进行吸附。此时其有效吸附量为１３．４２ｍｇ／ｍｌｖ－，内酯得率为９０．２５％
最佳解吸工艺条件为：６０％ｐＨ＝５的乙醇，解吸流速为３ＢＶ／ｈ，解吸率为８４．９５％。在上述工艺条件下，提取液的干膏收率由纯化前的８．９１％降低到３％，而穿心莲内酯的纯度由纯化前２４．９８％提高到了６５％，本纯化工艺的内酯保留率为８５％以上，解吸实验在常温下进行，可见该纯化工艺在有效保留穿心莲内酯的同时，可以显著降低固型物得率，提高制剂的载药量。１０
第２章实验材科与方法
第２章实验材料与方法
２．１实验仪器以及材料
２．１．１主要仪器
Ｒ－２０１型旋转蒸发仪（上海申胜生物技术有限公司）；
高效液相色谱仪（日本岛津，ＳＨＩＭＡＤＺＵ，带光电二级管阵列检测器）；
超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司，ＫＱ５２００ＤＢ型数控）：
微型植物式样粉碎机（河北黄液市中兴仪器有限公司）；
恒温水浴锅，分析天平等
２．１．２材料试剂
穿心莲全草（购于成都市五块石中药市场）；
穿心莲内酯对照品（购于成都市药监所）
ＹＷＤ０７Ｄ大孔树脂（型号：Ｄ１０１
Ｄ．１６０Ｘ一５ＤＡ２０１－ＢＨＰＤ－４５０ＨＰＤ・６００Ｄ２９６）
乙醇（分析纯）、甲醇（色谱纯）、甲醇（分析纯）等
２．２检测方法
２．２．１高效液相色谱的检测原理
高效液相色谱检测法是用特制微粒充填的层析柱作为固定相，通过高压使液体流动相快速通过层析柱而达到快速有效分离液相中各种物质，通过对特定化学成分的特征峰的分析，定性以及定量检测特定化学物质。具有速度快，检测灵敏度高等特点，典型的高效液相色谱仪包括输液系统、进样分离系统、检测系统和数据处理系统等部分。用高压泵输入流动相；迸样可以是注射器进样，也可以是进样阀进样；检测器应用最多的是紫外或紫外一可见分光检测器，还有荧光检测器、示差检测器和电化学检测器等。
２．２．２色谱条件
色谱柱：ＫｘｏｓｍｏｓｉｌＣｌｓ
流动相：甲醇一水（５０：５０）
流速：０．６ｍｌ／ｍｉｎ检测波长：２２５ｎｍ
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柱温：室温
进样量：１０ｕＩ
２．２．３线性关系
精密称取约２５ｍｇ穿心莲内酯标准品于５０ｍｌ容量瓶中，用７５％乙醇稀释至刻度，再分别吸取２ｍｌ，４ｍｌ，６ｍｌ，８ｍｌ，ｌＯｍｌ于１０ｍｌ容量瓶中，定容，过滤头过滤取续滤液进样１０｜ｌ１，以峰面积为纵坐标，进样品浓度为横坐标做图，绘制标准曲线。其回归方程为：ｙ＝１７３７７２ｘ＋５９７６１，Ｒ２：ｏ．９９６８，线性关系良好。
器
甚１２００００
掌
１０００００
Ｂｏｏｏｏ
６００００
４００００
２００００
０
６ｌＯ进样体积ｕｌ
图２－２穿心莲内酯ＨＰＬＣ检测标准曲线
２．２．４精密度试验
在选定的色谱条件下，用１００ｐ咖ｌ的穿心莲内酯对照品溶液连续进样５次，按峰面积计算出ＲＳＤ。
２．２．５重复性试验精密称取穿心莲粉末５份，按供试品溶液制备方法处理后，记为ｌ・５号溶液，
第２章实验材料与方法
分别进样１０ｕｌ，在选定色谱条件下，测得相应峰面积，计算ＲＳＤ。
表２－２重复性实验结果
２．２．６稳定性试验
量取１号溶液，在选定色谱条件下，分别在４，８，１２，２４，４８ｈ进样，测定峰面积，结果表明，在常温下，４８ｈ内穿心莲内酯色谱峰面积无明显改变，溶液中穿心莲内酯含量稳定。表２－３稳定性实验结果
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第３章穿心莲内酯的提取纯化工艺研究
本课题主要对穿心莲中主要成分穿心莲内酯的提取以及提纯工艺加以研究，旨在提高穿心莲内酯的收率以及纯度。
３．１工艺路线的设计
根据穿心莲内酯的理化性质以及提取纯化的研究现状，为了最大限度地提高内酯的提取率和纯度，本文研究和应用了酶解前处理以及超声辅助提取相结合，同时采用大孔树脂对提取的内酯进行纯化处理，具体的工艺路线如图２一ｌ。
液
浓缩，干燥
１４
第３章穿心莲内酯的提取纯化工艺研究
图３－１穿心莲提取纯化工艺路线
３．２药材鉴别
３２．１浸出物含量测定
按照中国药典２００５年版穿心莲鉴定项下之规定，取穿心莲粉末５０９，精密称定，置于１００ｍｌ锥形瓶中，精密加７５％乙醇５００ｍｌ，称定重量，静置ｌ小时以后，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并且保持微沸１小时，放冷后，取下锥形瓶，密塞，再称定重量，用７５％的乙醇补足减失的重量，摇匀，用干燥滤器滤过，精密量取滤液１００ｍｌ，置已经干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干以后，于１０５℃干燥３小时，置于干燥器中冷却３０ｒａｉｎ，迅速精密称定重量，计算出热浸法条件下药材的浸出率，重复三次，计算平均值以及ＲＳＤ％。
表３－１热浸法鉴别药材浸出物
３．２．２穿心莲全草中内酯总含量测定
本实验中穿心莲药材中内酯理论含量以对药材采用传统浸渍工艺过度提取的含量为标准。具体方法为称取穿，ｔＬ，莲粉末５０９三份，加５００ｍ１７５％乙醇浸渍４天，至内酯基本提取完全。
表３－２穿心莲全草中内酯含量以及出膏率
３．３穿心莲内酯超声提取工艺条件筛选
３．３．１提取次数对提取率的影响
精确称取５０９穿心莲粉末４份，加５００ｍ１７５％乙醇适当浸泡，分别超声提取２０分钟１次、２次、３次、４次，多次提取的合并滤液，浓缩，定容于５０ｍｌ量瓶１５
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中，吸取ｌｍｌ于１０ｍｌ量瓶中定容，过滤后进样，测定峰面积，计算穿心莲内酯浓度，从而计算提取率。
表３－３提取次数对提取率的影响
图３－２提取次数对提取率的影响
提取两次滤液中含量与一次提取相比明显提高，而３次提取含量略有上升，４次提取基本已经没有改变，从实验成本以及时间考虑，提取两次比较合理。３．３．２乙醇浓度对提取率的影响
精确称取５０９穿心莲粉末，分ｌｌ：ＩＩ５００ｍ１３５％、５５％、７５％．９５％的乙醇适当浸泡约ｌＯ分钟，置于超声清洗器中超声提取２０分钟，提取两次合并滤液，浓缩后定容于５０ｒａｌ量瓶中，取ｌｍｌ定容于ｌＯｍｌ量瓶中，进样１０ｐｌ。
表３－４乙醇浓度对提取率的影响
由于穿心莲内酯为脂溶性成分，随着乙醇浓度的增加，内酯的提取率也有所增１６
第３章穿心莲内酯的提取纯化工艺研究
加，７５％以后内酯的提取率增加幅度不大，考虑到实验成本，采用７５％为最佳提取浓度。
图３－３乙醇浓度对提取率的影响
３．３．３料液比
称取药材粉末５０９，分别加入８、１０、１５、２０倍药材量的７５％乙醇适当浸泡约１０分钟，置于超声清洗器中超声提取２０分钟，提取两次合并滤液，浓缩后定容于５０ｍｌ量瓶中，取ｌｍｌ定容于ｌＯｍｌ量瓶中，进样１０ｐｌ。表３－５料液比对提取率的影响
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ｘ１００
：９０
默８０
耄７０
６０
５０
４０
３０
２０
１０
０
图３－４料液比对提取率的影晌
料液比为ｌＯ倍以上后内酯含量变化不大，而且料液比增大不仅消耗溶剂，在浓缩合并的滤液时内酯也容易有一定程度的损失，所以１０倍料液比比较合理。３３．４温度
取５０９药材粉末，加入５００ｍ１７５％的乙醇，浸泡约１０分钟，分别在３０、４０、５０、６０＂Ｃ下超声提取２０分钟，提取两次合并滤液，浓缩后定容于５０ｍｌ量瓶中，取Ｉｍｌ定容于ｌＯｍｌ量瓶中，迸样１０ｕｌ。
表３－６温度对提取率的影响
：Ⅲ
罄９０
譬８０
震７０
６０
５０
４０
３０
２０
１０
０｜－一
６０温度／＇Ｃ
图３－５温度对提取率的影响１８
第３章穿心莲内酯的提取纯化工艺研究
随着温度的提高，内酯的提取量也增大，但是温度达到５０＂Ｃ以后，内酯含量开始有所下降，因为内酯是不耐热成分，虽然温度提高加快了成分的溶出，但其在越来越高的温度下也会有所损失，不过内酯含量波动不大，还是比较稳定。３．３．５提取时间
取ｓｏｇ药材粉末，加入５００ｍ１７５％的乙醇，浸泡约１０分钟，在室温下分别超声提取１０分钟，２０分钟，３０分钟，４０分钟，提取两次合并滤液，浓缩后定容于５０ｒａｌ量瓶中，取ｌｍｌ定容于ｌＯｍｌ量瓶中，进样１０ｕｌ。（未加热）
穿心莲内酯随着超声波提取的延长而逐渐增加，但增加地越来越缓慢，超声提取３０ｍｉｎ以后，再延长提取时间提取率增加比较小，从试验工作效率考虑，３０ｒａｉｎ为比较佳的超声提取时间。
表３－７提取时间对提取率的影响
１０２０３０４０提取时Ｎ／ｍｉｎ
图３－６超声时间对提取率的影响
３．３．６正交试验
由正交实验分析分析得，影响穿心莲内酯提取率的因素大小顺序为：乙醇浓度＞提取温度＞料液ＬＣ＞提取时间。由正交表中可得超声提取较优的工艺条件１９
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为：Ａ。Ｂ：Ｃ：Ｄ。即最佳提取工艺为：提取温度控制在５０℃左右，加原料的１０倍乙醇为提取试剂，乙醇的浓度为７５％左右，超声提取时间为２０ｍｉｎ。
表３－８正交因素水平表
表３－９Ｌ。（３４）的正交设计
第３章穿心莲内酯的提取纯化Ｔ艺研究
注：Ｆｏ０９２）－１９．００，Ｆｏｉｏ＜２）＝９．００，Ｆ０２５口）－３．００，Ｆｏｉｏ＞Ｆ＞Ｆ０２５，该因素对指标有一定影响，记为△＇Ｆｏ．０５＞Ｆ＞Ｆｏｌｏ，该因素对指标有显著影响，记为・．
３．４纤维素酶解前处理工艺条件筛选
实验步骤：取５０９干燥穿心莲粉末，加入５００ｍ１７５％乙醇充分浸润，纤维素酶解后按照常规的超声波提取方法提取穿心莲内酯，考察不同的因素对提取率的影响。
３．４．１加酶量的影响
取５０９穿心莲粉末，不改变穿心莲乙醇浸润溶液的ｐＨ值（即ｐＨ＝５．５—６）以及常温条件下，分别加入６００、９００、１２００、１８００Ｕ酶解９０ｍｉｎ，然后超声提取３０ｍｉｎ，提取２次，合并滤液，浓缩后定容于５０ｍｌ量瓶中，取ｌｍｌ定容于１０ｍｌ量瓶中，进样１０ｕｌ。
表３－１１加酶量对内酯提取率的影响２１
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芝１００
＊
群９０
嚣００
最Ｔ０
６０
５０
４０
３０
２０
ｉ０
Ｏ
１２００１８００加酶量儿
图３－８纤维素酶用量对提取率的影响
随着纤维素酶的增加，植物中结构致密的细胞壁逐渐被水解，明显增加了内酯的溶出量，但是达到饱和后内酯浓度已经基本不再增加。
３．４．２酶解温度的影响
取５０９穿心莲粉末，不改变穿心莲乙醇浸润溶液的ｐＨ值（即ｐＨ＝５．５－６），加入１２００Ｕ在３０、４０、５０、６０＂Ｃ条件下酶解９０ｍｉｎ，然后超声提取３０ｍｉｎ，提取２次，合并滤液，浓缩后定容于５０ｒａｌ量瓶中，取Ｉｍｌ定容于ｌＯｍｌ量瓶中，进样１０ｐｌ。
随着温度的升高，酶分子的热运动加快，增加了与植物细胞壁的碰撞，从而增加了内酯的提取率，但是温度超过５０＇ｃ以后，过高的温度反而使酶分子变性失活，影响了内酯的提取。表３—１２酶解温度对内酯提取率的影响
第３章穿心莲内酯的提取纯化１＝艺研究
图３－９酶解温度对提取军的影响
３．４．３酶懈时间的影响
取５０９穿心莲粉末，不改变穿心莲乙醇浸润溶液的ｐＨ值（即ｐＨ２５．５・６），加入１２００Ｕ在５０。Ｃ条件下酶解６０、９０、１２０、１５０ｒａｉｎ，然后超声提取３０ｒａｉｎ，提取２次，合并滤液，浓缩后定容于５０ｍｌ量瓶中，取ｌｍｌ定容于１０ｍｌ量瓶中，进样１０ｐｌ。
表３—１３酶解时间对提取率的影响
水
＊
并
裂
船
罡Ｏ
１５０酶解时甸Ａｉｎ
图３－１０酶解时间对提取率的影响
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延长酶解时间有利于纤维素酶与药材充分反应，提高有效成分的溶出，但是酶解９０ｒａｉｎ以后再延长时间，提取率变化基本不大。
３．４．４酶解ｐＨ的影响
取５０９穿心莲粉末，３０ｎＡ．１２００Ｕ在５０＂Ｃ以及不同的ｐＨ条件下酶解９０ｍｉｎ，然后超声提取３０ｒａｉｎ，提取２次，合并滤液，浓缩后定容于５０ｒａｌ量瓶中，取ｌｍｌ定容于１０ｍｌ量瓶中，进样１０Ｈｌ。
表３－１４酶解ｐＨ对内酯提取率的影响
；１００
崩９０
嚣８０
Ｅ７０
６０
５０
●Ｏ
３０
２０
１０
Ｏ
６酶解ｐＨ
图３－１１ｐＨ对提取率的影响
表格中ｐＨ为６一项为没有改变提取环境的原有ｐＨ，可见在ｐＨ为４这样的酸性环境中，纤维素酶的活性最高，内酯的提取最为完全，而且在ｐＨ为３－５的环境中，穿心莲内酯的稳定性也是最好的，所以酶解的最佳ｐＨ为４左右。３．４．５正交分析表３．１５正交冈素水平表
第３章穿心莲内酯的提取纯化Ｔ艺研究
表３－１６Ｌ．（３４）的正交设计
表３－１７正交试验方差分析
：Ｆｏｏｓ（２）＝１９．００，Ｆｏｌ啦产９．００，Ｆ０２５（２）－３．００，Ｆｏｉｏ＞Ｆ＞Ｆｏ２５，该因素对指标有一定影响，记为△，Ｆｏ．０５＞Ｆ＞Ｆｏ．１０，该因素对指标有显著影响，记为・。
由正交实验分析分析得，酶解前处理过程对穿心莲内酯提取率影响的因素大２５
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小顺序为：酶解时间＞酶解ｐＨ＞加酶量＞酶解温度。由正交表中可得酶解前处理的最佳工艺条件为：Ａ。Ｂ。Ｃ。Ｄ。即最佳提取工艺为：酶解温度控制在５０＂Ｃ左右，每５０９穿心莲粉末｝ＪＩ／Ｘ．１３００Ｕ的纤维素酶，控制酶解ｐＨ为４左右，酶解１００分钟。３．５验证实验
称取５０９穿心莲粉末，按最佳酶解条件以及最佳超声波提取条件，分别进行３次平行实验，考察最佳提取工艺的稳定性以及可行性，并与传统浸渍工艺进行比较。
表３－ｔ８验证实验结果
试验结果表明，该试验结果稳定，结合最佳酶解工艺条件以及最佳超声提取工艺条件，穿心莲内酯的提取率达到了９８％左右，基本达到了传统浸渍提取方法的２倍，并且时间大大缩短，提高了提取工艺效率。
３．６小结
１．通过超声波提取与传统常规浸渍提取比较，超声提取２０ｒａｉｎ，穿心莲内酯的提取率达到６０％以上，与文献中ｆＪ删提到的传统浸渍方法比较，提取时间从４天左右缩短到了２０分钟，而内酯的提取率也从最高５０％左右提高到了７９．８４％。
２．通过单因素和正交实验考察超声时间、温度、料液比以及乙醇浓度等因素对穿心莲内酯提取率的影响，发现影响内酯提取率的因素大小顺序为：乙醇浓度＞提取温度＞料液比＞提取时间，即提取温度控制在５０℃左右，加原料的１０倍乙醇为提取试剂，乙醇的浓度为７５％左右，超声提取时间为２０ｍｉｎ。
３．通过单因素和正交实验考察酶解时间、酶解温度、酶解ｐＨ以及加酶量等因素对穿，Ｄ莲内酯提取率的影响，发现影响内酯提取率的因素大小顺序为：酶解时间＞酶解ｐＨ＞）ＪＲ酶量＞酶解温度。由正交表中可得酶解前处理的最佳工艺条件为：Ａ３Ｂ。Ｃ：Ｄ２，即最佳提取工艺为：酶解温度控制在５０＂Ｃ左右，每５０９穿心莲粉末加入１３００Ｕ的纤维素酶，控制酶解ｐＨ为４左右，酶解１００分钟，滤过以后加原料的１０倍乙醇为提取试剂，乙醇的浓度为７５％左右，超声提取时间为２０ｍｉｎ，提取２次。３．未加酶解的超声提取的穿心莲内酯的提取率为７９．８４％，出膏率为７．４３％，酶
第３章穿心莲内酯的提取纯化工艺研究
解超声提取的穿心莲内酯的提取率达到９８．０９％，出膏率为８．９１％，与酶解前相比，内酯提取率有明显的提高，而出膏率并没有明显的增加，即药材中的水溶型杂质基本没有被提取出来，对后续的纯化工艺没有大的影响。
３．７大孔树脂纯化工艺研究
３．７．１树脂筛选
为了筛选出最佳的穿心莲内酯的吸附树脂，首先对国内外几种常见的大孔树脂进行静态吸附，选出具有比较高的吸附容量的树脂。
表３－１９８种大孔树脂的结构参数
３．７．１．１树脂的前处理
用９５％的乙醇浸泡２４ｈ，再用蒸馏水洗涤至无醇，５％的ＨＣｌ以及４％的ＮａＯＨ浸泡４ｈ，再用蒸馏水洗涤至中性，备用。
３．７．１．２大孔树脂再生实验
将使用过后的树脂采用ｌｍｏｌ／１的盐酸和ｌｍｏｌ／１的氢氧化钠溶液交叉洗涤树脂２—３次，再用无水乙醇洗涤，最后采用蒸馏水洗涤至无醇昧后重复使用，考察树脂的吸附和解吸效果，结果如表１７所示。
表３－２８大孔树脂再生实验如表所示，ＤＡ２０１一Ｂ型大孔树脂具有良好的重复使用性，经过４次左右的重
成都理工大学硕士学位论文
复使用，吸附容量和解吸率并没有明显的下降，可以重复使用多次
３．７．１．３树脂的吸附容量
精确量取各种树脂５ｍｌ，分别加入５０ｍｌ内酯含量为１．４７７ｍｇ／ｍｌ的提取液，常温下置于水浴振荡器中振荡２４ｈ，测定提取液中剩余的内酯含量，计算树脂的吸附量。
静态吸附实验结果表明，ｘ．５，ＤＡ．２０１一Ｂ以及Ｄ２９６三种树脂的吸附容量相对比较大，选这三种树脂，考察其解吸能。
表３－２０树脂的吸附容量
３．７．１．４树脂的解吸率
将此三种吸附饱和的湿树脂分别加入５０ｍｌ的５５％的乙醇，常温下于水浴振荡器中振荡解吸２４ｈ，测定解吸附溶液中内酯的含量，从而确定树脂的解吸率。
表３－２１三种树脂的解吸率
可见，在相同条件下，Ｄ２９６树脂基本不能解吸下来，ｘ．５树脂只能够解吸５０％左右的内酯，具有最佳的吸附以及解吸效果的是ＤＡ２０１．Ｂ型树脂。３．７．２树脂吸附条件筛选
３．７．２．１吸附流速
精确量取ＤＡ２０１．Ｂ型５ｍｌ湿树脂，湿法装柱。取浓度为１．４８７ｍｇ／ｍｌ的穿心莲提取液为上柱液，提取液通过树脂柱流速分别为１ＢＶ／ｈ，２ＢＶ／ｈ，３ＢＶ／ｈ，分批收集流出液，每１０ｍｌ为一份，测定流出液中穿心莲内酯的浓度。计算出流出液中内酯的泄漏率，选择最佳的吸附流速。
可以看出，在其他条件相同的情况下，比较低的上柱液流速有利于目标成分在树脂中充分进行粒扩散和膜扩散，从而使树脂吸附能力提高，流速为１ＢＶ／ｈ时，树脂吸附效率明显优于高流速的吸附效率，从１８ＢＶ流出液开始，穿心莲内酯开始泄漏，２２ＢＶ流出液内酯泄漏率达到９．７７％，所以从２２ＢＶ开始停止对上
第３章穿心莲内酯的提取纯化Ｔ艺研究
柱液进行吸附，对吸附饱和的树脂再进行解吸。此时树脂有效吸附量为１３．４２ｍｇ／ｍｌ删＿，内酯得率为９０．２５％。所以１ＢＶ／ｈ为比较适宜的吸附流速。
表３－２２吸附流速对树脂吸附的影响
女》苴竖盔霍∞∞鲫
加∞∞们∞加∞ｏ
０５１０１５２０２５３０３５４０
流出液体积／ＢＹ
Ｅ至亟正三夏巫三三亘圈
图３—１２上柱液流速对树脂吸附的影响
３．７．２．２上柱液ｐＨ
以浓度为１．４５５ｍｇ／ｍｌ的提取液为上柱液，分别调节ｐＨ为５、６（不调）、７、
堕塑墨三查兰堡主兰竺丝兰
８，以１ＢＶ／ｈ的流速上柱，操作同上。
表３－２３不同ｐＨ流出液体积与内酯泄漏率的关系
堕些鎏堡塑！坠
ｐＨ＝５
！
！
０２２８．９８２０２２９．７７２Ｏ２２２１．５０
！
０２４１８．３６４０２４２０．０５４Ｏ２４３６．７１４０２４
！
０
！
０
！！
０
！！
０
！！
０
！！
０
！！
０
泄漏率／％０流出液体积／Ｂｖ泄漏率／％流出液体积／ＢＹ
２０２．７９０
６Ｏ
８０
１０１２０
１４Ｏ
１６Ｏ
１８１．５３
泄漏率／％０
ｐＨ－－６
’
０
流出液体积／ＢＹ泄漏率／％流出液体积／ＢＹ
２０５．２３０
６０
８Ｏ
１００
１２０
１４０
１６４．１３
１８８．８３
泄漏率／％０
ＤＨ＝７
‘
流出液体积／ＢＹ泄漏率／％流出液体积／ＢＹ
２０１２．０５０
２
Ｏ２２
６０
８０
１００
１２３．９４
１４１２．４５
１６２５．５２
１８５１．６７
泄漏率／％０
ＰＨ＝８
’
流出液体积／Ｂｖ
２０
鲨塑兰生笪：兰：！：：！：！：竺
一＼昔睡毫龉墨
０
５
１０
１５
２０
２５
３０
Ｅ巫三亚五至圈
图３．１３
ｐＨ对树脂吸附的影晌
３０
童出液体积／ＢＶ
ｐＨ对树脂吸附影响比较大，在弱酸性环境下，树脂吸附效率优于中性和碱性环境，如图３—１３所示，ｐＨ＝８时，穿心莲内酯从第１２份流出液开始即开始大
第３章穿心莲内酯的提取纯化工艺研究
量泄漏，而ｐＨ＝５时，内酯从第２０份才开始出现泄漏，由于ｐＨ＝５与穿心莲提取
液自身酸碱度很接近，而调节ｐＨ又很容易引起内酯的损失，所以上柱液不调节
ｐＨ。
３．７，３树脂洗脱条件筛选
３
７．３．１洗脱液浓度的选择
采用静态洗脱的方法，考察５０％、６０％、７０％、８０％、９０％的乙醇对内酯的
静态洗脱效果筛选比较好的洗脱液浓度。用已经吸附饱和的ＤＡ２０１．Ｂ型湿树脂５ｍｌ，其吸附量为１３．７８ｍｇ／ｍｌ＿树庸，加入不同浓度的乙醇５０ｍｌ，常温下置于水浴振荡器中２４ｈ，测定解吸液中内酯的含量。
表３－２４不同浓度的乙醇的静态解吸
可见，６０％浓度的乙醇对内酯的解吸率最高，而且综合经济成本等因素考虑，采用６０％的乙醇作为最佳的洗脱溶剂。３．７．３．２洗脱液的ｐＨ
选用已经吸附饱和的ＤＡ２０１．Ｂ型湿树脂５ｍｌ，其吸附量为１３．７８ｍｇ／ｍｌｗ＿，
分别加入ｐＨ＝４、５、６、７的６０％乙醇５０ｍｌ静态解吸，计算解吸率。
由于在碱性环境中，穿心莲内酯很不稳定，本实验考察酸性环境和中性环境对洗脱效果的影响，由静态洗脱实验可见，酸性条件下解吸率明显高于碱性条件下的解吸率，综合考虑采用ｐＨ＝５，６０％的乙醇作为穿心莲内酯的洗脱剂。
表３－２５不同ｐＨ的乙醇对树脂的解吸影响
３．７．３．３洗脱液流速的选择
６０％７，醇分别以３ＢＶ／ｈ，４ＢＶ／ｂ＿，５ＢＶ／ｈ的速度通过吸附量为１３．４２ｍｇ／ｍｌ－村－
树脂柱，每５ｍｌ为一份收集流出液，测定内酯含量，绘制树脂动态解吸曲线，选择最佳解吸流速。
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表３．２６不同洗脱液流速下流出液体积与内酯含量的关系
流出体积／ｍｌ
内酯浓度／ｍｇ・ｍｌ‘１
３ＢＶ／ｈ
５
１０
１５
２０
２５
３０
３５
４０
０．０５０．８３６．１７３．２５
１．０８０．０２
０
０
解吸率，％累计解吸率，％内酯浓度／ｍｇ・ｍｌ’１
Ｏ．３７６．１８４５．９９２４．２２８．０５Ｏ．１５
０．３７６．５５５２．５３７６．７５８４．８８４．９５
０．０４０．３６４．２２
３．３０２４．６０
１．３３０．５２０．０２
４ＢＶ／ｈ
解吸率，％累计解吸率，％内酯浓度／ｍｇ・ｍｌ。１
０．３０２．６８３１．４５
９．９１３．８７０．１５
０．３０２．９８３４．４３５９．０３６８．９４７２．８１７２．９６
Ｏ．Ｏｌ０．０６０．４５０．５２
０．５６４．１７４．６９
２．００１４．９０
３．２６２４．２９４３．８８
２．２０
１６．３９６０．２７
１．２０８．９４６９．２１
０．２６１．９４７１．１５
５Ｂｖｍ
解吸率，％０．０７累计解吸率，％
０．０７
１９．５９
甲１０
一
手
∞
Ｅ
９
型嶷船墨子餐丑赠
８
７
６５４３２１Ｏ０
１０
２０
３０
４０
５０流出液体积／ｍ１
图３—１４流速对树脂解吸的影响
如３—１４所示，低流速有利于穿心莲内酯的解吸，当解吸液流速为３ＢＶ／ｈ时，内酯被集中解吸于第５－－３０ｍｌ解吸液中，其中内酯平均浓度为１．９０ｍｇ／ｍｌ。ｌＯｍｌ．２０ｍｌ流出液中内酯最为集中，内酯平均浓度为２．５６ｍｇ／ｍｌ，所以建议收集
此区问的流出液作为富集液。
３２
第３章穿心莲内酯的提取纯化工艺研究
３．７．４验证实验
称取穿心莲１５０９，根据最佳提取工艺以及纯化工艺，上柱前后分别测定内酯
含量以及固形物得率，考察大孔树脂纯化工艺的实际效果。实验数据如表３—２７。
表３－２７大孔树脂纯化工艺
３．７．５穿心莲提取溶液纯化前后ＨＰＬＣ图谱对比
图３—１７穿心莲内酯标准品ＨＰＬＣ色谱图
…■……＿‘～
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图３—１８穿心莲药材提取液ＨＰＬＣ色谱图
…Ｊ～＾＿…＿＿～
图３—１９穿心莲纯化液ＨＰＬＣ色谱图
由穿心莲内酯标准品ＨＰＬＣ色谱图可以看到，穿心莲内酯在本实验色谱条件下，保留时间为４ｍｉｎ左右。穿心莲提取液以及纯化液在相同系统和色谱条件下，特征峰在相同保留时间出现，可以确定为穿心莲内酯。通过比较可以看出，大孔树脂在本实验条件下对穿心莲内酯提取液有着很好的纯化效果。通过大孔树脂纯化以后的穿心莲内酯纯度得到提高。
３．８小结
（１）通过对８种不同类型的大孔树脂进行静态和动态吸附实验，研究发现，ＯＡ２０１一Ｂ型大孔树脂为纯化穿心莲内酯的最佳树脂，吸附容量达到了１３．７８ｍｇ／ｍ１湿树脂。
（２）通过树脂动态吸附实验考察了吸附流速、解吸流速、上柱液ｐＨ、洗脱液浓度等因素对吸附效果的影响，最终确定最佳的吸附工艺条件为：吸附流速为１ＢＶ＆上柱液不调节ｐＨ，在最佳吸附工艺条件下，树脂对穿心莲提取液的处理量大约达到树脂体积的２ｌ倍，２２ＢＶ流出液内酯泄漏率达Ｎ９．７７％，所以从２２ＢＶ
开始停止对上柱液进行吸附，此时树脂有效吸附量为１３．４２ｍｇ／ｍｌ＝＊＿，内酯得率
为９０．２５％。最佳解吸工艺条件为：６０％ｐＨ＝５的乙醇，解吸流速为３ＢＶ／ｈ。解吸率
为８４．９５％。
（３）研究结果表明：在最佳工艺条件下，穿心莲提取液的出膏率从纯化前的８．９１％左右降低到３％，而提取液中的穿心莲内酯的纯度则大大提高，从纯化前的２４．９８％左右提高到了６５％，可见该纯化工艺在有效保留穿心莲内酯的同时，可以显著降低固型物得率，提高制剂的载药量。
结论
结论
本论文按照２００５年版中国药典的标准，以穿心莲全草中穿心莲内酯为检测指标，以内酯的提取率以及纯度为评价标准，对穿心莲药材的提取纯化工艺做了比较系统的研究，得出的结论如下：
（１）本论文以乙醇为提取溶剂，以穿心莲内酯的提取率以及出膏率为评价指标，实验比较了酶解前处理和超声波辅助提取与传统的浸渍工艺对穿心莲内酯的提取效果，实验表明，对原料进行纤维素酶解前处理，采用超声波提取的方法，可大幅度提高穿心莲内酯的提取率，当温度为５０℃，每５０９穿心莲加，Ｋ１３００Ｕ的纤维素酶，控制酶解环境ｐＨ＝４左右，酶解１００ｍｉｎ，将酶解液过滤后在滤渣中加入体积为滤渣１０倍的浓度为７５％的乙醇超声提取２０ｍｉｎ，穿心莲内酯的提取率达到９８％。
（２）采用大孔树脂纯化穿心莲提取液中的内酯，通过对ＤＡ２０１－Ｂ、Ｘ－５、Ｄ２９６等８种不同类型的大孔树脂进行静态和动态吸附实验，确定采用ＤＡ２０１一Ｂ型树脂为纯化内酯的最佳树脂，通过对上柱液流速、ｐＨ和解吸液的浓度、流速等因素的考察，确定最佳吸附工艺为：吸附流速为ＩＢＶ／ｈ，不调节上柱液的ｐＨ，试验在室温下完成，在最佳吸附工艺条件下，树脂对穿心莲提取液的处理量大约达到树脂体积的２１倍，２２ＢＶ流出液内酯泄漏率达到９．７７％，所以从２２ＢＶ开始停止对上柱液进行吸附，此时树脂有效吸附量为１３，４２ｍｇ／ｍｌ￡栅，内酯得率为９０．２５％。
（３）最佳解吸工艺为：采用６０％，ｐＨ＝５的乙醇，洗脱流速为３ＢＶ／ｈ，实验在室温下进行，解吸率为８４．９５％。在最佳解吸工艺条件下，提取液的干膏收率由纯化前的８．９１％降低Ｎ３％，而穿心莲内酯的纯度由纯化前的２４．９８％提高到了６５％，本纯化工艺的内酯保留率为８５％以上。
（３）本论文针对目前穿心莲提取基本还采用效率比较低的浸渍提取以及纯化工作比较欠缺的现状，通过对穿心莲内酯提取和纯化工艺的系统研究，提出了简便、高效和科学合理的工艺路线，确定了相关的工艺条件，特别是提出了大大提高穿心莲内酯纯度的大孔树脂纯化工艺，为穿心莲制剂的开发特别是提高穿心莲针剂等质量，尽量减少目前普遍存在的穿心莲针剂临床使用的不良反应提供了有益的参考。
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致谢
本论文是在导师安莲英教授精心指导下以及众多老师同学的帮助下顺利完成的。安教授在科研上严谨的作风、工作上精益求精的态度以及为人处世上认真负责的原则都让我受益匪浅。在三年硕士学习期间，安老师给予了我慈母般的关怀和持续不断的鼓励，使我终生难忘。在学术讨论上，安老师求实的精神和博大的胸怀激励着我锐意进取，孜孜追求。在此，谨向安老师致以最崇高的敬意和最衷心的感谢。
我还要感谢殷辉安老师和唐明林老师在课题的立题方面给予的建议和支持，感谢实验室的张玉老师和高效液相色谱室的许淑霞老师在实验仪器上也为我提供很大的帮助。另外特别感谢刘军凯、刘宁、赵晶等同学以及师弟师妹刘星、冯毅等以及其他在学习和生活中给予作者帮助的同学们。
感谢所有辛勤劳动的评审论文和论文答辩委员会的专家、老师们！最后，感谢一直以来默默支持我求学的家人和朋友们！
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成都理工大学
硕士学位论文
穿心莲内酯的提取及纯化工艺研究
姓名：徐靓
申请学位级别：硕士
专业：分析化学
指导教师：安莲英
20070501
穿心莲内酯的提取及纯化工艺研究
作者简介：徐靓，女，１９８１年９月出生，２００４年９月师从于成都理工大学安莲英教授，于２００７年６月获硕士学位。
摘要
穿心莲为解毒消炎类临床常用药。大量的药理研究发现，穿心莲中的脂溶性成分穿心莲内酯不仅具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗癌、抗心血管疾病。
本论文以酶解前处理超声提取法作为穿心莲内酯的提取方法，以大孔树脂纯化法作为穿心莲提取液的纯化方法，以穿心莲内酯的提取率以及纯度为评价指标，具体的工艺条件与试验结论如下：
影响穿心莲内酯提取率的因素大小顺序为：乙醇浓度＞提取温度＞料液比＞提取时间。超声提取较优的工艺条件为：当温度为５０℃，每５０９穿心莲加入１３００Ｕ的纤维素酶，控制酶解环境ｐＨ＝４左右，酶解１００ｍｉｎ，酶解溶液滤过以后，往滤渣中加入浓度为７５％，体积为原料１０倍的乙醇超声提取２０ｒａｉｎ。未加酶解的超声提取的穿心莲内酯的提取率为７９．８４％，出膏率为７．４３％，酶解超声提取的穿心莲内酯的提取率达到９８．０９％，出膏率为８．９１％，与酶解前相比，内酯提取率有明显的提高，而出膏率并没有明显的增加，即药材中的水溶型杂质基本没有被提取出来，对后续的纯化工艺没有大的影响。
采用ＤＡ２０１－Ｂ型大孔树脂为纯化穿心莲内酯的最佳树脂，通过树脂动态吸附实验考察了吸附流速、解吸流速、上柱液ｐＨ、洗脱液浓度等因素对吸附效果的影响，最终确定最佳的吸附工艺条件为：吸附流速为１ＢＶ／ｈ，上柱液不调节ｐＨ，在最佳吸附工艺条件下，树脂对穿心莲提取液的处理量大约达到树脂体积的２ｌ倍，２２ＢＶ流出液内酯泄漏率达到９．７７％，所以从２２ＢＶ开始停止对上柱液进行吸附，此时树脂有效吸附量为１３．４２ｍｇ／ｍ１４树％，内酯得率为９０．２５％。最佳解吸工艺条件为：６０％ｐＨ＝５的乙醇，解吸流速为３ＢＶ／ｈ，解吸率为８４．９５％。提取液的干膏收率由纯化前的８．９１％降低到３％，而穿心莲内酯的纯度由纯化前２４．９８％提高到了６５％，本纯化工艺的内酯保留率为８５％以上。
本论文对穿心莲内酯的提取纯化工艺进行了相关研究，获取了相对以往方法提高提取率、缩短提取时间、提高内酯纯度的工艺路线，为穿心莲内酯进一步开发利用以及尽量减少临床使用不良反应提供了有益的参考。
关键词：穿心莲内酯超声波纤维素酶大孔树脂
ＴｈｅＥｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＡｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ
Ｐａｎｉｃｕｌｔａ
ＡＢＳＴＲＡＣＴ
ＡｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓＰａｎｉｅｕｌｔａｉｓｔｈｅｎｏｒｍａｌＣｈｉｎｅｓｅｈｅｒｂａｌｍｅｄｉｃｉｎｅｎｑｕａｎｔｉｔｉｅｓｏ：ｍｅｄｉｃａｌｒｅｓｅａｒｃｈｅｓｓｈｏｗｔｈａｔＡｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓＰａｎｉｃｕｌｔａｌａｃｔｏｎｅ，ｔｈｅｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｉｚＡｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓＰａｎｉｃｕｌｔａｈａｓｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ｂａｃｔｅｒｉａｌ，ｖｉｒｕｓ，ａｎ（ｄｉｓｅａｓｅｓｏｆＣａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｔ．
Ｔｈｉｓｔｈｅｓｉｓｔａｋｅｓｅｔｈｙｌａｌｃｏｈｏｌ
ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｏｌｉｄｅａｓａｓｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｓｏｌｖｅｎｔａｎｄｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｒａｔｉｏｏ：ａｓｓｅｓｓｉｎｇｓｔａｎｄａｒｄ，ｔｈｕｓｔｈｅｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｌｙｇｏｏｄｃｒａｆｔｃｏｎｄｉｔｉｏｉｓｈｏｕｌｄｂｅ：ｗｈｅｎｔｈｅｔｅｍｐｒｅｒａｔｕｒｅｉｓ５０。Ｃ，ｐＨ＝４，ａｄｄ１３００ＵＣｅｌｌｕｌａｓｅｉｎｔｏｅｖｅｒｙ５０｛ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓＰａｎｉｃｕｌｔａ，ａｎｄｇｅｔｐｒｏｃｅｓｓｅｄｆｏｒ１００ｍｉｎｕｔｅ；ｔｈｅｎａｄｄｅｔｈｙａｌｃｏｈｏｌ（７５％），１０ｔｉｍｅｓｖｏｌｕｍｏｆｔｈｅｒａｗｓｔｕｆｆ；ｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｒａｔｉｏｏｆａｎｄｒｏｇｒａｐｈｏｌｉｄ‘ａｔｔａｉｎｓ９８％，ｔｈｅｙｉｅｌｄｗｉｔｈｏｕｔｃｅｌｌｕｌａｓｅｉｓ７．４３％，ａｎｄｔｈｅｙｉｅｌｄｏｆ
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Ｐａｎｉｃｕｌｔａ１ａｃｔｏｎｅ．ｏｆａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ
ＫｅｙｗｏｒｄｓＡｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓｕｌｔｒａｓｏｎｉｃＣｅｌｌｕｌａｓｅｒｅｓｉｎⅡＩ
独创性声明
本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得盛叠理王太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。
学位论文作者导师签名：农啄学位论文作者签名：纨｛弛
。啊年ｆ月乃／日
学位论文版权使用授权书
本学位论文作者完全了解盛签理王太堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权盛壑堡王太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。
（保密的学位论文在解密后适用本授权书）
学位论文作者签名：徐舌ｊＬｌ
叼年ｙ月哆日
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叼年ｙ月哆日
第１章引言
第１章引
１．１研究意义言
穿心莲原产于菲律宾、印度、斯里兰卡、泰国等热带地区，２０世纪５０年代由华侨引入我国广东、福建栽培，后北移至陕西、北京、四川等地。穿心莲为ｌ临床用药，是抗病毒的首选药物之一。穿心莲以全草人药，有清热解毒、消炎、消肿止痛等功效，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗癌、抗心血管疾病等作用“’根据国内外最新研究，穿心莲内酯的衍生物因其对“类激素”与“类蛋白转换酶”的有效抑制性极有希望开发成为一种高效抗艾滋病的天然药物。１。２００５年，由于严重的临床使用不良反映，历来占据消炎抗菌类中药制剂最大市场的鱼腥草中药制剂被国家禁止使用，使得穿心莲类制剂的市场大大拓宽，需求也非常旺盛，但是另外一方面，通过对国内外穿心莲提取、纯化以及临床使用反应的研究，我们发现，穿心莲的研究也存在着诸如提取时间长、提取率比较低；对有效成分的应用还基本停留在粗提物的阶段，纯化效率比较低；对药材原材料使用率低以及临床使用上也发现了一些不良反应等问题。
针对传统的有机溶剂浸渍提取方法的提取率低、提取时间长的缺点，目前中药成分提取研究中广泛应用的超声波提取和酶解前处理提取都可以应用于穿心莲内酯的提取研究中以期提高内酯的提取率、缩短提取时间。超声波法主要通过超声波粉碎药材的细胞壁，加速了化合物在溶液中的溶解。由于整个系统的提取不需要很高，提取可以在室温下进行，可以免去高温对提取成分的影响，这个优点非常适合解决穿心莲内酯不耐热，在较高温度下容易分解损失的问题；而纤维素酶能有效地破坏植物的细胞壁，使细胞壁及其之间的纤维素发生降解，从而增大细胞内有效成分向提取介质扩散的传质面积，提高植物有效成分的溶出率。由于酶解法会大大提取植物中成分的溶出率，除了目标成分之外的其他成分如淀粉、蛋白质、粘液质、色素、树胶、果胶等杂质也会随之溶出，从而大大提高提取产物的干膏收率，为后续的纯化工作增加难度，但是对于脂溶性成分的穿心莲内酯就没有这个问题，因为大部分杂质都是水溶性的，经过酶解前处理的穿心莲提取液中杂质不会明显增加。
传统的穿心莲提取工艺一般为将药材粉碎以后直接加乙醇浸取，脱色以后浓缩结晶即得穿心莲内酯粗品，该工艺有效成分得率比较低，而且杂质祛除不完全，对穿心莲制剂特别穿心莲注射剂的质量影响很大，从而也导致了穿心莲注射剂临床使用的诸多不良反应”１。在目前的穿心莲内酯研究中，虽然也有部分提取方法报道，但是提取时间长，提取率最高也仅为５０％左右，纯化方面比较欠缺，也没１
成都理Ｔ大学硕士学位论文
有对前期分离与后期纯化工艺的系统研究，所以，改进现有的提取技术和分离方法，系统地研究穿心莲内酯的提取纯化工艺对科学合理地利用穿心莲资源，具有重大的现实意义。
本研究主要综合比较常规乙醇浸提、超声提取以及原料酶解与否对穿心莲内酯的收率的影响，利用大孔吸附树脂吸附法在药物提取液的纯化中的效果，以期探索穿心莲内酯最佳的提取纯化方法以及条件，为提高穿心莲制剂的质量提供参考价值。
１．２研究目标
目前穿心莲制剂市场旺盛，而传统的提取纯化工艺对穿一ＥＬ，莲药材利用率比较低，并且由于临床使用上多次出现的不良反应也给穿心莲提纯工艺提出了更高的要求。本论文旨在探索提高穿心莲药材的利用率和穿心莲制剂质量。・１．３研究内容
结合穿心莲内酯的溶于极性溶剂以及不耐热等化学特性，利用目前先进的酶解前处理超声波提取和大孔吸附树脂纯化提高穿心莲内酯的提取率和提取物纯度，为提高穿心莲药材的利用率和制剂质量提供有益的参考价值。
１．４研究现状
１．４１穿心莲的性状
多年生草本，高５０～１００厘米，茎立。有棱，多分枝，节呈膝状膨大。单叶对生，近无柄，叶披针形或尖卵形，先端渐尖，基部棱形；边全缘或浅波状，叶柄短或近于无柄。圆锥花序项生或腋生：花小，淡紫白色，二唇形，上唇内面有紫红色花斑：雄蕊２枚；子房上位，２室。蒴果线状长椭圆形，表面中间有一条纵沟，成熟时紫褐色，种子多数。花期７～１０月，果期８～１１月。主产于广东、福建等省，华中、华北、西北等地也有引种。
１．４。２穿心莲的化学成分
穿心莲Ｄｔ‘的化学成分主要含二萜内酯化合物．根主要含黄酮类化合物“１。二萜内酯成分主要有：穿心莲内酯、１４－去氧一１２－羟基穿心莲内酯、１４一去氧一ｌｌ，１２一双键穿心莲内酯、１４一去氧穿心莲内酯、新穿心莲内酯、１４一去氧一１ｌ，１２一双键穿心莲内酯葡萄糖苷、“去氧穿心莲内酯葡萄糖苷、异穿心莲内酯、穿心莲内酯葡萄糖苷和７，８一二甲氧基一５Ｂ－羟基黄酮葡萄糖苷等。王金兰等”１利用柱层析及高效液相色谱（ＨＰＬＣ）对穿心莲地上部分的乙酸乙酯提取物进行了分离，共得到９种二萜内酯类化合物和１种主要存在于根部的黄酮类化合物，利用ｃ—ＮｕＲＭ等
第１章引言
对各种化合物的结构进行了确证。张树军等“１利用柱色谱及高效液相色谱等方法对穿心莲地上部分的乙酸乙酯提取物进行分离，得到１个新化合物，经合成实验和核磁共振谱推知该新化合物为１４一去氧一１２一羟基穿心莲内酯的立体异构体。１．４．３穿心莲内酯的理化性质及结构
穿心莲内酯为穿心莲中发挥治疗作用的主要有效成分，化学名为
２（３Ｈ—ｆｕｒａｎｏｎｅ。３一［ｄｅｃａｈｙｄｒｄｄｒｏ一６一ｈｙｄｒｏｘｙ一５一（ｈｙｄｒｏｘｙｌ－ｍｅｔｈｙｌ）～５，８ａ－ｄｉｍｅｔｈｙｌ一２－ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ一卜ｎａｐｔｈａｌｅｎｙｌ］ｅｔｈｌｉｄｅｎｅ）ｄｉｈｙｄｒｏ一４一ｈｙｄｒｏｘｙ，化学式为ｃ胡耐０５，分子量为３５０．４４，外观为类白色或微黄色方形或长方形结晶，无臭，味苦。穿心莲内酯为酯类结构，在水溶液中易水解、开环、异构化，故影响药物稳定性。在对穿心莲内酯的稳定性研究中发现”１，在不同温度、不同ｐＨ值环境、不同的生物样品及不同有机溶剂中，穿心莲内酯稳定性都有较明显的差异。温度越低，穿心莲内酯的稳定性越好；该成分在碱性条件下不稳定，且随着碱性强度的增加，其不稳定性增强；在酸性条件下较稳定，但并非酸性越强，稳定性就越好。其最稳定的ｐｎ值Ｎ３～５；低于ｐＨ值３时，其稳定性反而降低。穿心莲内酯在氯仿中较为稳定，丽在质子性溶剂中稳定性较差；穿心莲内酯在小牛血清中最稳定，在小鼠肝匀浆中稳定性最差。
～啦，心蕾内ｎ
图１穿心莲内酯结构式
１．４．４穿心莲内酯的药理作用
穿心莲内酯有很重要的药理作用，主要为消炎、杀菌、抗癌等。
（１）对病原微生物的影响
穿心莲水提物（５０～ｌＯＯｍｇ／ｍ１）对经ＭｃＣｏｙ细胞培养的衣原体，能显著减少包涵体数目，镜下形态观察，包涵体体积变小，说明同样可降低感染性，特别在２００ｍｇ／ｍｌ浓度时抑菌率达９３％。用维持培养液稀释的穿心莲水提物对宿主ＭｃＣｏｙ
成都理工大学硕士学位论文
细胞无破坏作用，故认为其抗衣原体活性无破坏宿主细胞的间接作用，而对衣原体生长具有直接抑制作用０１。
（２）解热，抗炎
穿心莲内酯３０ｍｇ／ｋｇ对注射Ｂｒｅｗｅｒｓ酵母引起的直肠温度升高没有明显的解热作用。而在剂量ｌＯＯｍｇ／ｋｇ、３００ｍｇ／ｋｇ时口服穿心莲内酯３ｈ后有明显的解热活性，并持续６ｈ。穿心莲内酯高剂量解热活性与阿司匹林（３００ｍｇ／ｋｇ，Ｐ．０）相当。穿心莲内酯的解热机理与抑制下丘脑的前列腺素合成是否有关，有待进一步研究”１。（３）抗心血管疾病
抗氧化作用穿心草ＳＡ酮（ＣＸ）对大鼠正常组织匀浆体外生成过氧化物的自氧化作用有显著的抑制作用，脂质过氧化产物丙二醛生成量减少。ｃｘ可抑制ｖｉｔＥ和ＦｅＳ仉激发的线粒体膨胀，进一步证明了其可抑制脂质过氧化，减少氧自由基对生物膜的破坏。一般认为，含酚羟基的化合物具有明显清除氧自由基的作用，如ＶｉｔａｍｉｎＥ、苯甲酸等。ｃｘ为黄酮类化合物，化学结构与ＶｉｔａｍｉｎＥ相似，提示其抗氧化作用与清除氧自由基有关“…。
促纤维溶解作用临床研究报告１３例缺血性心脑血管病患者，口服穿心莲制剂后分别测定了药前，药后ｌｈ，１ｗ的血组织型纤溶酶原活化物（１一ＰＡ）含量，结果显示ｔ—ＰＡ含量显著升高。故穿心莲的促纤溶作用与其升高ｔ—ＰＡ含量，激活纤溶系统有关“”。
降血压作用穿心莲注射液静脉注射，可使麻醉狗的血压产生快速而持久的下降，其降压作用具有快速耐受性，但不能翻转静脉注射肾上腺素引起的升压反应，说明该药无ａ一受体阻断作用“”。
（４）对消化系统的影响
对肝药酶的影响穿心莲水提物（０．５和１．Ｏｍｇ／ｋｇＰ．０）及穿心莲内酯（５．０和ｌＯｍｇ／ｋｇ，Ｐ．０），能抑制大鼠肝微粒体苯胺羟化酶、Ｎ一去甲基酶、０一去甲基酶的活性，其中沪去甲基酶最敏感。但对肝重、微粒体蛋白含量及细胞色素Ｐ－４５０浓度没有影响。其抑制作用是由于降低了酶的催化活性，而不是影响酶底物亲和力，说明药物的抑制作用为非竞争性“”。
保肝作用穿心莲内酯对四氯化碳、Ｄ半乳糖胺及扑热息痛所致肝损伤均有显著对抗作用，１０００ｍｇ／ｋｇ的穿心莲内酯能使四氯化碳所致血清ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＡＫＰ、ＢＩＬ和肝甘油ｊ酯的升高下降８５．２％、６６．９％、６９．８％、５９．７％及６５．８％，但穿心莲的甲醇浸膏反有毒性，促进肝损伤大鼠死亡“”。
对免疫系统的影响实验研究表明穿心莲注射液经腹腔注射，可提高小白鼠玫瑰花环形成率和腹腔巨噬细胞吞噬指数，其作用机制可能与促进吞噬细胞，Ｔ淋巴细胞表面膜受体的反应性有关“５Ｈ”１。４
第ｌ章引言
（５）抗肿瘤
穿心莲提取物的抗癌活性经过测试证明对乳腺癌细胞株ＭｃＦ７、肝癌细胞ＨＥＰＧ：、肠癌细胞株ＨＴ。和Ｉｓ。。均有不同程度的增殖抑制作用，其中对肝癌细胞株｝ＩＥＰＧ’的增殖抑制作用较为明显，且作用强度随药物浓度增加而增强。
近年来，对穿心莲内酯的结构修饰与药理报道较多“”，过去对其药理研究主要侧重在抗菌消炎方面，随着研究的深入，对其抗ＨＩＶ病毒的研究有了较大的进展，以穿心莲内酯为母核的新药筛选也在进行中。
１．４．５临床应用
有报道称，穿心莲片、胶丸在临床应用中，会发生药疹、肠道反应、过敏性心肌损伤、毒性反应、过敏性休克等不良反应。而出现这些不良反应也从侧面反映出中药有效成分的纯化工作有待进一步完善。
１．４．６穿心莲内酯提取工艺的研究进展
提取穿心莲内酯的方法很多，常用的方法有水提法、醇提法。近年来，不少新技术和工艺也应用于穿心莲内酯的提取过程中，现分析如下。
Ｉ．４．６．１乙醇直接提取法
张玲“”等将药材粉碎为粗粉后装入渗漉桶中，用８５％的乙醇浸渍４８ｈ后，以ｌ－３ｍｌ／ｍｉｎ的速度渗漉，结果收率高，克服了穿心莲内酯不耐热、不溶于水的缺点。聂凌云“”等考察了不同浓度乙醇渗漉提取内酯类成分的动态变化以及温度对穿心莲内酯类成分的影响，结果是乙醇浓度对穿心莲内酯类成分的提取有影响，低温浓缩以及减少加热时间可减少内酯类成分的变化。渗漉法由于保持一定的浓度差，所以提取效率较高，浸液杂质较少；但费时较长，溶剂用量大，操作麻烦。徐家敏汹１等采用９０％的乙醇浸渍提取穿心莲内酯，考察了浸泡、浸渍温度对穿心莲内酯的影响。结果表明，提取温度低，穿心莲内酯成分损失小，而且叶绿素、胶质等杂质少，不容易产生粘锅、结块等现象。该方法相对来说收率比较高，提取工艺科学、合理。
１．４．６．２水提法
吴俊伟。”等将药材加水浸泡，加Ｉｍｏｌ／ｌ稀硫酸调节ＰＨ至４后，加入５％亚硫酸氢钠浸泡２４ｄ，时，结果收率高，可以节约大量乙醇和能源，降低了生产成本。郭彬蚴等采用碱水法提取穿心莲内酯，还考察了不同浓度的碱水对穿心莲内酯的影响，结果选用０．０１％的碱水提取的穿心莲内酯含量最高，成本最低。酸、碱水法的最大缺点是ＰＨ不好控制而容易造成有效成分的损失。
１．４．６．３超声提取法金海英【２３】等将药材制成粗粉，加乙醇超声提取２次，加正己烷萃取后用中性
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氧化铝柱出去杂质。结果加快了溶出速率，提高了穿心莲内酯的浸出率，同时也保证了其稳定性。
１．４．６．４酶解前处理法
此方法是将酶作为浸提辅助剂，破坏植物细胞壁结构，提高提取效率。马桔云、吕芳、于喜水等ｏ”将传统的乙醇浸提工艺与纤维素酶解相结合对穿心莲进行提取，结果加酶组穿心莲内酯收率明显高于未加酶组，而且纤维素酶的加入对所提有效成分没有影响。
１．４．７有效成分纯化工艺研究进展
中药水提液中常含有淀粉、蛋白质、粘液质、色素、树胶、果胶等杂质，使制成的制剂服用量较大，并且影响液体制剂的澄明度，因此，在制备工艺中常采用一些精制方法来纯化中药制剂。通过查阅文献发现对穿心莲的研究中，对其药用成分的纯化研究比较少，研究工作大部分还处于穿心莲初提物的水平上，而新近发展起来的超临界流体萃取结晶法也有难于大规模应用于工业生产的缺点。１．４．７．１大孔树脂吸附法
大孔树脂是以苯大孔吸附树脂主要以苯乙烯、ａ一甲基苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯、丙腈等为原料加入一定量致孔剂二乙烯苯聚合而成，多为球状颗粒，直径一般在Ｏ．３—１．２５矾ｎ之间，通常分为非极性、弱极性和中极性，在溶剂中可溶胀，室温下对稀酸、稀碱稳定。从显微结构上看，大孔吸附树脂包含有许多具有微观小球的网状孔穴结构，颗粒的总表面积很大，具有一定的极性基团，使大孔树脂具有较大的吸附能力；另一方面，这些网状孔穴的孔径有一定的范围，使得它们对通过孔径的化合物根据其分子量的不同而具有一定的选择性。通过吸附性和分子筛原理，有机化合物根据吸附力的不同及分子量的大小，在大孔吸附树脂上经一定的溶剂洗脱而达到分离的目的。
（１）树脂结构的影响
大孔树脂的吸附性能主要取决于吸附剂的表面性质，即树脂的极性（功能基）和空间结构（孔径、比表面积、孔容），一般非极性化合物在水中可以为非极性树脂吸附，极性树脂则易在水中吸附极性物质
（２）被吸附的化合物结构的影响
一般来说，被吸附化合物的分子量大小和极性的强弱直接影响到吸附效果。同时，大孔树脂本身就是一种分子筛，可按分子量的大小将物质分离。（３）洗脱剂的影响
通常情况下洗脱剂极性越小，其洗脱能力越强，一般先用蒸馏水洗脱，再用浓度逐渐增高的乙醇、甲醇洗脱。多糖、蛋白质、鞣质等水溶性杂质会随着水流下，极性小的物质后下。对于有些具有酸碱性的物质还可以用不同浓度的酸、碱６
第１章引言
液结合有机溶剂进行洗脱。
（４）ｐＨ值的影响
中药中的许多成分有一定的酸碱性，在ｐＨ值不同的溶液中溶解性不同，在应用大孔树脂处理这一类成分时ｐＨ值的影响显得至关重要。对于碱性物质一般在碱液中吸附酸液中解吸，酸性物质一般在酸液中吸附碱液中解吸。但是也有的树脂在吸附某些物质的时候不受ｐＨ的影响。
（５）温度的影响
大孔树脂的吸附作用主要是由于它具有巨大的表面积，是一种物理吸附，低温不利于吸附，但在吸附过程中又会放出一定的热量，所以操作温度对其吸附也有一定的影响。
（６）原液浓度的影响
原液浓度也是影响吸附的重要因素，如果原液浓度过低提纯时间增加，效率降低；原液浓度过高则泄漏早，处理量小，树脂的再生周期短。但是树脂本身具有富集浓缩的作用，对于热不稳定性的水提有效成分，上柱前的浓缩反而会使有效成分损失。
（７）其它影响因素
药液在上柱之前一般要经过预处理，预处理不好则会使大孔树脂吸附的杂质过多，从而降低其对有效成分的吸附。洗脱液的流速、树脂的粒径、树脂柱的高度也会产生一些影响，通常较高的洗脱液流速、较小的树脂粒径和较低的树脂高度有利于增大吸附速度，但同时也使单柱的吸附量有所降低。玻璃柱的粗细也会影响分离效果，当柱子太细，洗脱时，树脂易结块，壁上易产生气泡，流速会逐渐降为零。
（８）大孔吸附树脂的预处理及再生
大孔树脂一般含有未聚合的单体、制孔剂、引发剂及其分解物、分散剂和防腐剂等脂溶性杂质，使用前应先预处理。一般选用甲醇、乙醇或丙酮连续洗涤数次，洗至加适量水至无白色浑浊现象，再用蒸馏水洗至无醇味即可。必要时还要用酸碱液洗涤，最后用蒸馏水洗至中性即可。树脂用久了吸附的杂质就会增多，降低其吸附能力，故使用一段时间后需要再生。树脂的再生通常可以用溶剂来实现，乙醇是常用的再生剂。采用８０％左右的含水醇、酮或含有酸、碱的含水醇、酮进行洗涤，再生效果也很好。
目前，大孔树脂作为一种有机高聚吸附剂，具有选择性吸附有机化合物的能力，可应用于皂苷１２５１、黄酮【２６１、葸醌【绷、生物碱【２８】、水溶性酚性成份１２９】及中药提取、分离及纯化。范云鸽、张秀丽【３０１等研究了大孔树脂提取纯化穿心莲内酯的方法，最后确定ＡＤＳ．７型大孔吸附树脂提取分离穿心莲内酯的效果最好。
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Ｉ．４．７．２超临界流体萃取结晶法
超临界流体（ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌｆｌｕｉｄ，ＳＣＦ）萃取结晶技术”“，是以ＳＣＦ为萃取剂和展开剂，在一定压力和温度下，ＳＣＦ与多组分溶液混合，在萃取的同时进行结晶分离，由于萃取、层析、吸附和重力沉降等作用使各溶质结晶析出，并在结晶器上呈梯度分布。其特点是动态的ＳＣＦ与静态的天然产物活性成分接触，形成的ＳＣＦ溶液遇到外界障碍物——结晶器的扰动、表面场效应，使各组分在其上结晶析出，并形成梯度分布；产生类似于以ＳＣＦ为展开剂的薄层层析效果，在结晶器的上部或下部可得到较高纯度的组分：同时缩短了分离纯化时间。张文成、潘见ｍ１等采用单因素试验法探讨超临界ＣＯ：梯度结晶压力、温度、时间对穿心莲内酯纯度的影响，并利用高效液相色谱进行纯度检测。结果表明，超Ｉ临界ｃ０：在萃取穿心莲内酯时，出现同步结晶，且在结晶板上呈梯度分布；选择较佳纯化工艺参数为压力２０ＭＰａ，温度５５。Ｃ，时间９０ｍｉｎ，Ｃ０２流量１５Ｌ／ｍｉｎ时，得到穿心莲内酯的纯度达到８０％以上。该技术的主要特点是提取率高、产品不含有害物质、无污染。但是由于超临界提取所需设备价格昂贵生产成本高，因此目前仍不能进行规模化生产。
１．４．８萜内酯提取纯化研究进展
由于穿心莲内酯的提取纯化研究比较少，本文综合比较了同为萜类内酯的其他物质比如银杏内酯、青蒿素、薏苡内酯等提取以及纯化方法，以探索穿心莲内酯提取纯化更好的途径。郝金玉、韩伟等【３３１利用间歇微波辐射提取黄花蒿中的青蒿素，结果表明，微波辅助提取比传统的索氏提取大大提高了提取速度，对青蒿素的提取率也高于超临界Ｃ０２法。此外，利用超声提取技术Ⅲ１，青蒿素的提取率可达至Ｕ９０％，提取时间却缩短到Ｏ．５～１小时。刘春兰、周宜军、周恒彦等ｐ５Ｊ利用内酯易溶于特定有机溶剂的特点，采用有机溶剂萃取和柱层析相结合的方法，对薏苡中有效成分薏苡内酯进行提取，结果发现，在层析的过程中改变溶剂的组成和比例，对内酯的提取有很大影响。王成章、郁青、谭卫红等１３６Ｊ采用不同溶剂对银杏叶进行萃取，实验表明内酯对不同的有机溶剂选择性逐次减小，通过调节ＰＨ，增加盐离子改变相密度等方法萜内酯的富集率可达３５０／ｒ，－４０％。何捃１３７１等用ＤＡ２０１型大孔吸附树脂对白果内酯进行纯化，结果只需要一次柱分离，结晶纯化就可制得９５％以上的白果内酯。卢锦花、胡小玲、岳红等ｐ酬采用吸附树脂精制银杏提取物，得到的银杏萜内酯不仅纯度高，产率高，而且产品安全，不存在重金属、有机溶剂残留等问题。
１．４．９定量测定方法研究进展
１．４．９．１薄层色谱扫描法（ＴＬＣＳ）８
第１章引言
王海龙…３等用双波长ＴＬＣＳ钡ＪＪ定消炎利胆片中穿心莲内酯的含量，波长２２５ｎｍ，结果穿心莲内酯含量线性范围２．０２～１０．１０嵋，平均加样回收率为９８．８６％，ＲＳＤ为０．５０％。王泽芳…１等采用ＴＬＣＳ澳Ｊ定消炎利胆片中穿心莲内酯的含量，样品以乙醇直接提取，氯仿一乙酸乙酯一甲醇（１０：ｌＯ：１）为展开剂，测定波长为２３５ｎｍ，平均回收率为１０２．５％，测定方法简便、准确、灵敏度高。李玲玲““等采用双波长ＴＬＣＳ对复方炎得平胶囊中穿心莲内酯的含量进行测定，应用硅胶ＧＦ。板，紫外灯下定位，避免显色所引起的误差，检测波长为２２３ｎｍ，平均加样回收率９７．１２％。
１．４．９．２高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）
本法对含穿心莲中成药的含量测定非常有效。赵庆华“２１等用ＨＰＬＣ法测定消炎利胆片中穿心莲内酯的含量，色谱条件为，流动相：甲醇一水（５０：５０），检测波长２２５ｎｍ．外标峰面积定量，进样量在２．０２～１０．１０９９范围内线性关系良好，平均加样回收率为１００．３０％，ＲＳＤ＝Ｏ．７３％。赵登飞“”等用ＨＰＬＣ法测定清火栀麦片中穿心莲内酯的含量，以甲醇：水（５０：５０，ｐＨ＝４．５）为流动相，检测波长为２２５ｎｍ，加样回收率为９８．４％，ＲＳＤ＝２．０３％。黄捷ｍ１等采用ＨＰＬＣ法测定清火栀麦胶囊中穿心莲内酯的含量并对其进行稳定性考察，紫外检测波长为２２５ｎｍ，加速稳定性试验环境：３９。Ｃ、相对湿度７５％，每月考核１次，放置３月，穿心莲内酯含量下降了约５０％。杨建国“”等用ＨＰＬＣ法，选用ｃ。。柱和甲醇一水为流动相，测定痢泻灵片中穿心莲内酯的含量，穿心莲内酯的线性范围为ｌＯ～ｌｏｏｕ∥１１ｌｌ，变异系数＜２．３％。傅欣彤“”等采用ＨＰＬＣ法，外标法计算．测定粉刺水中穿心莲内酯的含量，ＹＷＧ－Ｃ。。柱，检测波长为２２５ｎｍ，甲醇～水（３８：６２）为流动相，平均回收率为９８．４２％，ＲＳＤ为ｌｒ６９％。
１．４．９．３电位滴定法
韦娟“７’等采用剩余碱水解一电位滴定法测定复方穿心莲片中穿心莲总内酯的含量，结果平均回收率为９６，９３％，ＲＳＤ为２．２４％（ｎ＝５）对于颜色较深的提取液，本法不受溶液的颜色和浑浊的限制。
１．４．９．４化学发光法
本法适应临床药学中研究穿心莲内酯的血药浓度。汪宗琪“”等用间接化学发光法监测兔血中穿心莲内酯的血药浓度，利用穿心莲内酯结构中羟基能被氧化的特点，将过氧化氢氧化穿心莲内酯的氧化还原反应与Ｌｕｍｉｎｏｌ－Ｈ。０２－Ｃ０：化学反应相偶合，实现了对免血中穿心莲内酯的定量监测，还采用高灵敏的有机偶合化学发光法对穿心莲内酯的血药浓度进行监测，求出系列药动学参数。
本实验采用２００５版药典规定之穿心莲内酯含量的检测方法即高效液相色谱分析方法作为实验中所有内酯含量测定的方法。
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１．５研究目标
穿心莲制剂以其卓越的抗炎抗菌等功效，一直是抗病毒类首选药物之一。特别是鱼腥草制剂由于不良的临床反应于２００５年被国家禁止使用以来，穿心莲制剂的需求被进一步放大。但是通过对国内外穿心莲提取、纯化以及ｌ临床使用反应的研究，我们发现，穿心莲的研究也存在着诸如提取时间长、提取率比较低；对有效成分的应用还基本停留在粗提物的阶段，纯化效率比较低；对药材原材料使用率低以及临床使用上也发现了一些不良反应“”“”１，而这些不良反应从另一个角度也说明了穿心莲药物制剂的纯化工作有待完善。所以，本课题利用目前在中药提取纯化领域应用效果很好的先进方法，通过实验，以２００５年版中国药典规定的高效液相色谱法为定性和定量检测方法，以穿心莲内酯的提取率以及纯度为考察指标，以期探索出提高穿心莲内酯提取率以及纯度的提取、纯化工艺。１．６论文的课题来源和主要成果
本论文的课题来源为自选课题，试验在研究生经费和导师大力支持下，在成都理工大学测试楼实验室和成都理工大学理化楼高效液相色谱实验室完成。研究成果为：试验探讨出将中药提取新技术酶解前处理超声波提取法应用于穿心莲药材中有效成分穿心莲内酯的提取工艺中的各个因素对内酯提取率的影响大小为乙醇浓度＞提取温度＞料液比＞提取时间，酶解前处理过程对穿心莲内酯提取率影响的因素大小顺序为：酶解时间＞酶解ｐＨ＞加酶量＞酶解温度。提取较优的工艺条件为：当温度为５０＂Ｃ，每５０９穿心莲加入１３００ｕ的纤维素酶，控制酶解环境ｐＨ＝４左右，酶解１００ｍｉｎ后将酶解液滤过，往滤渣中加入浓度为７５％，体积为原料ｌＯ倍的乙醇超声提取２０ｍｉｎ，使穿心莲内酯的提取率从传统浸渍提取的５０％左右提高到了９８％左右，提取时间也从４天缩短到了９０ｍｉｎ。论文还确定了最佳的吸附工艺条件为：吸附流速为１ＢＶ，ｌｌ，上柱液不调节ｐＨ，试验在室温下完成。在最佳吸附工艺条件下，树脂对穿心莲提取液的处理量大约达到树脂体积的２ｌ倍，２２ＢＶ流出液内酯泄漏率达到９．７７％，所以从２２ＢＶ开始停止对上柱液进行吸附。此时其有效吸附量为１３．４２ｍｇ／ｍｌｖ－，内酯得率为９０．２５％
最佳解吸工艺条件为：６０％ｐＨ＝５的乙醇，解吸流速为３ＢＶ／ｈ，解吸率为８４．９５％。在上述工艺条件下，提取液的干膏收率由纯化前的８．９１％降低到３％，而穿心莲内酯的纯度由纯化前２４．９８％提高到了６５％，本纯化工艺的内酯保留率为８５％以上，解吸实验在常温下进行，可见该纯化工艺在有效保留穿心莲内酯的同时，可以显著降低固型物得率，提高制剂的载药量。１０
第２章实验材科与方法
第２章实验材料与方法
２．１实验仪器以及材料
２．１．１主要仪器
Ｒ－２０１型旋转蒸发仪（上海申胜生物技术有限公司）；
高效液相色谱仪（日本岛津，ＳＨＩＭＡＤＺＵ，带光电二级管阵列检测器）；
超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司，ＫＱ５２００ＤＢ型数控）：
微型植物式样粉碎机（河北黄液市中兴仪器有限公司）；
恒温水浴锅，分析天平等
２．１．２材料试剂
穿心莲全草（购于成都市五块石中药市场）；
穿心莲内酯对照品（购于成都市药监所）
ＹＷＤ０７Ｄ大孔树脂（型号：Ｄ１０１
Ｄ．１６０Ｘ一５ＤＡ２０１－ＢＨＰＤ－４５０ＨＰＤ・６００Ｄ２９６）
乙醇（分析纯）、甲醇（色谱纯）、甲醇（分析纯）等
２．２检测方法
２．２．１高效液相色谱的检测原理
高效液相色谱检测法是用特制微粒充填的层析柱作为固定相，通过高压使液体流动相快速通过层析柱而达到快速有效分离液相中各种物质，通过对特定化学成分的特征峰的分析，定性以及定量检测特定化学物质。具有速度快，检测灵敏度高等特点，典型的高效液相色谱仪包括输液系统、进样分离系统、检测系统和数据处理系统等部分。用高压泵输入流动相；迸样可以是注射器进样，也可以是进样阀进样；检测器应用最多的是紫外或紫外一可见分光检测器，还有荧光检测器、示差检测器和电化学检测器等。
２．２．２色谱条件
色谱柱：ＫｘｏｓｍｏｓｉｌＣｌｓ
流动相：甲醇一水（５０：５０）
流速：０．６ｍｌ／ｍｉｎ检测波长：２２５ｎｍ
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柱温：室温
进样量：１０ｕＩ
２．２．３线性关系
精密称取约２５ｍｇ穿心莲内酯标准品于５０ｍｌ容量瓶中，用７５％乙醇稀释至刻度，再分别吸取２ｍｌ，４ｍｌ，６ｍｌ，８ｍｌ，ｌＯｍｌ于１０ｍｌ容量瓶中，定容，过滤头过滤取续滤液进样１０｜ｌ１，以峰面积为纵坐标，进样品浓度为横坐标做图，绘制标准曲线。其回归方程为：ｙ＝１７３７７２ｘ＋５９７６１，Ｒ２：ｏ．９９６８，线性关系良好。
器
甚１２００００
掌
１０００００
Ｂｏｏｏｏ
６００００
４００００
２００００
０
６ｌＯ进样体积ｕｌ
图２－２穿心莲内酯ＨＰＬＣ检测标准曲线
２．２．４精密度试验
在选定的色谱条件下，用１００ｐ咖ｌ的穿心莲内酯对照品溶液连续进样５次，按峰面积计算出ＲＳＤ。
２．２．５重复性试验精密称取穿心莲粉末５份，按供试品溶液制备方法处理后，记为ｌ・５号溶液，
第２章实验材料与方法
分别进样１０ｕｌ，在选定色谱条件下，测得相应峰面积，计算ＲＳＤ。
表２－２重复性实验结果
２．２．６稳定性试验
量取１号溶液，在选定色谱条件下，分别在４，８，１２，２４，４８ｈ进样，测定峰面积，结果表明，在常温下，４８ｈ内穿心莲内酯色谱峰面积无明显改变，溶液中穿心莲内酯含量稳定。表２－３稳定性实验结果
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第３章穿心莲内酯的提取纯化工艺研究
本课题主要对穿心莲中主要成分穿心莲内酯的提取以及提纯工艺加以研究，旨在提高穿心莲内酯的收率以及纯度。
３．１工艺路线的设计
根据穿心莲内酯的理化性质以及提取纯化的研究现状，为了最大限度地提高内酯的提取率和纯度，本文研究和应用了酶解前处理以及超声辅助提取相结合，同时采用大孔树脂对提取的内酯进行纯化处理，具体的工艺路线如图２一ｌ。
液
浓缩，干燥
１４
第３章穿心莲内酯的提取纯化工艺研究
图３－１穿心莲提取纯化工艺路线
３．２药材鉴别
３２．１浸出物含量测定
按照中国药典２００５年版穿心莲鉴定项下之规定，取穿心莲粉末５０９，精密称定，置于１００ｍｌ锥形瓶中，精密加７５％乙醇５００ｍｌ，称定重量，静置ｌ小时以后，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并且保持微沸１小时，放冷后，取下锥形瓶，密塞，再称定重量，用７５％的乙醇补足减失的重量，摇匀，用干燥滤器滤过，精密量取滤液１００ｍｌ，置已经干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干以后，于１０５℃干燥３小时，置于干燥器中冷却３０ｒａｉｎ，迅速精密称定重量，计算出热浸法条件下药材的浸出率，重复三次，计算平均值以及ＲＳＤ％。
表３－１热浸法鉴别药材浸出物
３．２．２穿心莲全草中内酯总含量测定
本实验中穿心莲药材中内酯理论含量以对药材采用传统浸渍工艺过度提取的含量为标准。具体方法为称取穿，ｔＬ，莲粉末５０９三份，加５００ｍ１７５％乙醇浸渍４天，至内酯基本提取完全。
表３－２穿心莲全草中内酯含量以及出膏率
３．３穿心莲内酯超声提取工艺条件筛选
３．３．１提取次数对提取率的影响
精确称取５０９穿心莲粉末４份，加５００ｍ１７５％乙醇适当浸泡，分别超声提取２０分钟１次、２次、３次、４次，多次提取的合并滤液，浓缩，定容于５０ｍｌ量瓶１５
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中，吸取ｌｍｌ于１０ｍｌ量瓶中定容，过滤后进样，测定峰面积，计算穿心莲内酯浓度，从而计算提取率。
表３－３提取次数对提取率的影响
图３－２提取次数对提取率的影响
提取两次滤液中含量与一次提取相比明显提高，而３次提取含量略有上升，４次提取基本已经没有改变，从实验成本以及时间考虑，提取两次比较合理。３．３．２乙醇浓度对提取率的影响
精确称取５０９穿心莲粉末，分ｌｌ：ＩＩ５００ｍ１３５％、５５％、７５％．９５％的乙醇适当浸泡约ｌＯ分钟，置于超声清洗器中超声提取２０分钟，提取两次合并滤液，浓缩后定容于５０ｒａｌ量瓶中，取ｌｍｌ定容于ｌＯｍｌ量瓶中，进样１０ｐｌ。
表３－４乙醇浓度对提取率的影响
由于穿心莲内酯为脂溶性成分，随着乙醇浓度的增加，内酯的提取率也有所增１６
第３章穿心莲内酯的提取纯化工艺研究
加，７５％以后内酯的提取率增加幅度不大，考虑到实验成本，采用７５％为最佳提取浓度。
图３－３乙醇浓度对提取率的影响
３．３．３料液比
称取药材粉末５０９，分别加入８、１０、１５、２０倍药材量的７５％乙醇适当浸泡约１０分钟，置于超声清洗器中超声提取２０分钟，提取两次合并滤液，浓缩后定容于５０ｍｌ量瓶中，取ｌｍｌ定容于ｌＯｍｌ量瓶中，进样１０ｐｌ。表３－５料液比对提取率的影响
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ｘ１００
：９０
默８０
耄７０
６０
５０
４０
３０
２０
１０
０
图３－４料液比对提取率的影晌
料液比为ｌＯ倍以上后内酯含量变化不大，而且料液比增大不仅消耗溶剂，在浓缩合并的滤液时内酯也容易有一定程度的损失，所以１０倍料液比比较合理。３３．４温度
取５０９药材粉末，加入５００ｍ１７５％的乙醇，浸泡约１０分钟，分别在３０、４０、５０、６０＂Ｃ下超声提取２０分钟，提取两次合并滤液，浓缩后定容于５０ｍｌ量瓶中，取Ｉｍｌ定容于ｌＯｍｌ量瓶中，迸样１０ｕｌ。
表３－６温度对提取率的影响
：Ⅲ
罄９０
譬８０
震７０
６０
５０
４０
３０
２０
１０
０｜－一
６０温度／＇Ｃ
图３－５温度对提取率的影响１８
第３章穿心莲内酯的提取纯化工艺研究
随着温度的提高，内酯的提取量也增大，但是温度达到５０＂Ｃ以后，内酯含量开始有所下降，因为内酯是不耐热成分，虽然温度提高加快了成分的溶出，但其在越来越高的温度下也会有所损失，不过内酯含量波动不大，还是比较稳定。３．３．５提取时间
取ｓｏｇ药材粉末，加入５００ｍ１７５％的乙醇，浸泡约１０分钟，在室温下分别超声提取１０分钟，２０分钟，３０分钟，４０分钟，提取两次合并滤液，浓缩后定容于５０ｒａｌ量瓶中，取ｌｍｌ定容于ｌＯｍｌ量瓶中，进样１０ｕｌ。（未加热）
穿心莲内酯随着超声波提取的延长而逐渐增加，但增加地越来越缓慢，超声提取３０ｍｉｎ以后，再延长提取时间提取率增加比较小，从试验工作效率考虑，３０ｒａｉｎ为比较佳的超声提取时间。
表３－７提取时间对提取率的影响
１０２０３０４０提取时Ｎ／ｍｉｎ
图３－６超声时间对提取率的影响
３．３．６正交试验
由正交实验分析分析得，影响穿心莲内酯提取率的因素大小顺序为：乙醇浓度＞提取温度＞料液ＬＣ＞提取时间。由正交表中可得超声提取较优的工艺条件１９
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为：Ａ。Ｂ：Ｃ：Ｄ。即最佳提取工艺为：提取温度控制在５０℃左右，加原料的１０倍乙醇为提取试剂，乙醇的浓度为７５％左右，超声提取时间为２０ｍｉｎ。
表３－８正交因素水平表
表３－９Ｌ。（３４）的正交设计
第３章穿心莲内酯的提取纯化Ｔ艺研究
注：Ｆｏ０９２）－１９．００，Ｆｏｉｏ＜２）＝９．００，Ｆ０２５口）－３．００，Ｆｏｉｏ＞Ｆ＞Ｆ０２５，该因素对指标有一定影响，记为△＇Ｆｏ．０５＞Ｆ＞Ｆｏｌｏ，该因素对指标有显著影响，记为・．
３．４纤维素酶解前处理工艺条件筛选
实验步骤：取５０９干燥穿心莲粉末，加入５００ｍ１７５％乙醇充分浸润，纤维素酶解后按照常规的超声波提取方法提取穿心莲内酯，考察不同的因素对提取率的影响。
３．４．１加酶量的影响
取５０９穿心莲粉末，不改变穿心莲乙醇浸润溶液的ｐＨ值（即ｐＨ＝５．５—６）以及常温条件下，分别加入６００、９００、１２００、１８００Ｕ酶解９０ｍｉｎ，然后超声提取３０ｍｉｎ，提取２次，合并滤液，浓缩后定容于５０ｍｌ量瓶中，取ｌｍｌ定容于１０ｍｌ量瓶中，进样１０ｕｌ。
表３－１１加酶量对内酯提取率的影响２１
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芝１００
＊
群９０
嚣００
最Ｔ０
６０
５０
４０
３０
２０
ｉ０
Ｏ
１２００１８００加酶量儿
图３－８纤维素酶用量对提取率的影响
随着纤维素酶的增加，植物中结构致密的细胞壁逐渐被水解，明显增加了内酯的溶出量，但是达到饱和后内酯浓度已经基本不再增加。
３．４．２酶解温度的影响
取５０９穿心莲粉末，不改变穿心莲乙醇浸润溶液的ｐＨ值（即ｐＨ＝５．５－６），加入１２００Ｕ在３０、４０、５０、６０＂Ｃ条件下酶解９０ｍｉｎ，然后超声提取３０ｍｉｎ，提取２次，合并滤液，浓缩后定容于５０ｒａｌ量瓶中，取Ｉｍｌ定容于ｌＯｍｌ量瓶中，进样１０ｐｌ。
随着温度的升高，酶分子的热运动加快，增加了与植物细胞壁的碰撞，从而增加了内酯的提取率，但是温度超过５０＇ｃ以后，过高的温度反而使酶分子变性失活，影响了内酯的提取。表３—１２酶解温度对内酯提取率的影响
第３章穿心莲内酯的提取纯化１＝艺研究
图３－９酶解温度对提取军的影响
３．４．３酶懈时间的影响
取５０９穿心莲粉末，不改变穿心莲乙醇浸润溶液的ｐＨ值（即ｐＨ２５．５・６），加入１２００Ｕ在５０。Ｃ条件下酶解６０、９０、１２０、１５０ｒａｉｎ，然后超声提取３０ｒａｉｎ，提取２次，合并滤液，浓缩后定容于５０ｍｌ量瓶中，取ｌｍｌ定容于１０ｍｌ量瓶中，进样１０ｐｌ。
表３—１３酶解时间对提取率的影响
水
＊
并
裂
船
罡Ｏ
１５０酶解时甸Ａｉｎ
图３－１０酶解时间对提取率的影响
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延长酶解时间有利于纤维素酶与药材充分反应，提高有效成分的溶出，但是酶解９０ｒａｉｎ以后再延长时间，提取率变化基本不大。
３．４．４酶解ｐＨ的影响
取５０９穿心莲粉末，３０ｎＡ．１２００Ｕ在５０＂Ｃ以及不同的ｐＨ条件下酶解９０ｍｉｎ，然后超声提取３０ｒａｉｎ，提取２次，合并滤液，浓缩后定容于５０ｒａｌ量瓶中，取ｌｍｌ定容于１０ｍｌ量瓶中，进样１０Ｈｌ。
表３－１４酶解ｐＨ对内酯提取率的影响
；１００
崩９０
嚣８０
Ｅ７０
６０
５０
●Ｏ
３０
２０
１０
Ｏ
６酶解ｐＨ
图３－１１ｐＨ对提取率的影响
表格中ｐＨ为６一项为没有改变提取环境的原有ｐＨ，可见在ｐＨ为４这样的酸性环境中，纤维素酶的活性最高，内酯的提取最为完全，而且在ｐＨ为３－５的环境中，穿心莲内酯的稳定性也是最好的，所以酶解的最佳ｐＨ为４左右。３．４．５正交分析表３．１５正交冈素水平表
第３章穿心莲内酯的提取纯化Ｔ艺研究
表３－１６Ｌ．（３４）的正交设计
表３－１７正交试验方差分析
：Ｆｏｏｓ（２）＝１９．００，Ｆｏｌ啦产９．００，Ｆ０２５（２）－３．００，Ｆｏｉｏ＞Ｆ＞Ｆｏ２５，该因素对指标有一定影响，记为△，Ｆｏ．０５＞Ｆ＞Ｆｏ．１０，该因素对指标有显著影响，记为・。
由正交实验分析分析得，酶解前处理过程对穿心莲内酯提取率影响的因素大２５
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小顺序为：酶解时间＞酶解ｐＨ＞加酶量＞酶解温度。由正交表中可得酶解前处理的最佳工艺条件为：Ａ。Ｂ。Ｃ。Ｄ。即最佳提取工艺为：酶解温度控制在５０＂Ｃ左右，每５０９穿心莲粉末｝ＪＩ／Ｘ．１３００Ｕ的纤维素酶，控制酶解ｐＨ为４左右，酶解１００分钟。３．５验证实验
称取５０９穿心莲粉末，按最佳酶解条件以及最佳超声波提取条件，分别进行３次平行实验，考察最佳提取工艺的稳定性以及可行性，并与传统浸渍工艺进行比较。
表３－ｔ８验证实验结果
试验结果表明，该试验结果稳定，结合最佳酶解工艺条件以及最佳超声提取工艺条件，穿心莲内酯的提取率达到了９８％左右，基本达到了传统浸渍提取方法的２倍，并且时间大大缩短，提高了提取工艺效率。
３．６小结
１．通过超声波提取与传统常规浸渍提取比较，超声提取２０ｒａｉｎ，穿心莲内酯的提取率达到６０％以上，与文献中ｆＪ删提到的传统浸渍方法比较，提取时间从４天左右缩短到了２０分钟，而内酯的提取率也从最高５０％左右提高到了７９．８４％。
２．通过单因素和正交实验考察超声时间、温度、料液比以及乙醇浓度等因素对穿心莲内酯提取率的影响，发现影响内酯提取率的因素大小顺序为：乙醇浓度＞提取温度＞料液比＞提取时间，即提取温度控制在５０℃左右，加原料的１０倍乙醇为提取试剂，乙醇的浓度为７５％左右，超声提取时间为２０ｍｉｎ。
３．通过单因素和正交实验考察酶解时间、酶解温度、酶解ｐＨ以及加酶量等因素对穿，Ｄ莲内酯提取率的影响，发现影响内酯提取率的因素大小顺序为：酶解时间＞酶解ｐＨ＞）ＪＲ酶量＞酶解温度。由正交表中可得酶解前处理的最佳工艺条件为：Ａ３Ｂ。Ｃ：Ｄ２，即最佳提取工艺为：酶解温度控制在５０＂Ｃ左右，每５０９穿心莲粉末加入１３００Ｕ的纤维素酶，控制酶解ｐＨ为４左右，酶解１００分钟，滤过以后加原料的１０倍乙醇为提取试剂，乙醇的浓度为７５％左右，超声提取时间为２０ｍｉｎ，提取２次。３．未加酶解的超声提取的穿心莲内酯的提取率为７９．８４％，出膏率为７．４３％，酶
第３章穿心莲内酯的提取纯化工艺研究
解超声提取的穿心莲内酯的提取率达到９８．０９％，出膏率为８．９１％，与酶解前相比，内酯提取率有明显的提高，而出膏率并没有明显的增加，即药材中的水溶型杂质基本没有被提取出来，对后续的纯化工艺没有大的影响。
３．７大孔树脂纯化工艺研究
３．７．１树脂筛选
为了筛选出最佳的穿心莲内酯的吸附树脂，首先对国内外几种常见的大孔树脂进行静态吸附，选出具有比较高的吸附容量的树脂。
表３－１９８种大孔树脂的结构参数
３．７．１．１树脂的前处理
用９５％的乙醇浸泡２４ｈ，再用蒸馏水洗涤至无醇，５％的ＨＣｌ以及４％的ＮａＯＨ浸泡４ｈ，再用蒸馏水洗涤至中性，备用。
３．７．１．２大孔树脂再生实验
将使用过后的树脂采用ｌｍｏｌ／１的盐酸和ｌｍｏｌ／１的氢氧化钠溶液交叉洗涤树脂２—３次，再用无水乙醇洗涤，最后采用蒸馏水洗涤至无醇昧后重复使用，考察树脂的吸附和解吸效果，结果如表１７所示。
表３－２８大孔树脂再生实验如表所示，ＤＡ２０１一Ｂ型大孔树脂具有良好的重复使用性，经过４次左右的重
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复使用，吸附容量和解吸率并没有明显的下降，可以重复使用多次
３．７．１．３树脂的吸附容量
精确量取各种树脂５ｍｌ，分别加入５０ｍｌ内酯含量为１．４７７ｍｇ／ｍｌ的提取液，常温下置于水浴振荡器中振荡２４ｈ，测定提取液中剩余的内酯含量，计算树脂的吸附量。
静态吸附实验结果表明，ｘ．５，ＤＡ．２０１一Ｂ以及Ｄ２９６三种树脂的吸附容量相对比较大，选这三种树脂，考察其解吸能。
表３－２０树脂的吸附容量
３．７．１．４树脂的解吸率
将此三种吸附饱和的湿树脂分别加入５０ｍｌ的５５％的乙醇，常温下于水浴振荡器中振荡解吸２４ｈ，测定解吸附溶液中内酯的含量，从而确定树脂的解吸率。
表３－２１三种树脂的解吸率
可见，在相同条件下，Ｄ２９６树脂基本不能解吸下来，ｘ．５树脂只能够解吸５０％左右的内酯，具有最佳的吸附以及解吸效果的是ＤＡ２０１．Ｂ型树脂。３．７．２树脂吸附条件筛选
３．７．２．１吸附流速
精确量取ＤＡ２０１．Ｂ型５ｍｌ湿树脂，湿法装柱。取浓度为１．４８７ｍｇ／ｍｌ的穿心莲提取液为上柱液，提取液通过树脂柱流速分别为１ＢＶ／ｈ，２ＢＶ／ｈ，３ＢＶ／ｈ，分批收集流出液，每１０ｍｌ为一份，测定流出液中穿心莲内酯的浓度。计算出流出液中内酯的泄漏率，选择最佳的吸附流速。
可以看出，在其他条件相同的情况下，比较低的上柱液流速有利于目标成分在树脂中充分进行粒扩散和膜扩散，从而使树脂吸附能力提高，流速为１ＢＶ／ｈ时，树脂吸附效率明显优于高流速的吸附效率，从１８ＢＶ流出液开始，穿心莲内酯开始泄漏，２２ＢＶ流出液内酯泄漏率达到９．７７％，所以从２２ＢＶ开始停止对上
第３章穿心莲内酯的提取纯化Ｔ艺研究
柱液进行吸附，对吸附饱和的树脂再进行解吸。此时树脂有效吸附量为１３．４２ｍｇ／ｍｌ删＿，内酯得率为９０．２５％。所以１ＢＶ／ｈ为比较适宜的吸附流速。
表３－２２吸附流速对树脂吸附的影响
女》苴竖盔霍∞∞鲫
加∞∞们∞加∞ｏ
０５１０１５２０２５３０３５４０
流出液体积／ＢＹ
Ｅ至亟正三夏巫三三亘圈
图３—１２上柱液流速对树脂吸附的影响
３．７．２．２上柱液ｐＨ
以浓度为１．４５５ｍｇ／ｍｌ的提取液为上柱液，分别调节ｐＨ为５、６（不调）、７、
堕塑墨三查兰堡主兰竺丝兰
８，以１ＢＶ／ｈ的流速上柱，操作同上。
表３－２３不同ｐＨ流出液体积与内酯泄漏率的关系
堕些鎏堡塑！坠
ｐＨ＝５
！
！
０２２８．９８２０２２９．７７２Ｏ２２２１．５０
！
０２４１８．３６４０２４２０．０５４Ｏ２４３６．７１４０２４
！
０
！
０
！！
０
！！
０
！！
０
！！
０
！！
０
泄漏率／％０流出液体积／Ｂｖ泄漏率／％流出液体积／ＢＹ
２０２．７９０
６Ｏ
８０
１０１２０
１４Ｏ
１６Ｏ
１８１．５３
泄漏率／％０
ｐＨ－－６
’
０
流出液体积／ＢＹ泄漏率／％流出液体积／ＢＹ
２０５．２３０
６０
８Ｏ
１００
１２０
１４０
１６４．１３
１８８．８３
泄漏率／％０
ＤＨ＝７
‘
流出液体积／ＢＹ泄漏率／％流出液体积／ＢＹ
２０１２．０５０
２
Ｏ２２
６０
８０
１００
１２３．９４
１４１２．４５
１６２５．５２
１８５１．６７
泄漏率／％０
ＰＨ＝８
’
流出液体积／Ｂｖ
２０
鲨塑兰生笪：兰：！：：！：！：竺
一＼昔睡毫龉墨
０
５
１０
１５
２０
２５
３０
Ｅ巫三亚五至圈
图３．１３
ｐＨ对树脂吸附的影晌
３０
童出液体积／ＢＶ
ｐＨ对树脂吸附影响比较大，在弱酸性环境下，树脂吸附效率优于中性和碱性环境，如图３—１３所示，ｐＨ＝８时，穿心莲内酯从第１２份流出液开始即开始大
第３章穿心莲内酯的提取纯化工艺研究
量泄漏，而ｐＨ＝５时，内酯从第２０份才开始出现泄漏，由于ｐＨ＝５与穿心莲提取
液自身酸碱度很接近，而调节ｐＨ又很容易引起内酯的损失，所以上柱液不调节
ｐＨ。
３．７，３树脂洗脱条件筛选
３
７．３．１洗脱液浓度的选择
采用静态洗脱的方法，考察５０％、６０％、７０％、８０％、９０％的乙醇对内酯的
静态洗脱效果筛选比较好的洗脱液浓度。用已经吸附饱和的ＤＡ２０１．Ｂ型湿树脂５ｍｌ，其吸附量为１３．７８ｍｇ／ｍｌ＿树庸，加入不同浓度的乙醇５０ｍｌ，常温下置于水浴振荡器中２４ｈ，测定解吸液中内酯的含量。
表３－２４不同浓度的乙醇的静态解吸
可见，６０％浓度的乙醇对内酯的解吸率最高，而且综合经济成本等因素考虑，采用６０％的乙醇作为最佳的洗脱溶剂。３．７．３．２洗脱液的ｐＨ
选用已经吸附饱和的ＤＡ２０１．Ｂ型湿树脂５ｍｌ，其吸附量为１３．７８ｍｇ／ｍｌｗ＿，
分别加入ｐＨ＝４、５、６、７的６０％乙醇５０ｍｌ静态解吸，计算解吸率。
由于在碱性环境中，穿心莲内酯很不稳定，本实验考察酸性环境和中性环境对洗脱效果的影响，由静态洗脱实验可见，酸性条件下解吸率明显高于碱性条件下的解吸率，综合考虑采用ｐＨ＝５，６０％的乙醇作为穿心莲内酯的洗脱剂。
表３－２５不同ｐＨ的乙醇对树脂的解吸影响
３．７．３．３洗脱液流速的选择
６０％７，醇分别以３ＢＶ／ｈ，４ＢＶ／ｂ＿，５ＢＶ／ｈ的速度通过吸附量为１３．４２ｍｇ／ｍｌ－村－
树脂柱，每５ｍｌ为一份收集流出液，测定内酯含量，绘制树脂动态解吸曲线，选择最佳解吸流速。
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表３．２６不同洗脱液流速下流出液体积与内酯含量的关系
流出体积／ｍｌ
内酯浓度／ｍｇ・ｍｌ‘１
３ＢＶ／ｈ
５
１０
１５
２０
２５
３０
３５
４０
０．０５０．８３６．１７３．２５
１．０８０．０２
０
０
解吸率，％累计解吸率，％内酯浓度／ｍｇ・ｍｌ’１
Ｏ．３７６．１８４５．９９２４．２２８．０５Ｏ．１５
０．３７６．５５５２．５３７６．７５８４．８８４．９５
０．０４０．３６４．２２
３．３０２４．６０
１．３３０．５２０．０２
４ＢＶ／ｈ
解吸率，％累计解吸率，％内酯浓度／ｍｇ・ｍｌ。１
０．３０２．６８３１．４５
９．９１３．８７０．１５
０．３０２．９８３４．４３５９．０３６８．９４７２．８１７２．９６
Ｏ．Ｏｌ０．０６０．４５０．５２
０．５６４．１７４．６９
２．００１４．９０
３．２６２４．２９４３．８８
２．２０
１６．３９６０．２７
１．２０８．９４６９．２１
０．２６１．９４７１．１５
５Ｂｖｍ
解吸率，％０．０７累计解吸率，％
０．０７
１９．５９
甲１０
一
手
∞
Ｅ
９
型嶷船墨子餐丑赠
８
７
６５４３２１Ｏ０
１０
２０
３０
４０
５０流出液体积／ｍ１
图３—１４流速对树脂解吸的影响
如３—１４所示，低流速有利于穿心莲内酯的解吸，当解吸液流速为３ＢＶ／ｈ时，内酯被集中解吸于第５－－３０ｍｌ解吸液中，其中内酯平均浓度为１．９０ｍｇ／ｍｌ。ｌＯｍｌ．２０ｍｌ流出液中内酯最为集中，内酯平均浓度为２．５６ｍｇ／ｍｌ，所以建议收集
此区问的流出液作为富集液。
３２
第３章穿心莲内酯的提取纯化工艺研究
３．７．４验证实验
称取穿心莲１５０９，根据最佳提取工艺以及纯化工艺，上柱前后分别测定内酯
含量以及固形物得率，考察大孔树脂纯化工艺的实际效果。实验数据如表３—２７。
表３－２７大孔树脂纯化工艺
３．７．５穿心莲提取溶液纯化前后ＨＰＬＣ图谱对比
图３—１７穿心莲内酯标准品ＨＰＬＣ色谱图
…■……＿‘～
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图３—１８穿心莲药材提取液ＨＰＬＣ色谱图
…Ｊ～＾＿…＿＿～
图３—１９穿心莲纯化液ＨＰＬＣ色谱图
由穿心莲内酯标准品ＨＰＬＣ色谱图可以看到，穿心莲内酯在本实验色谱条件下，保留时间为４ｍｉｎ左右。穿心莲提取液以及纯化液在相同系统和色谱条件下，特征峰在相同保留时间出现，可以确定为穿心莲内酯。通过比较可以看出，大孔树脂在本实验条件下对穿心莲内酯提取液有着很好的纯化效果。通过大孔树脂纯化以后的穿心莲内酯纯度得到提高。
３．８小结
（１）通过对８种不同类型的大孔树脂进行静态和动态吸附实验，研究发现，ＯＡ２０１一Ｂ型大孔树脂为纯化穿心莲内酯的最佳树脂，吸附容量达到了１３．７８ｍｇ／ｍ１湿树脂。
（２）通过树脂动态吸附实验考察了吸附流速、解吸流速、上柱液ｐＨ、洗脱液浓度等因素对吸附效果的影响，最终确定最佳的吸附工艺条件为：吸附流速为１ＢＶ＆上柱液不调节ｐＨ，在最佳吸附工艺条件下，树脂对穿心莲提取液的处理量大约达到树脂体积的２ｌ倍，２２ＢＶ流出液内酯泄漏率达Ｎ９．７７％，所以从２２ＢＶ
开始停止对上柱液进行吸附，此时树脂有效吸附量为１３．４２ｍｇ／ｍｌ＝＊＿，内酯得率
为９０．２５％。最佳解吸工艺条件为：６０％ｐＨ＝５的乙醇，解吸流速为３ＢＶ／ｈ。解吸率
为８４．９５％。
（３）研究结果表明：在最佳工艺条件下，穿心莲提取液的出膏率从纯化前的８．９１％左右降低到３％，而提取液中的穿心莲内酯的纯度则大大提高，从纯化前的２４．９８％左右提高到了６５％，可见该纯化工艺在有效保留穿心莲内酯的同时，可以显著降低固型物得率，提高制剂的载药量。
结论
结论
本论文按照２００５年版中国药典的标准，以穿心莲全草中穿心莲内酯为检测指标，以内酯的提取率以及纯度为评价标准，对穿心莲药材的提取纯化工艺做了比较系统的研究，得出的结论如下：
（１）本论文以乙醇为提取溶剂，以穿心莲内酯的提取率以及出膏率为评价指标，实验比较了酶解前处理和超声波辅助提取与传统的浸渍工艺对穿心莲内酯的提取效果，实验表明，对原料进行纤维素酶解前处理，采用超声波提取的方法，可大幅度提高穿心莲内酯的提取率，当温度为５０℃，每５０９穿心莲加，Ｋ１３００Ｕ的纤维素酶，控制酶解环境ｐＨ＝４左右，酶解１００ｍｉｎ，将酶解液过滤后在滤渣中加入体积为滤渣１０倍的浓度为７５％的乙醇超声提取２０ｍｉｎ，穿心莲内酯的提取率达到９８％。
（２）采用大孔树脂纯化穿心莲提取液中的内酯，通过对ＤＡ２０１－Ｂ、Ｘ－５、Ｄ２９６等８种不同类型的大孔树脂进行静态和动态吸附实验，确定采用ＤＡ２０１一Ｂ型树脂为纯化内酯的最佳树脂，通过对上柱液流速、ｐＨ和解吸液的浓度、流速等因素的考察，确定最佳吸附工艺为：吸附流速为ＩＢＶ／ｈ，不调节上柱液的ｐＨ，试验在室温下完成，在最佳吸附工艺条件下，树脂对穿心莲提取液的处理量大约达到树脂体积的２１倍，２２ＢＶ流出液内酯泄漏率达到９．７７％，所以从２２ＢＶ开始停止对上柱液进行吸附，此时树脂有效吸附量为１３，４２ｍｇ／ｍｌ￡栅，内酯得率为９０．２５％。
（３）最佳解吸工艺为：采用６０％，ｐＨ＝５的乙醇，洗脱流速为３ＢＶ／ｈ，实验在室温下进行，解吸率为８４．９５％。在最佳解吸工艺条件下，提取液的干膏收率由纯化前的８．９１％降低Ｎ３％，而穿心莲内酯的纯度由纯化前的２４．９８％提高到了６５％，本纯化工艺的内酯保留率为８５％以上。
（３）本论文针对目前穿心莲提取基本还采用效率比较低的浸渍提取以及纯化工作比较欠缺的现状，通过对穿心莲内酯提取和纯化工艺的系统研究，提出了简便、高效和科学合理的工艺路线，确定了相关的工艺条件，特别是提出了大大提高穿心莲内酯纯度的大孔树脂纯化工艺，为穿心莲制剂的开发特别是提高穿心莲针剂等质量，尽量减少目前普遍存在的穿心莲针剂临床使用的不良反应提供了有益的参考。
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致谢
本论文是在导师安莲英教授精心指导下以及众多老师同学的帮助下顺利完成的。安教授在科研上严谨的作风、工作上精益求精的态度以及为人处世上认真负责的原则都让我受益匪浅。在三年硕士学习期间，安老师给予了我慈母般的关怀和持续不断的鼓励，使我终生难忘。在学术讨论上，安老师求实的精神和博大的胸怀激励着我锐意进取，孜孜追求。在此，谨向安老师致以最崇高的敬意和最衷心的感谢。
我还要感谢殷辉安老师和唐明林老师在课题的立题方面给予的建议和支持，感谢实验室的张玉老师和高效液相色谱室的许淑霞老师在实验仪器上也为我提供很大的帮助。另外特别感谢刘军凯、刘宁、赵晶等同学以及师弟师妹刘星、冯毅等以及其他在学习和生活中给予作者帮助的同学们。
感谢所有辛勤劳动的评审论文和论文答辩委员会的专家、老师们！最后，感谢一直以来默默支持我求学的家人和朋友们！
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