第一章
●基因: 染色体上具有遗传效应的DNA 片段 核小体:染色质的基本组成单位
基因表达调控的基本原理:无论是原核生物还是真核生物,基因表达都主要在转录水平; 原核生物主要以负控制为主,真核生物主要以正控制为主。
基因表达的多级调控:转录水平的调控transcriptional level: 转录激活、转录起始; 转录后水平的调控post-transcriptional level:
转录后加工、运输、mRNA 降解; 翻译水平的调控translation level: 翻译的起始; 译后水平的调控post-translation level
翻译后的加工、转运、多肽链的分解
单基因病:由单个基因缺陷引发的疾病 显性遗传(多数)、隐性遗传、X 性连锁遗传(血友病)
常染色体病—唐氏综合症|(也叫做21三体):第21对染色体多一条 猫叫综合征:由5p15的缺失引起
外耳道多毛症——Y 连锁遗传病:一种遗传性状的基因位于Y 染色体上
线粒体脑肌病:由线粒体功能缺陷造成的 线粒体心肌病累及心脏和骨骼肌
4977 位点缺失 缺血性心脏病 冠状动脉粥样硬化性心脏病 7436 位点缺失 扩张性心肌病 肥厚性心肌病
多基因病:由多基因的结构或表达调控的改变引发的疾病 (高血压、糖尿病、自身免疫性疾病和恶性肿瘤)
原发性高血压相关基因: 1、血管紧张素原(AGT )基因 2、血管紧张素转化酶(ACE )基因 3、β2-肾上腺能受体基因
基因诊断: 利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法,直接检测基因结构及其表达水平是否正常,从而对疾病作出诊断的方法。(特点: 针对性强 特异性强 灵敏度高 适应性强)
●基因组:是细胞中一套完整单体的遗传物质的总和
●重叠基因: 仅存在于病毒和噬菌体中,重叠的方式有三种:①一个基因全部位于另一个基因中;②部分基因重叠;③只有一个碱基重复。表现的种类有:① 异相位基因重组;②同相位基因重组 ;③反相位基因重组。
●真核生物基因组特点:
1、真核生物的基因组DNA 都是双链链线状且往往不是一条。
2、大多数真核生物的结构基因为断裂基因,并受顺式元件调控。 3、结构基因的产物为单顺反子。
4、真核生物内非编码序列远远多于编码区。 5、真核生物含大量重复序列和基因家族。 6、真核生物内存可移动的遗传因子。 7、真核生物基因组不包括细胞器基因组
●基因不连续性:真核生物结构基因,编码序列被不编码序所间隔开,这些基因称为断裂基因。
●在原核生物和真核生物基因组中存在着可以从一个部位转移到另一个部位的一些序列,这些序列称为转座子。存在病毒、细菌和真核细胞的质粒或基因组中。 转座子也称跳跃基因
人类基因组中的重复序列
(1)高度重复序列(是一种简单的重复序列。反向重复,在基因组中可有几百个~几百万个拷贝的序列),主要参与DNA 复制、基因表达的调节,参与基因转位作用及减数分裂时染色体配对过程。 ●(如卫星DNA ):存在于非编码区的串联重复序列, 在基因组中约占5%。 小卫星DNA :
重复单位9-24 bp,呈高度多态性
(2)中度重复序列。在基因组中有10~几百个拷贝的序列,一般是不编码的序列
(3)单拷贝序列。单拷贝序列,在人体基因组中占50~60%,是编码蛋白质和酶的结构基因
●基因家族:真核细胞的基因组中来源相同、结构相似、功能相关的一组基因,称为基因家族;按其终产物分两类:一类是编码RNA 的,另一类是编码蛋白质的
家族中各基因的核苷酸序列相同这些基因族也被称为单纯多基因家庭(如rRNA ,tRNA 家族) 和复合多基因家族(如组蛋白基因家族).
家族中各基因编码的蛋白质有高度的同源性,但基因的核苷酸序列可能不同 hGh (人生长激素)和hcs 基因位于第17号染色体长臂 催乳素基因位于第6号染色体
由基因家族与单基因组成的较大的基因家族,其结构有不等的同源性,起源于相同的祖先基因,功能却并不相同,如Ig 超家族。这些基因在进化上也有亲缘关系,但亲缘关系较远,故称为基因超家族。 ●假基因:与有功能的基因相似,但不表达的基因。哺乳动物基因组中的1/4基因为假基因。
线粒体基因组:真核生物细胞中有两种细胞器能够携带遗传物质:线粒体和叶绿体,它们均含有各自的基因组,独立于核基因组进行复制,但其复制的酶和蛋白质却由核基因编码,在细胞质中合成后运输到细胞器。
线粒体内含有DNA 分子,被称为人类第25号染色体,是细胞核以外含有遗传信息和表达系统的细胞器,其遗传特点表现为非孟德尔遗传方式,又称核外遗传。
线粒体基因组特点:不与组蛋白结合,呈裸露闭环双链状,外环为重链(H) ,富含 G ,T ,内环为轻链( L) ,富含 A,C 。
编码区各基因之间排列极为紧凑,部分区域出现重叠,无启动子和内含子。 非编码区(D loop),1122bp ,H 链复制起始点,H 链和L 链的启动子,保守序列 线粒体DNA 的遗传特征:mtDNA 的复制具半自主性
线粒体遗传密码和通用密码不同
1969年 科学家成功分离了第一个基因
1999年9月 中国获准加入人类基因组计划,负责测定人类基因组全部序列的1% 2000年4月底 中国科学家完成了1%人类基因组的工作框架图
2000年12月14日 美英等国绘出拟南芥基因组的完整图谱。这是人类首次全部破译出一种植物的基因序列。
遗传图谱:又称为连锁图谱或遗传连锁图谱,它是以遗传多态性的遗传标记为“路标”,以遗传 学距离为图距的基因组图。“遗传图”的建立为人类疾病相关基因的分离克隆奠定了基础。拥有5000多个遗传学位点,相当于把整个人类基因组划分为5000多个小区,并分别设置了“标牌”。 DNA 分子标记:遗传图绘制需要应用多态性标志
由于内切酶切点变化所导致的DNA 片段长度的差异,称为限制性片段长度多态性(RFLP ) 碱基变异 ↓
酶切点的消失或新的切点出现 ↓
不同个体用同一限制酶切,DNA 片段长度出现差异
微卫星(STR )DNA 是一种广泛分布于真核生物基因组中的串状简单重复序列,按孟德尔规律呈共显性遗传 ,主要位于非编码区,其核心单位的数目变化和重复次数不同, 构成了STR 的遗传多态性。人类23 对染色体上至少分布着7901个STR 位点。
STR 作为遗传标记的优点:在人类基因组中分布均匀 、检测技术简便
●人类基因组计划研究的意义:解码生命,认识自身 ;认识疾病产生的机制,掌握生老病死规律
●人类基因组计划的内容:“HGP ”的核心内容是绘制人类的遗传图、物理图、转录图和序列图,最核心内容序列图的绘制。
●原核生物基因组有哪些特征?
1、基因组通常仅由一条环状双链DNA 分子组成
2、结构及用于太偶空序列以操纵子的形式组织在一起 3、基因组中重复序列很少 4、结构基因多为单拷贝 5、基因失连续的
6、编码序列一般不会重叠
7、编码须在基因中所占比例远远大于真核基因组而小雨病毒基因组 8、细菌基因组中存在可以动的DNA 序列
第二章
复制:以母链DNA 为模板合成子链DNA 的过程。
DNA 复制是细胞周期的决定因素,DNA 复制完成以前,细胞不会发生分裂。
DNA 复制的完成是细胞分裂的触发点,复制后的基因组被平均分配到两个子细胞中去。细胞周期调控基因控制DNA 的复制并触发细胞分裂
●半保留复制:
DNA 生物合成时,母链DNA 解开为两股单链,各自作为模板(template)按碱基配对规律,合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA ,一股单链从亲代完整地接受过来,另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA 都和亲代DNA 碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。
复制子是基因组中能够独立进行复制的单位。每个复制子都有控制复制开始的复制起点(origin )以及终止复制的终点。任何起点和终点之间的序列都作为复制子的一部分参与复制。 一个细胞周期中,每个复制子只启动一次。
原核生物细胞的基因组只有一个复制子,真核生物的DNA 分子上有多个复制子
DNA 在复制时,需在特定的位点起始,这是一些具有特定核苷酸排列顺序的片段,即复制起始点。
从起始点(origin)向两个方向解链,形成两个延伸方向相反的复制叉replication fork,称为双向复制。 顺着解链方向生成的子链,复制是连续的,这股链称领头链
复制的方向与解链方向相反,不能顺着解链方向连续延长,这股不连续复制的链称为随从链 复制中的不连续片段称为岡崎片段,由随从链所形成
●使DNA 解链的酶:
解旋酶:利用ATP 供能,作用于氢键,使DNA 双链解开成为两条单链
单链DNA 结合蛋白:在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整 DNA 旋转酶:切断DNA 分子两股链,断端通过切口旋转使超螺旋松弛。 利用ATP 供能,连接断端, DNA 分子进入负超螺旋状态 ●DNA 复制过程中的酶:
RNA 引物酶:功能:形成RNA 引物,为链的延伸作准备。 DNA 聚合酶:功能:是形成磷酸二酯键,不断地促进链的延长
DNA 连接酶:催化一条DNA 链的3′末端与相邻的另一条DNA 链的5′末端之间的磷酸二酯键的合成。与同一互补链结合并相邻。 (双链DNA 切口)
条件:① 需一段DNA 片段具有3„-OH ,而另一段DNA 片段具有5‟-Pi 基;② 未封闭的缺口位于双链DNA 中,即其中有一条链是完整的;③ 消耗能量
●原核生物DNA 聚合酶I 是多功能酶,具有三种酶活性:
1、5→'3' 的聚合活性; 2、5→'3'核酸外切酶活性; 3、3→'5'核酸外切酶活性。
原核生物DNA 聚合酶Ⅱ也以4种脱氧核糖核苷酸为底物,从5‟-3‟方向合成DNA 。 DNA 聚合酶Ⅱ具有3‟-5‟外切核酸酶活性,但无5‟-3‟外切酶活性。 DNA 聚合酶Ⅱ在DNA 修复中起作用
真核生物的DNA 聚合酶
DNA-pol α 起始引发,有引物酶活性
DNA-pol β 参与低保真度的复制
DNA-pol γ 在线粒体DNA 复制中起催化作用。 DNA-pol δ 延长子链的主要酶,有解螺旋酶活性。 DNA-pol ε 复制时起校读、修复和填补缺口的作用。
●复制的基本过程:(以原核生物为例)
起始,需要解决两个问题:1)DNA 解开成单链,提供模板 2)合成引物,提供3'-OH 末端
延伸,复制的延长指在DNA-pol 催化下,dNTP 以dNMP 的方式逐个加入引物或延长中的子链上,其化学本质是磷酸二酯键的不断生成
终止,原核生物基因是环状DNA ,双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合
参与DNA 复制的物质:
底物:dA TP, dGTP, dCTP, dTTP
聚合酶:依赖DNA 的DNA 聚合酶,简写为 DNA-pol ; 模板:解开成单链的DNA 母链
引物:提供3'-OH 末端使dNTP 可以依次聚合;
端粒:指真核生物染色体线性DNA 分子末端的结构。由末端单链DNA 序列和蛋白质构成。 末端DNA 序列是多次重复的富含G 、C 的短 序列。功能:维持染色体的稳定性。 维持DNA 复制的完整性。
内源源性损伤:1、DNA 复制错误 2、 碱基的异构式 3、自发的化学变化
(1) 脱嘌呤 (2) 脱氨(基)作用 4. 氧化损伤碱基
外源性损伤:物理因素和化学因素引起的损伤
碱基修饰剂,又称化学突变剂:
①亚硝酸(nitrous acid HNO2) ②羟氨(hydroxylamine HA ) ③烷化剂:甲磺酸乙酯( N-甲基-N‟-硝基-N-亚硝基胍 产生---错义突变
DNA 插入剂,结果产生---移框突变
DNA 修复:一、复制修复 二、损伤修复
三、复制后修复
细菌的限制与修饰作用:
细菌为了保护自身DNA 的完整性和准确性,进化出一套限制—修饰酶系,阻止外来DNA 的入侵。 由限制性内切酶降解外来DNA ;
由甲基化酶将自身DNA 甲基化(如形成mA 、mC )而不受限制酶降解。
来源不同的限制酶,但能识别和切割同一位点,这些酶称同功异源酶
同尾酶:有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同,但切割DNA 后,产生相同的粘性末端,称为同尾酶。
第三章
●转录:是生物体以DNA 为模板合成RNA 的过程 ●复制和转录的相同点 : 1. 均以DNA 为模板 2. 均需要依赖DNA 的聚合酶 3. 均以含三个磷酸的核苷酸为原料 4. 均是核苷酸聚合过程,多核苷酸为产物 5. 均遵从碱基配对规律 ●复制和转录的不同点
复制 转录
模板 两股链均复制 模板链转录(不对称转录) 原料 dNTP NTP
酶 DNA 聚合酶 RNA 聚合酶(RNA-pol ) 产物 子代双链DNA mRNA ,tRNA ,rRNA (半保留复制)
配对 A-T ,G-C A-U,T-A,G-C
DNA 分子上转录出RNA 的区段,称为结构基因。
转录的这种选择性称为不对称转录(asymmetric transcription),它有两方面含义:在DNA 分子双链上,一股链用作模板指引转录,另一股链不转录;其二是模板链并非总是在同一单链上。
转录的酶:依赖DNA 的RNA 聚合酶,RNA 聚合酶能直接启动转录:不需要引物。 RNA 合成的化学机制与DNA 依赖的DNA 聚合酶催化DNA 合成相似。
原核生物RNA 聚合酶:
亚基 功能
α 决定哪些基因被转录 β 催化功能 βˊ 结合DNA 模板 σ 辨认起始点
真核生物RNA 聚合酶
种类 I 型 II 型 III 型
转录产物 5.8S mRNA 前体 tRNA 前体
18S 5S rRNA 28S snRNA
这个真核mRNA 加工过程的起始步骤由两种酶,加帽酶和甲基转移酶催化完成
启动子:是一段特定的直接与RNA 聚合酶机器转录因子相结合、决定基因转录起始与否的DNA 序列。
不依赖ρ终止子的结构特点: 1、有回文序列
2、茎的区域富含G-C, 茎环不易解开。 3、强终止子的3‟端约有6个A
不同物种、不同细胞或不同的基因,转录起始点上游可以有不同的DNA 序列,但这些序列都可统称为顺式作用元件
具有酶促活性的RNA 称为核酶。
终止子:是结构基因下游近3ˊ端的一段DNA 序列,由AATAAA 和一段回文序列组成,在转录中提供终止信号,使转录作用终止。 第四章
蛋白质生物合成体系
1、基本原料:20种编码氨基酸 2、模板:mRNA
3、适配器,即运载工具:tRNA 4、装配机:核蛋白体
5、酶和蛋白质:氨基酰-tRNA 合成酶、转肽酶、起始因子、延长因子、释放因子 6、能源物质:ATP 、GTP 7、无机离子:Mg2+、 K+ 原核生物mRNA 的特点:
1、mRNA 的AUG 上游有S-D 序列。
2、mRNA 是多顺反子结构, 可以为多个蛋白质编码,相应也存在多个S-D 序列和AUG 。 3、有的编码序列有互相重叠现象。 真核生物mRNA 的特点:
没有S-D 序列,但5′端有帽子结构,起始密码子常处于-CCACCAUGG-序列之中。这段序列称为Kozak 序列,能增加翻译起始的效率。
真核生物的一段mRNA 常常只能编码一种蛋白质,这种mRNA 被称为单顺反子
遗传密码:mRNA 中从5’-3’方向, 每三个相邻的核苷酸为一个三联体, 代表一种氨基酸或翻译终止信息
遗传密码种类: 43=64种
61种代表氨基酸,3种不代表氨基酸,如UAA 、UAG 、 UGA 属终止密码子; AUG 起始密码子。 遗传密码的特点:
(1)方向性:翻译时遗传密码的阅读方向是5’→3’,即读码从mRNA 的起始密码子AUG 开始,
按5’→3’的方向逐一阅读,直至终止密码子
(2)连续性:编码蛋白质氨基酸序列的各个三联体密码连续阅读,密码子及密码子的各碱基之间既无间隔也无交叉。
基因损伤引起mRNA 阅读框架内的碱基发生插入或缺失,可能导致框移突变
(3)简并性:一种氨基酸可具有2个或2个以上的密码子为其编码。这一特性称为遗传密码的简并性。
(4)摆动性: 反密码子与密码子之间的配对有时并不严格遵守常见的碱基配对规律,这种现象称为摆动配对
(5)通用性:从病毒直到人类,细胞核DNA 指导的蛋白质合成都使用同一套遗传密码。研究发现,动物细胞的线粒体DNA 、植物细胞的叶绿体DNA ,在翻译时,其密码阅读方式不同。
运载氨基酸:氨基酸由其特异的tRNA 携带,一种氨基酸可有几种对应的tRNA ,氨基酸结合在tRNA 3ˊ-CCA 的位置,结合需要A TP 供能;充当“适配器”:每种tRNA 的反密码子决定了所携带的氨基酸能准确地在mRNA 上对号入座
蛋白质合成过程: 以mRNA 为模板,核糖体从mRNA 的5‘→3′方向进行阅读。 蛋白质合成方向:N-端到C-端。
蛋白质合成过程分:起始 延伸 终止
延伸的过程就是核蛋白体循环,每次循环包括: 注册 成肽 转位
分子伴侣:
功能:帮助新生链进行折叠。 主要有:
(1) 热休克蛋白 (2) 伴侣蛋白
蛋白质合成后的加工 为什么要修饰?
翻译的初产物没有生理活性。 修饰的内容:
①蛋白质氨基酸侧链的微小改变; ②糖基化等; ③剪切。 蛋白质转运:
分泌是指蛋白质从细胞内释放到细胞外空间的过程。
真核生物的分泌蛋白一般是在粗面内质网上合成→转运进入内质网腔→进行拆叠和初步糖基化→输送到高尔基体→进一步糖基化修饰→形成高尔基体反面膜的出芽小泡→经胞吐作用释放到胞外。
信号肽:各种新生分泌蛋白的N 端保守的氨基酸序列。 约13-35氨基酸残基,可分三区段:N 端碱性区、中间疏水区、C 端加工区(含极性、小侧链氨基酸和信号肽酶裂解位点)。
mRNA 如果没有5′帽和3′尾的结构,在合成后及翻译过程中,将立即被水解掉。
第五章
细胞通讯:是体内一部分细胞发出信号,另一部分细胞接收信号并将其转变为细胞功能变化的过程 细胞针对外源信息所发生的细胞内生物化学变化及效应的全过程称为信号转导 生物体可感受任何物理、化学和生物学刺激信号,但最终通过换能途径将各类信号转换为细胞可直接感受的化学信号
根据体内化学信号分子作用距离,可以将其分为三类: ①作用距离最远的内分泌系统化学信号,称为激素;
②属于旁分泌系统的细胞因子,主要作用于周围细胞;有些作用于自身,称为自分泌 ③作用距离最短的是神经元突触内的神经递质
细胞间信息物质是由细胞分泌的调节靶细胞生命活动的化学物质的统称,又称作第一信使 常见的第一信使:蛋白质和肽类(如生长因子、细胞因子、胰岛素等) 氨基酸及其衍生物(如甘氨酸、甲状腺素、肾上腺素等) 类固醇激素(如糖皮质激素、性激素等) 脂酸衍生物(如前列腺素)
气体(如一氧化氮、一氧化碳)等
第二信使:细胞内信息物质第一信号物质经转导刺激细胞内产生的传递细胞调控信号的化学物质。 常见的第二信使:无机离子:如 Ca2+ ;脂类衍生物:如DAG 、IP3;核苷酸:如cAMP 、cGMP ;信号蛋白分子
第三信使:负责细胞核内外信息传递的物质,又称为DNA 结合蛋白,是一类可与靶基因特异序列结合的核蛋白,能调节基因的转录。如立早基因的编码蛋白质 受体:是细胞膜上或细胞内能特别识别生物活性分子并与之结合的成分,它能把识别和接受的信号正确无误地放大并传递到细胞内部,进而引起生物学效应的特殊蛋白质,个别是糖脂。
1、膜受体:不能进入细胞的水溶性化学信号分子和其它细胞表面的信号分子,如生长因子、细胞因子、水溶性激素分子、粘附分子等
2、胞内受体:接收的信号是可以直接通过脂双层胞膜进入细胞的脂溶性化学信号分子,如类固醇激素、甲状腺素、维甲酸等
膜受体:存在于细胞质膜上的受体,绝大部分是镶嵌糖蛋白。根据其结构和转换信号的方式又分为三大类:离子通道受体,G 蛋白偶联受体和单跨膜受体。
离子通道受体信号转导的最终作用是导致了细胞膜电位改变,离子通道型受体可以是阳离子通道,也可以是阴离子通道
细胞内受体:多属于转录因子,位于细胞内的受体多为转录因子,与相应配体结合后,能与DNA 的顺式作用元件结合,在转录水平调节基因表达。
该型受体结合的信息物质有类固醇激素、甲状腺素、维甲酸、维生素D 等,它们进入细胞后,有些可与其位于细胞核内的受体相结合形成激素-受体复合物,有些则先与其在细胞质内的受体相结合,然后以激素-受体复合物的形式穿过核孔进入核内 胞内受体结构:
高度可变区------------位于N 端,具有转录活性 DNA 结合区-----------含有锌指结构
激素结合区-------------位于C 端,结合激素、热休克蛋白,使受体二聚化,激活转录 铰链区 位于细胞浆和细胞核中的受体,全部为DNA 结合蛋白
信号转导的基本过程:
细胞外信号
↓
受体 ↓
细胞内多种分子的浓度、活性、位置变化
↓
细胞应答反应 酶分子:
(1)催化小分子信使生成和转化的酶:腺苷酸环化酶AC 、鸟苷酸环化酶GC 等。 (2)
鸟苷酸结合蛋白简称G 蛋白 主要信号转导途径:G 蛋白偶联受体信号转导途径 、 AC-cAMP-PKA 信号转导途径和PLCB-IP/DG信号转导途径 ;酶偶联受体信号转导途径;依赖于受调蛋白水解信号转导途径 IP3 :与内质网和肌浆网上的受体结合,促使细胞内 Ca2+释放
何为自身磷酸化:自身激酶活性催化蛋白质分子中的氨基酸残基的磷酸基修饰
第六章
核酸分子杂交:在DNA 复性过程中,如果把不同DNA 单链分子放在同一溶液中,或把DNA 与RNA 放在一起,只要在DNA 或RNA 的单链分子之间有一定的碱基配对关系,就可以在不同的分子之间形成杂化双链
三种 印迹比较:1. DNA印迹技术 检测DNA 2. RNA印迹技术 检测RNA 3. 蛋白质的印迹分析 检测蛋白质
生物芯片技术的特点: 高通量—提高信息量 平行化—提高信息的可比性 微量化—降低待检样品用量 自动化—提高工作效率 低成本—可迅速普及推广
基因芯片应用:可在基因组水平进行基因表达和发现研究、突变、序列测定等
PCR 技术的特点:扩增特异的DNA 片段
多重PCR :在同一PCR 体系中加入若干对PCR 引物,如果这些引物的退火温度相近,并且所覆盖的区域不重叠,这样的反应体系可同时扩增多个DNA 片段。
当基因的外显子发生缺失时,根据条带缺失的数目和引物相应的位置,可判断基因中哪一个或哪几个扩增部位发生缺失。
cDNA 文库:用目的基因上的一段DNA 做成探针与文库中的DNA 作核酸杂交,从基因文库中“钓出”有目的基因的克隆
基因敲除:又称基因剔除,或基因打靶 是指通过DNA 定点同源重组,定向改变基因组中的某一特定基因,使机体特定基因失活或缺失,从而研究此基因的功能的一种分子生物学技术。
基因敲除载体构建:
1. 获得目的基因的同源片段。
2. 从重组质粒中切除目的基因同源片段的大部分同源DNA 序列,只留部分序列在线性质粒载体的两端。
3. 将新霉素抗性基因(neo )克隆到带有同源序列的线性质粒中。
4. 在目的基因同源序列的外侧线性化重组质粒载体,引入疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk )
1、 插入性载体 断裂位点位于同源序列区域内
2、 置换型载体 断裂位点位于同源序列区域的外侧或两侧,目前,大多数基因敲除都采用置换型载体进行
基因敲除的原理:
1. 利用基因同源重组进行基因敲除
2. 基因载体的构建
3. 重组DNA 导入ES (常用于基因敲除的靶细胞是小鼠ES 细胞。导入方式有显微注射法、电穿孔法、精子载体法和逆转录病毒法等,目前应用较多的是显微注射法。)
现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞
正负双向筛选系统:
该系统不受靶位基因功能和表达情况的影响,可以同时使用于选择标记基因和非选择标记基因的敲除。PNS 采用置换型载 体,该载体含有正负选择基因各一个,正向选择基因多为neo 基因,插入载体的同源序列中;负向选择基因常用HSV-tk 基因,置于同源序列的外侧。同源重 组时,载体的同源区发生重组,同源区以外部分将被切除,所以在同源重组时,tk 基因将被切除而丢失。而在随机整合时,所有序列均保留。 胸苷激酶蛋白(TK )可使无毒性的丙氧鸟苷(GANC )转变为毒性核苷酸而杀死细胞
正向筛选标记基因Neo 具有双重作用
正向筛选法可分为无启动子筛选法、无增强子筛选法和无polyA 筛选法。
启动子缺失筛选法:原理是在重组基因载体的目的片段中插入一个启动子缺失的正向选择基因
Poly- A缺失筛选法:Poly-A 缺失筛选的载体设计与启动子缺失的设计基本相同,当打靶基因不能被诱导表达时,则考虑选用poly- A缺失敲除策略。Poly - A 缺失的正向选择基因 neo位于载体目的片段中, 由于neo 基因转录终止信号的缺失, 其表达受到抑制
运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。
根据所诱捕的表达调控序列的不同,广义的基因诱捕包括了增强子诱捕、基因诱捕、启动子诱捕、polyA 诱捕等多种类型。
基因捕获法优点:利用基因捕获可以建立一个携带随机插入突变的ES 细胞库
第七章
药品不良反应:在正常用法用量情况下出现的与治疗目的无关的有害反应。
不同个体对同一药物同一剂量的反应存在量与质的差异。
单核苷酸多态性:同一物种不同个体基因组DNA 的等位序列上单个核苷酸存在差别的现象。
单核苷酸多态性的特征:主要点突变 ;数量多,分布广泛;具有遗传稳定性;具有二态性,易于自动化、规模化分析;可以建立单体型区域;
单体型:位于一条染色体上倾向于整体遗传的一组紧密连锁遗传标记物。专指一组相关联的SNP 等位位点。
候选基因分析:(通过对已知候选基因与性状表型值的关联分析判断其是否就是主基因(药代动力学和药效动力学相关基因)或是否与主基因紧密连锁。
全基因组关联分析:是一种在全基因组范围内寻找与药物应答相关遗传变异的方法。
第八章
基因的功能是什么?
不同的基因参与了哪些细胞内不同的生命过程?
基因表达的调控、基因与基因产物之间的相互
作用、以及相同的基因在不同的细胞内或者疾
病和治疗状态下表达水平?
生物芯片包括:
DNA 芯片:寡核苷酸和cDNA
蛋白质芯片
其它芯片
按用途分:
表达谱芯片
诊断芯片
指纹图谱芯片
测序芯片
毒理芯片
样品与DNA 芯片上的探针阵列进行杂交。
与经典分子杂交的区别:
1、杂交时间短,30分钟内完成
2、可同时平行检测许多基因序列
影响杂交反应的因素:
盐浓度、温度、反应时间、DNA 二级结构
第九章
蛋白质组:指由一个基因组,或一个细胞、组织表达的所有蛋白质
第十章
基因表达:是指外源基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工成活性蛋白质的过程
在原核生物中,基因表达是以操纵子的形式进行的
载体
1. 克隆质粒载体
质粒(plasmid)是独立于染色体之外的、能自主复制的双链环状DNA 分子, 能递到子代,一般不整合到宿主染色体上。
受体细胞应具备的条件:
限制性缺陷型
易于重组子导入
遗传稳定性好
安全性高
功能互补,易于筛选
翻译后加工能力强
内源蛋白酶基因缺失或含量低
转导:是通过噬菌体感染将DNA 转入宿主细胞并产生新性状的过程
转化:是指某些细菌通过其细胞膜摄取周围供体的染色体片段,将此外源DNA 片段通过重组整合到自己染色体组的过程。
感受态细胞:受体细胞经过一些特殊方法(如:CaCl2等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生变化,能容许外源DNA 的载体分子。
重组DNA 技术操作过程可形象归纳为: 分
切分离目的基因 限制酶切目的基因与载体 接拼接重组体
转转入受体菌 筛筛选重组体
原核生物基因组中, 几个功能相关基因及其上游调控序列构成一个基因表达基本单位, 称为操纵子。 包涵体:在一定条件下,外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密地集中在一起形 成无膜的裸露结构,这种结构称为包涵体。
在构建外源蛋白表达载体时,将多个外源目的蛋白基因串连在一起,克隆在质粒载体上,以这种方式表达的外源蛋白称为寡聚型外源蛋白
将要表达的外源基因整合到染色体的非必需编码区上,使之成为染色体结构的一部分而稳定地遗传,以此种方式表达的外源蛋白即为整合型外源蛋白
外源基因的表达产物,通过运输或分泌的方式穿过细胞的外膜进入培养基中,即为分泌型外源蛋白 高效表达外源基因须考虑的基本原则:
优化表达载体的设计。
提高稀有密码子tRNA 的表达作用。
提高外源基因mRNA 的稳定性。
提高外源基因表达产物的稳定性。
优化发酵过程。
酵母基因表达系统的载体一般是一种穿梭质粒,能在酵母菌和大肠杆菌中进行复制。
选择标记 营养缺陷型选择标记:它与宿主的基因型有关。
显性选择标记:可用于各种类型的宿主细胞,并提供直观的选择标记。
酵母基因表达载体的种类:自主复制型质粒载体 整合型质粒载体
表达盒由启动子、分泌信号序列和终止子等组成,是酵母表达载体的重要元件。
表达宿主
主要包括:
酿酒酵母
巴斯德毕赤酵母
乳酸克努维酵母
多型汉森酵母等
外源基因在哺乳动物细胞中的表达包括基因的转录、mRNA 翻译及翻译后蛋白质加工等过程 哺乳动物基因表达载体:质粒载体
病毒载体
第一章
●基因: 染色体上具有遗传效应的DNA 片段 核小体:染色质的基本组成单位
基因表达调控的基本原理:无论是原核生物还是真核生物,基因表达都主要在转录水平; 原核生物主要以负控制为主,真核生物主要以正控制为主。
基因表达的多级调控:转录水平的调控transcriptional level: 转录激活、转录起始; 转录后水平的调控post-transcriptional level:
转录后加工、运输、mRNA 降解; 翻译水平的调控translation level: 翻译的起始; 译后水平的调控post-translation level
翻译后的加工、转运、多肽链的分解
单基因病:由单个基因缺陷引发的疾病 显性遗传(多数)、隐性遗传、X 性连锁遗传(血友病)
常染色体病—唐氏综合症|(也叫做21三体):第21对染色体多一条 猫叫综合征:由5p15的缺失引起
外耳道多毛症——Y 连锁遗传病:一种遗传性状的基因位于Y 染色体上
线粒体脑肌病:由线粒体功能缺陷造成的 线粒体心肌病累及心脏和骨骼肌
4977 位点缺失 缺血性心脏病 冠状动脉粥样硬化性心脏病 7436 位点缺失 扩张性心肌病 肥厚性心肌病
多基因病:由多基因的结构或表达调控的改变引发的疾病 (高血压、糖尿病、自身免疫性疾病和恶性肿瘤)
原发性高血压相关基因: 1、血管紧张素原(AGT )基因 2、血管紧张素转化酶(ACE )基因 3、β2-肾上腺能受体基因
基因诊断: 利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法,直接检测基因结构及其表达水平是否正常,从而对疾病作出诊断的方法。(特点: 针对性强 特异性强 灵敏度高 适应性强)
●基因组:是细胞中一套完整单体的遗传物质的总和
●重叠基因: 仅存在于病毒和噬菌体中,重叠的方式有三种:①一个基因全部位于另一个基因中;②部分基因重叠;③只有一个碱基重复。表现的种类有:① 异相位基因重组;②同相位基因重组 ;③反相位基因重组。
●真核生物基因组特点:
1、真核生物的基因组DNA 都是双链链线状且往往不是一条。
2、大多数真核生物的结构基因为断裂基因,并受顺式元件调控。 3、结构基因的产物为单顺反子。
4、真核生物内非编码序列远远多于编码区。 5、真核生物含大量重复序列和基因家族。 6、真核生物内存可移动的遗传因子。 7、真核生物基因组不包括细胞器基因组
●基因不连续性:真核生物结构基因,编码序列被不编码序所间隔开,这些基因称为断裂基因。
●在原核生物和真核生物基因组中存在着可以从一个部位转移到另一个部位的一些序列,这些序列称为转座子。存在病毒、细菌和真核细胞的质粒或基因组中。 转座子也称跳跃基因
人类基因组中的重复序列
(1)高度重复序列(是一种简单的重复序列。反向重复,在基因组中可有几百个~几百万个拷贝的序列),主要参与DNA 复制、基因表达的调节,参与基因转位作用及减数分裂时染色体配对过程。 ●(如卫星DNA ):存在于非编码区的串联重复序列, 在基因组中约占5%。 小卫星DNA :
重复单位9-24 bp,呈高度多态性
(2)中度重复序列。在基因组中有10~几百个拷贝的序列,一般是不编码的序列
(3)单拷贝序列。单拷贝序列,在人体基因组中占50~60%,是编码蛋白质和酶的结构基因
●基因家族:真核细胞的基因组中来源相同、结构相似、功能相关的一组基因,称为基因家族;按其终产物分两类:一类是编码RNA 的,另一类是编码蛋白质的
家族中各基因的核苷酸序列相同这些基因族也被称为单纯多基因家庭(如rRNA ,tRNA 家族) 和复合多基因家族(如组蛋白基因家族).
家族中各基因编码的蛋白质有高度的同源性,但基因的核苷酸序列可能不同 hGh (人生长激素)和hcs 基因位于第17号染色体长臂 催乳素基因位于第6号染色体
由基因家族与单基因组成的较大的基因家族,其结构有不等的同源性,起源于相同的祖先基因,功能却并不相同,如Ig 超家族。这些基因在进化上也有亲缘关系,但亲缘关系较远,故称为基因超家族。 ●假基因:与有功能的基因相似,但不表达的基因。哺乳动物基因组中的1/4基因为假基因。
线粒体基因组:真核生物细胞中有两种细胞器能够携带遗传物质:线粒体和叶绿体,它们均含有各自的基因组,独立于核基因组进行复制,但其复制的酶和蛋白质却由核基因编码,在细胞质中合成后运输到细胞器。
线粒体内含有DNA 分子,被称为人类第25号染色体,是细胞核以外含有遗传信息和表达系统的细胞器,其遗传特点表现为非孟德尔遗传方式,又称核外遗传。
线粒体基因组特点:不与组蛋白结合,呈裸露闭环双链状,外环为重链(H) ,富含 G ,T ,内环为轻链( L) ,富含 A,C 。
编码区各基因之间排列极为紧凑,部分区域出现重叠,无启动子和内含子。 非编码区(D loop),1122bp ,H 链复制起始点,H 链和L 链的启动子,保守序列 线粒体DNA 的遗传特征:mtDNA 的复制具半自主性
线粒体遗传密码和通用密码不同
1969年 科学家成功分离了第一个基因
1999年9月 中国获准加入人类基因组计划,负责测定人类基因组全部序列的1% 2000年4月底 中国科学家完成了1%人类基因组的工作框架图
2000年12月14日 美英等国绘出拟南芥基因组的完整图谱。这是人类首次全部破译出一种植物的基因序列。
遗传图谱:又称为连锁图谱或遗传连锁图谱,它是以遗传多态性的遗传标记为“路标”,以遗传 学距离为图距的基因组图。“遗传图”的建立为人类疾病相关基因的分离克隆奠定了基础。拥有5000多个遗传学位点,相当于把整个人类基因组划分为5000多个小区,并分别设置了“标牌”。 DNA 分子标记:遗传图绘制需要应用多态性标志
由于内切酶切点变化所导致的DNA 片段长度的差异,称为限制性片段长度多态性(RFLP ) 碱基变异 ↓
酶切点的消失或新的切点出现 ↓
不同个体用同一限制酶切,DNA 片段长度出现差异
微卫星(STR )DNA 是一种广泛分布于真核生物基因组中的串状简单重复序列,按孟德尔规律呈共显性遗传 ,主要位于非编码区,其核心单位的数目变化和重复次数不同, 构成了STR 的遗传多态性。人类23 对染色体上至少分布着7901个STR 位点。
STR 作为遗传标记的优点:在人类基因组中分布均匀 、检测技术简便
●人类基因组计划研究的意义:解码生命,认识自身 ;认识疾病产生的机制,掌握生老病死规律
●人类基因组计划的内容:“HGP ”的核心内容是绘制人类的遗传图、物理图、转录图和序列图,最核心内容序列图的绘制。
●原核生物基因组有哪些特征?
1、基因组通常仅由一条环状双链DNA 分子组成
2、结构及用于太偶空序列以操纵子的形式组织在一起 3、基因组中重复序列很少 4、结构基因多为单拷贝 5、基因失连续的
6、编码序列一般不会重叠
7、编码须在基因中所占比例远远大于真核基因组而小雨病毒基因组 8、细菌基因组中存在可以动的DNA 序列
第二章
复制:以母链DNA 为模板合成子链DNA 的过程。
DNA 复制是细胞周期的决定因素,DNA 复制完成以前,细胞不会发生分裂。
DNA 复制的完成是细胞分裂的触发点,复制后的基因组被平均分配到两个子细胞中去。细胞周期调控基因控制DNA 的复制并触发细胞分裂
●半保留复制:
DNA 生物合成时,母链DNA 解开为两股单链,各自作为模板(template)按碱基配对规律,合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA ,一股单链从亲代完整地接受过来,另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA 都和亲代DNA 碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。
复制子是基因组中能够独立进行复制的单位。每个复制子都有控制复制开始的复制起点(origin )以及终止复制的终点。任何起点和终点之间的序列都作为复制子的一部分参与复制。 一个细胞周期中,每个复制子只启动一次。
原核生物细胞的基因组只有一个复制子,真核生物的DNA 分子上有多个复制子
DNA 在复制时,需在特定的位点起始,这是一些具有特定核苷酸排列顺序的片段,即复制起始点。
从起始点(origin)向两个方向解链,形成两个延伸方向相反的复制叉replication fork,称为双向复制。 顺着解链方向生成的子链,复制是连续的,这股链称领头链
复制的方向与解链方向相反,不能顺着解链方向连续延长,这股不连续复制的链称为随从链 复制中的不连续片段称为岡崎片段,由随从链所形成
●使DNA 解链的酶:
解旋酶:利用ATP 供能,作用于氢键,使DNA 双链解开成为两条单链
单链DNA 结合蛋白:在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整 DNA 旋转酶:切断DNA 分子两股链,断端通过切口旋转使超螺旋松弛。 利用ATP 供能,连接断端, DNA 分子进入负超螺旋状态 ●DNA 复制过程中的酶:
RNA 引物酶:功能:形成RNA 引物,为链的延伸作准备。 DNA 聚合酶:功能:是形成磷酸二酯键,不断地促进链的延长
DNA 连接酶:催化一条DNA 链的3′末端与相邻的另一条DNA 链的5′末端之间的磷酸二酯键的合成。与同一互补链结合并相邻。 (双链DNA 切口)
条件:① 需一段DNA 片段具有3„-OH ,而另一段DNA 片段具有5‟-Pi 基;② 未封闭的缺口位于双链DNA 中,即其中有一条链是完整的;③ 消耗能量
●原核生物DNA 聚合酶I 是多功能酶,具有三种酶活性:
1、5→'3' 的聚合活性; 2、5→'3'核酸外切酶活性; 3、3→'5'核酸外切酶活性。
原核生物DNA 聚合酶Ⅱ也以4种脱氧核糖核苷酸为底物,从5‟-3‟方向合成DNA 。 DNA 聚合酶Ⅱ具有3‟-5‟外切核酸酶活性,但无5‟-3‟外切酶活性。 DNA 聚合酶Ⅱ在DNA 修复中起作用
真核生物的DNA 聚合酶
DNA-pol α 起始引发,有引物酶活性
DNA-pol β 参与低保真度的复制
DNA-pol γ 在线粒体DNA 复制中起催化作用。 DNA-pol δ 延长子链的主要酶,有解螺旋酶活性。 DNA-pol ε 复制时起校读、修复和填补缺口的作用。
●复制的基本过程:(以原核生物为例)
起始,需要解决两个问题:1)DNA 解开成单链,提供模板 2)合成引物,提供3'-OH 末端
延伸,复制的延长指在DNA-pol 催化下,dNTP 以dNMP 的方式逐个加入引物或延长中的子链上,其化学本质是磷酸二酯键的不断生成
终止,原核生物基因是环状DNA ,双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合
参与DNA 复制的物质:
底物:dA TP, dGTP, dCTP, dTTP
聚合酶:依赖DNA 的DNA 聚合酶,简写为 DNA-pol ; 模板:解开成单链的DNA 母链
引物:提供3'-OH 末端使dNTP 可以依次聚合;
端粒:指真核生物染色体线性DNA 分子末端的结构。由末端单链DNA 序列和蛋白质构成。 末端DNA 序列是多次重复的富含G 、C 的短 序列。功能:维持染色体的稳定性。 维持DNA 复制的完整性。
内源源性损伤:1、DNA 复制错误 2、 碱基的异构式 3、自发的化学变化
(1) 脱嘌呤 (2) 脱氨(基)作用 4. 氧化损伤碱基
外源性损伤:物理因素和化学因素引起的损伤
碱基修饰剂,又称化学突变剂:
①亚硝酸(nitrous acid HNO2) ②羟氨(hydroxylamine HA ) ③烷化剂:甲磺酸乙酯( N-甲基-N‟-硝基-N-亚硝基胍 产生---错义突变
DNA 插入剂,结果产生---移框突变
DNA 修复:一、复制修复 二、损伤修复
三、复制后修复
细菌的限制与修饰作用:
细菌为了保护自身DNA 的完整性和准确性,进化出一套限制—修饰酶系,阻止外来DNA 的入侵。 由限制性内切酶降解外来DNA ;
由甲基化酶将自身DNA 甲基化(如形成mA 、mC )而不受限制酶降解。
来源不同的限制酶,但能识别和切割同一位点,这些酶称同功异源酶
同尾酶:有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同,但切割DNA 后,产生相同的粘性末端,称为同尾酶。
第三章
●转录:是生物体以DNA 为模板合成RNA 的过程 ●复制和转录的相同点 : 1. 均以DNA 为模板 2. 均需要依赖DNA 的聚合酶 3. 均以含三个磷酸的核苷酸为原料 4. 均是核苷酸聚合过程,多核苷酸为产物 5. 均遵从碱基配对规律 ●复制和转录的不同点
复制 转录
模板 两股链均复制 模板链转录(不对称转录) 原料 dNTP NTP
酶 DNA 聚合酶 RNA 聚合酶(RNA-pol ) 产物 子代双链DNA mRNA ,tRNA ,rRNA (半保留复制)
配对 A-T ,G-C A-U,T-A,G-C
DNA 分子上转录出RNA 的区段,称为结构基因。
转录的这种选择性称为不对称转录(asymmetric transcription),它有两方面含义:在DNA 分子双链上,一股链用作模板指引转录,另一股链不转录;其二是模板链并非总是在同一单链上。
转录的酶:依赖DNA 的RNA 聚合酶,RNA 聚合酶能直接启动转录:不需要引物。 RNA 合成的化学机制与DNA 依赖的DNA 聚合酶催化DNA 合成相似。
原核生物RNA 聚合酶:
亚基 功能
α 决定哪些基因被转录 β 催化功能 βˊ 结合DNA 模板 σ 辨认起始点
真核生物RNA 聚合酶
种类 I 型 II 型 III 型
转录产物 5.8S mRNA 前体 tRNA 前体
18S 5S rRNA 28S snRNA
这个真核mRNA 加工过程的起始步骤由两种酶,加帽酶和甲基转移酶催化完成
启动子:是一段特定的直接与RNA 聚合酶机器转录因子相结合、决定基因转录起始与否的DNA 序列。
不依赖ρ终止子的结构特点: 1、有回文序列
2、茎的区域富含G-C, 茎环不易解开。 3、强终止子的3‟端约有6个A
不同物种、不同细胞或不同的基因,转录起始点上游可以有不同的DNA 序列,但这些序列都可统称为顺式作用元件
具有酶促活性的RNA 称为核酶。
终止子:是结构基因下游近3ˊ端的一段DNA 序列,由AATAAA 和一段回文序列组成,在转录中提供终止信号,使转录作用终止。 第四章
蛋白质生物合成体系
1、基本原料:20种编码氨基酸 2、模板:mRNA
3、适配器,即运载工具:tRNA 4、装配机:核蛋白体
5、酶和蛋白质:氨基酰-tRNA 合成酶、转肽酶、起始因子、延长因子、释放因子 6、能源物质:ATP 、GTP 7、无机离子:Mg2+、 K+ 原核生物mRNA 的特点:
1、mRNA 的AUG 上游有S-D 序列。
2、mRNA 是多顺反子结构, 可以为多个蛋白质编码,相应也存在多个S-D 序列和AUG 。 3、有的编码序列有互相重叠现象。 真核生物mRNA 的特点:
没有S-D 序列,但5′端有帽子结构,起始密码子常处于-CCACCAUGG-序列之中。这段序列称为Kozak 序列,能增加翻译起始的效率。
真核生物的一段mRNA 常常只能编码一种蛋白质,这种mRNA 被称为单顺反子
遗传密码:mRNA 中从5’-3’方向, 每三个相邻的核苷酸为一个三联体, 代表一种氨基酸或翻译终止信息
遗传密码种类: 43=64种
61种代表氨基酸,3种不代表氨基酸,如UAA 、UAG 、 UGA 属终止密码子; AUG 起始密码子。 遗传密码的特点:
(1)方向性:翻译时遗传密码的阅读方向是5’→3’,即读码从mRNA 的起始密码子AUG 开始,
按5’→3’的方向逐一阅读,直至终止密码子
(2)连续性:编码蛋白质氨基酸序列的各个三联体密码连续阅读,密码子及密码子的各碱基之间既无间隔也无交叉。
基因损伤引起mRNA 阅读框架内的碱基发生插入或缺失,可能导致框移突变
(3)简并性:一种氨基酸可具有2个或2个以上的密码子为其编码。这一特性称为遗传密码的简并性。
(4)摆动性: 反密码子与密码子之间的配对有时并不严格遵守常见的碱基配对规律,这种现象称为摆动配对
(5)通用性:从病毒直到人类,细胞核DNA 指导的蛋白质合成都使用同一套遗传密码。研究发现,动物细胞的线粒体DNA 、植物细胞的叶绿体DNA ,在翻译时,其密码阅读方式不同。
运载氨基酸:氨基酸由其特异的tRNA 携带,一种氨基酸可有几种对应的tRNA ,氨基酸结合在tRNA 3ˊ-CCA 的位置,结合需要A TP 供能;充当“适配器”:每种tRNA 的反密码子决定了所携带的氨基酸能准确地在mRNA 上对号入座
蛋白质合成过程: 以mRNA 为模板,核糖体从mRNA 的5‘→3′方向进行阅读。 蛋白质合成方向:N-端到C-端。
蛋白质合成过程分:起始 延伸 终止
延伸的过程就是核蛋白体循环,每次循环包括: 注册 成肽 转位
分子伴侣:
功能:帮助新生链进行折叠。 主要有:
(1) 热休克蛋白 (2) 伴侣蛋白
蛋白质合成后的加工 为什么要修饰?
翻译的初产物没有生理活性。 修饰的内容:
①蛋白质氨基酸侧链的微小改变; ②糖基化等; ③剪切。 蛋白质转运:
分泌是指蛋白质从细胞内释放到细胞外空间的过程。
真核生物的分泌蛋白一般是在粗面内质网上合成→转运进入内质网腔→进行拆叠和初步糖基化→输送到高尔基体→进一步糖基化修饰→形成高尔基体反面膜的出芽小泡→经胞吐作用释放到胞外。
信号肽:各种新生分泌蛋白的N 端保守的氨基酸序列。 约13-35氨基酸残基,可分三区段:N 端碱性区、中间疏水区、C 端加工区(含极性、小侧链氨基酸和信号肽酶裂解位点)。
mRNA 如果没有5′帽和3′尾的结构,在合成后及翻译过程中,将立即被水解掉。
第五章
细胞通讯:是体内一部分细胞发出信号,另一部分细胞接收信号并将其转变为细胞功能变化的过程 细胞针对外源信息所发生的细胞内生物化学变化及效应的全过程称为信号转导 生物体可感受任何物理、化学和生物学刺激信号,但最终通过换能途径将各类信号转换为细胞可直接感受的化学信号
根据体内化学信号分子作用距离,可以将其分为三类: ①作用距离最远的内分泌系统化学信号,称为激素;
②属于旁分泌系统的细胞因子,主要作用于周围细胞;有些作用于自身,称为自分泌 ③作用距离最短的是神经元突触内的神经递质
细胞间信息物质是由细胞分泌的调节靶细胞生命活动的化学物质的统称,又称作第一信使 常见的第一信使:蛋白质和肽类(如生长因子、细胞因子、胰岛素等) 氨基酸及其衍生物(如甘氨酸、甲状腺素、肾上腺素等) 类固醇激素(如糖皮质激素、性激素等) 脂酸衍生物(如前列腺素)
气体(如一氧化氮、一氧化碳)等
第二信使:细胞内信息物质第一信号物质经转导刺激细胞内产生的传递细胞调控信号的化学物质。 常见的第二信使:无机离子:如 Ca2+ ;脂类衍生物:如DAG 、IP3;核苷酸:如cAMP 、cGMP ;信号蛋白分子
第三信使:负责细胞核内外信息传递的物质,又称为DNA 结合蛋白,是一类可与靶基因特异序列结合的核蛋白,能调节基因的转录。如立早基因的编码蛋白质 受体:是细胞膜上或细胞内能特别识别生物活性分子并与之结合的成分,它能把识别和接受的信号正确无误地放大并传递到细胞内部,进而引起生物学效应的特殊蛋白质,个别是糖脂。
1、膜受体:不能进入细胞的水溶性化学信号分子和其它细胞表面的信号分子,如生长因子、细胞因子、水溶性激素分子、粘附分子等
2、胞内受体:接收的信号是可以直接通过脂双层胞膜进入细胞的脂溶性化学信号分子,如类固醇激素、甲状腺素、维甲酸等
膜受体:存在于细胞质膜上的受体,绝大部分是镶嵌糖蛋白。根据其结构和转换信号的方式又分为三大类:离子通道受体,G 蛋白偶联受体和单跨膜受体。
离子通道受体信号转导的最终作用是导致了细胞膜电位改变,离子通道型受体可以是阳离子通道,也可以是阴离子通道
细胞内受体:多属于转录因子,位于细胞内的受体多为转录因子,与相应配体结合后,能与DNA 的顺式作用元件结合,在转录水平调节基因表达。
该型受体结合的信息物质有类固醇激素、甲状腺素、维甲酸、维生素D 等,它们进入细胞后,有些可与其位于细胞核内的受体相结合形成激素-受体复合物,有些则先与其在细胞质内的受体相结合,然后以激素-受体复合物的形式穿过核孔进入核内 胞内受体结构:
高度可变区------------位于N 端,具有转录活性 DNA 结合区-----------含有锌指结构
激素结合区-------------位于C 端,结合激素、热休克蛋白,使受体二聚化,激活转录 铰链区 位于细胞浆和细胞核中的受体,全部为DNA 结合蛋白
信号转导的基本过程:
细胞外信号
↓
受体 ↓
细胞内多种分子的浓度、活性、位置变化
↓
细胞应答反应 酶分子:
(1)催化小分子信使生成和转化的酶:腺苷酸环化酶AC 、鸟苷酸环化酶GC 等。 (2)
鸟苷酸结合蛋白简称G 蛋白 主要信号转导途径:G 蛋白偶联受体信号转导途径 、 AC-cAMP-PKA 信号转导途径和PLCB-IP/DG信号转导途径 ;酶偶联受体信号转导途径;依赖于受调蛋白水解信号转导途径 IP3 :与内质网和肌浆网上的受体结合,促使细胞内 Ca2+释放
何为自身磷酸化:自身激酶活性催化蛋白质分子中的氨基酸残基的磷酸基修饰
第六章
核酸分子杂交:在DNA 复性过程中,如果把不同DNA 单链分子放在同一溶液中,或把DNA 与RNA 放在一起,只要在DNA 或RNA 的单链分子之间有一定的碱基配对关系,就可以在不同的分子之间形成杂化双链
三种 印迹比较:1. DNA印迹技术 检测DNA 2. RNA印迹技术 检测RNA 3. 蛋白质的印迹分析 检测蛋白质
生物芯片技术的特点: 高通量—提高信息量 平行化—提高信息的可比性 微量化—降低待检样品用量 自动化—提高工作效率 低成本—可迅速普及推广
基因芯片应用:可在基因组水平进行基因表达和发现研究、突变、序列测定等
PCR 技术的特点:扩增特异的DNA 片段
多重PCR :在同一PCR 体系中加入若干对PCR 引物,如果这些引物的退火温度相近,并且所覆盖的区域不重叠,这样的反应体系可同时扩增多个DNA 片段。
当基因的外显子发生缺失时,根据条带缺失的数目和引物相应的位置,可判断基因中哪一个或哪几个扩增部位发生缺失。
cDNA 文库:用目的基因上的一段DNA 做成探针与文库中的DNA 作核酸杂交,从基因文库中“钓出”有目的基因的克隆
基因敲除:又称基因剔除,或基因打靶 是指通过DNA 定点同源重组,定向改变基因组中的某一特定基因,使机体特定基因失活或缺失,从而研究此基因的功能的一种分子生物学技术。
基因敲除载体构建:
1. 获得目的基因的同源片段。
2. 从重组质粒中切除目的基因同源片段的大部分同源DNA 序列,只留部分序列在线性质粒载体的两端。
3. 将新霉素抗性基因(neo )克隆到带有同源序列的线性质粒中。
4. 在目的基因同源序列的外侧线性化重组质粒载体,引入疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk )
1、 插入性载体 断裂位点位于同源序列区域内
2、 置换型载体 断裂位点位于同源序列区域的外侧或两侧,目前,大多数基因敲除都采用置换型载体进行
基因敲除的原理:
1. 利用基因同源重组进行基因敲除
2. 基因载体的构建
3. 重组DNA 导入ES (常用于基因敲除的靶细胞是小鼠ES 细胞。导入方式有显微注射法、电穿孔法、精子载体法和逆转录病毒法等,目前应用较多的是显微注射法。)
现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞
正负双向筛选系统:
该系统不受靶位基因功能和表达情况的影响,可以同时使用于选择标记基因和非选择标记基因的敲除。PNS 采用置换型载 体,该载体含有正负选择基因各一个,正向选择基因多为neo 基因,插入载体的同源序列中;负向选择基因常用HSV-tk 基因,置于同源序列的外侧。同源重 组时,载体的同源区发生重组,同源区以外部分将被切除,所以在同源重组时,tk 基因将被切除而丢失。而在随机整合时,所有序列均保留。 胸苷激酶蛋白(TK )可使无毒性的丙氧鸟苷(GANC )转变为毒性核苷酸而杀死细胞
正向筛选标记基因Neo 具有双重作用
正向筛选法可分为无启动子筛选法、无增强子筛选法和无polyA 筛选法。
启动子缺失筛选法:原理是在重组基因载体的目的片段中插入一个启动子缺失的正向选择基因
Poly- A缺失筛选法:Poly-A 缺失筛选的载体设计与启动子缺失的设计基本相同,当打靶基因不能被诱导表达时,则考虑选用poly- A缺失敲除策略。Poly - A 缺失的正向选择基因 neo位于载体目的片段中, 由于neo 基因转录终止信号的缺失, 其表达受到抑制
运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。
根据所诱捕的表达调控序列的不同,广义的基因诱捕包括了增强子诱捕、基因诱捕、启动子诱捕、polyA 诱捕等多种类型。
基因捕获法优点:利用基因捕获可以建立一个携带随机插入突变的ES 细胞库
第七章
药品不良反应:在正常用法用量情况下出现的与治疗目的无关的有害反应。
不同个体对同一药物同一剂量的反应存在量与质的差异。
单核苷酸多态性:同一物种不同个体基因组DNA 的等位序列上单个核苷酸存在差别的现象。
单核苷酸多态性的特征:主要点突变 ;数量多,分布广泛;具有遗传稳定性;具有二态性,易于自动化、规模化分析;可以建立单体型区域;
单体型:位于一条染色体上倾向于整体遗传的一组紧密连锁遗传标记物。专指一组相关联的SNP 等位位点。
候选基因分析:(通过对已知候选基因与性状表型值的关联分析判断其是否就是主基因(药代动力学和药效动力学相关基因)或是否与主基因紧密连锁。
全基因组关联分析:是一种在全基因组范围内寻找与药物应答相关遗传变异的方法。
第八章
基因的功能是什么?
不同的基因参与了哪些细胞内不同的生命过程?
基因表达的调控、基因与基因产物之间的相互
作用、以及相同的基因在不同的细胞内或者疾
病和治疗状态下表达水平?
生物芯片包括:
DNA 芯片:寡核苷酸和cDNA
蛋白质芯片
其它芯片
按用途分:
表达谱芯片
诊断芯片
指纹图谱芯片
测序芯片
毒理芯片
样品与DNA 芯片上的探针阵列进行杂交。
与经典分子杂交的区别:
1、杂交时间短,30分钟内完成
2、可同时平行检测许多基因序列
影响杂交反应的因素:
盐浓度、温度、反应时间、DNA 二级结构
第九章
蛋白质组:指由一个基因组,或一个细胞、组织表达的所有蛋白质
第十章
基因表达:是指外源基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工成活性蛋白质的过程
在原核生物中,基因表达是以操纵子的形式进行的
载体
1. 克隆质粒载体
质粒(plasmid)是独立于染色体之外的、能自主复制的双链环状DNA 分子, 能递到子代,一般不整合到宿主染色体上。
受体细胞应具备的条件:
限制性缺陷型
易于重组子导入
遗传稳定性好
安全性高
功能互补,易于筛选
翻译后加工能力强
内源蛋白酶基因缺失或含量低
转导:是通过噬菌体感染将DNA 转入宿主细胞并产生新性状的过程
转化:是指某些细菌通过其细胞膜摄取周围供体的染色体片段,将此外源DNA 片段通过重组整合到自己染色体组的过程。
感受态细胞:受体细胞经过一些特殊方法(如:CaCl2等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生变化,能容许外源DNA 的载体分子。
重组DNA 技术操作过程可形象归纳为: 分
切分离目的基因 限制酶切目的基因与载体 接拼接重组体
转转入受体菌 筛筛选重组体
原核生物基因组中, 几个功能相关基因及其上游调控序列构成一个基因表达基本单位, 称为操纵子。 包涵体:在一定条件下,外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密地集中在一起形 成无膜的裸露结构,这种结构称为包涵体。
在构建外源蛋白表达载体时,将多个外源目的蛋白基因串连在一起,克隆在质粒载体上,以这种方式表达的外源蛋白称为寡聚型外源蛋白
将要表达的外源基因整合到染色体的非必需编码区上,使之成为染色体结构的一部分而稳定地遗传,以此种方式表达的外源蛋白即为整合型外源蛋白
外源基因的表达产物,通过运输或分泌的方式穿过细胞的外膜进入培养基中,即为分泌型外源蛋白 高效表达外源基因须考虑的基本原则:
优化表达载体的设计。
提高稀有密码子tRNA 的表达作用。
提高外源基因mRNA 的稳定性。
提高外源基因表达产物的稳定性。
优化发酵过程。
酵母基因表达系统的载体一般是一种穿梭质粒,能在酵母菌和大肠杆菌中进行复制。
选择标记 营养缺陷型选择标记:它与宿主的基因型有关。
显性选择标记:可用于各种类型的宿主细胞,并提供直观的选择标记。
酵母基因表达载体的种类:自主复制型质粒载体 整合型质粒载体
表达盒由启动子、分泌信号序列和终止子等组成,是酵母表达载体的重要元件。
表达宿主
主要包括:
酿酒酵母
巴斯德毕赤酵母
乳酸克努维酵母
多型汉森酵母等
外源基因在哺乳动物细胞中的表达包括基因的转录、mRNA 翻译及翻译后蛋白质加工等过程 哺乳动物基因表达载体:质粒载体
病毒载体