第26卷第4期食品与生物技术学报Vol. 26 No. 4 2007年7月J ul. 2007Journal of Food Science and Biotechnology
文章编号:167321689(2007) 0420121206
细菌芽孢形成机制在微生态制剂生产中的应用
徐世荣, 陈骧, 吴云鹏
(重庆大学生物工程学院, 重庆400044)
摘 要:, 并通过芽孢这种独特结构来实现。Spo0A 和σ。杆菌。为了得到最高的菌体浓度和芽孢形成率, 。、接种量、培养温度、p H 值、无机盐、淀粉、菌体浓度、。
关键词:; ; ; 芽孢形成机制; 芽孢形成率; 培养条件9文献标识码:A
Application of the Mechanism of Sporulation in Production of
Pharmaceutical Probiotics
XU Shi 2rong , CH EN Xiang , WU Yun 2peng
(College of Bioengineering , Chongqing University , Chongqing 400044,China )
Abstract :Pharmaceutical probiotics may be given as eit her a single or a mixt ure of living microorganisms used t herapeutically to prevent diarrhea , imp rove lacto se tolerance and modulate immunity. They may also have potential to p revent cancer and lower serum cholesterol levels. The viability and stability of probiotics were t he a marketing and technological challenge for commercial p roduction. Pharmaceutical probiotics should contain specific p robiotic st rains and maintain a certain amount of viable cells during t he p roduct’s shelf life. Many organisms of p robiotics have t he ability to form spores , bacterial endospores are t he most resistant living st ruct ures. Their high degree of resistance to many t reat ment s is due to many factors and is governed by t he unique spore st ruct ure. In t he whole process of sporulation , Spo0A and σfactors are key regulators to t he pattern of gene exp ression. Major differences between bacilli and clost ridia are existed in t he fact of formation of clost ridial stage cells and granulose accumulation in clo st ridia . To get t he highest cell concent ration and spore forming rate ,t he cult ure conditions , such as inoculum size , temperat ure , p H value , inorganic salt , amylum , cell concent ration , nut rient limitation were must optimized.
K ey w ords :p robiotics ; spore ; st ruct ure of endo spore ; mechanism of sporulation ; spore forming rate ; cult uring condition
收稿日期:2006203206.
作者简介:徐世荣(19472) , 男, 重庆市人, 高级工程师; 主要从事生物医学工程方面的研究. Email :xushirongg05
@tom.com
122食 品 与 生 物 技 术 学 报 第26卷
所必需的[6]。皮层对维持芽孢的抗性和休眠状态
很重要。
芽孢核心含有如DNA 等细胞代谢的必需成分。芽孢核心高度矿化, 主要包含Ca 2+, Mn 2+和Mg 2+, 它们与芽孢特殊成分吡啶二羧酸结合以螯合物的形式存在。在休眠芽孢中核心被脱水使得它的内含物具有热抵抗能力。核心的矿质化与降低核心水分含量有关, 。吡啶二羧酸(DPA ) , 。在枯草FB 基因发生突变的, DPA 合成酶的两个亚单[], H 2O 2的抗性, 可是DPA 含量减少的芽孢对紫外线的抗性没有降低甚至比其野生亲本更具抗性。在核心内含量很少的α/β型小的酸溶性芽孢蛋白(SASPs ) 在芽孢核心浓缩, 这与芽孢DNA 抗性有关且主要与紫外线抵抗力有关[8]。这些蛋白质也保护DNA 由热引起的损伤。没有α/β型小的酸溶性芽孢蛋白(SASPs ) 的芽孢比野生型芽孢的热抗性弱[9]。芽孢核心的低渗透性也在芽孢对有毒化学物质的抗性方面起重要作用。用于杀灭芽孢的有毒化学物质绝大多数是水溶性的并在水中进行反应, 这有理由猜测芽孢核心的水分含量较低能降低有毒化学物质同在芽孢核心的靶标的反应。
能产生芽孢的细菌主要是属于G +细菌的好气性的芽孢杆菌属(B acill us ) 和厌氧性的梭菌属(Clost ri di um ) 。芽孢(endospore 、spore ) 是产芽孢菌在生长发育后期在细胞内形成的圆形或椭圆形、厚壁含水量低、抗逆性强的休眠构造。芽孢没有新陈代谢, 能经受多种环境伤害, 包括热、紫外线、多种溶剂、酸、碱、酚类、醛、酶和烷基化试剂的处理[1]。作为微生态制剂中的微生物, 在制剂过程中要经过干燥、制粒、甚至是压片等处理过程; 口服制剂还需耐胃酸、胆盐; 在贮存期内需保持其活性; 甚至一些益生菌剂的疗效只归结为芽孢或它们在肠道外的营养生长[2]。因此, 通过干燥、制剂、, 性的重要指标理、的生物功能, 。
1 芽孢的结构
芽孢的基本结构存在于所有的芽孢形成菌的芽孢中。芽孢的抗性应归于很多因素, 并通过独特的芽孢结构来控制。芽孢的结构较为复杂, 它由芽孢囊和芽孢两大部分组成。芽孢又由胞外壁, 芽孢衣, 皮层和核心组成。核心包括芽孢壁、芽孢质、核区三个部分。
芽孢衣是由多达25种常有高度横向联系的多肽组成
[3]
。芽孢衣的蛋白质产生于母细胞内, 并沉
2 芽孢形成的分子机制
杆菌和梭菌中芽孢的形成在形态、生理学和分子生物学细胞事件方面显示出显著的相似性。主要差别是梭菌感受态细胞的形成和淀粉粒的积累[10]。活跃生长的枯草芽孢杆菌细胞通过碳源、氮源和在某些情况下的磷源限量添加, 起始信号导致控制转录的调节子Spo0A 通过磷酸化而活化, 随后在RNA 聚合酶σ因子的一系列作用下形成芽孢[11]。在37℃芽孢的形成大概需要7h 。激活的Spo0A 引起非对称的芽孢形成分裂和spo IIA , spo IIE 和spo IIG 位点的转录, 它们编码关键的芽
积在发展中的前芽孢表面。芽孢衣蛋白皮层的包裹确保芽孢免受溶菌酶等大分子的攻击。一株完全丧失芽孢衣层的枯草芽孢杆菌对溶菌酶高度敏感, 但是对热显示普通的抵抗力[4]。也有资料显示芽孢衣能保护芽孢抵抗小分子化学试剂的致死作用, 包括戊二醛、碘和一些氧化剂。这种作用的机制还不清楚, 可能芽孢衣是一些化学物质的渗透屏障, 或有毒化学物质只与芽孢衣起作用, 这就降低了对在芽孢核心的酶或DNA 等更中心的芽孢物质的损伤。尤其是它能防止肽聚糖溶解酶进入芽孢皮层。但对于一些有毒化学物质(如烷基化试剂) , 芽孢衣在其抗性方面不起什么作用[5]。
芽孢衣内侧一层是由几乎达到总芽孢干重的10%厚厚的肽聚糖构成皮层。近来对枯草芽孢杆
菌的芽孢肽聚糖生物合成的研究表明, 交联有明显的梯度。然而这种梯度不是核心脱水所必需的。这表明芽孢肽聚糖的低交联度是起一种平衡作用, 皮层的可降解性是芽孢生长和芽孢核心脱水效果
孢形成调节剂。芽孢化分裂产生两个命运迥然不同的细胞, 较小的前芽孢发展为芽孢, 母细胞是芽孢形成所必需的但最后溶解(细胞程序性死亡) 。通过前芽孢中芽孢形成专一的RNA 聚合酶σ因σF 和母细胞中σE 指导, 大概分裂后1h , 前芽孢子、
被母细胞吞噬。在基因调节下通过各部分信号把全局性的变化与各部分的形态变化偶联起来, 最后导致表征成熟芽孢的抗性的产生。
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Spo0A 磷酸化是芽孢形成所必需的正向调节
剂, 它激活几种芽孢形成专一基因的转录, 特别是spo IIA , spo IIE 和spo IIG 基因。有研究成果显示,
中, 德夸菌素能导致芽孢高效率地形成, 甚至在营
养丰富的培养基中[20]。饥饿与芽孢形成相联系的唯一可能的指示剂也是降低胞内GTP 的浓度。3. 2 提高菌群密度
在早期的母细胞的发育期间,Spo0A 可能就是芽孢
形成一种重要的因子[12]。基因组分析已指出Spo0A 直接调节121个基因的转录, 有三分之一被
激活, 其余的被抑制。其中包括几个转录因子, 更进一步甚至达400个基因直接受到Spo0A 的控制[13]。Spo0A 的不同的角色, 大概是由不同的磷酸化水平决定的。其他关键的芽孢形成的正向调节剂是一种σ因子σ, H 与核心RNA 聚合酶相互作用并指导它起始转录从至少49个启动子控制87个或
σH 和Spo0A 更多基因[14]。
切地相互联系、重叠, 。
对Rap 蛋白A 节来于p hrA , p hrC E 。值得注意的是p hr 基因转录受Cod Y 抑制[15]。Cod Y GTP 水平的启动相有重要作用, 并且作为中间代谢状态的主要指示剂[15]。Cod Y 是鸟嘌呤核苷酸水平的感受器[16]。GTP 和GDP 的浓度急剧下降是芽孢形成起始的关
近年来的研究表明, 许多种类的细菌在高细胞密度条件下也能通过化学信号(自体诱导物,auto 2inducer ) 传递帮助细胞监控细菌群体浓度的变化, 这一现象常常被称为“群体调节”(quorum sensing QS ) 。, 、多样。枯草芽胞杆菌(B acill us
也利用QS 系统对自身发育进行调控, 当
, 信号分子浓度相应增高启动了芽孢形成基因的表达[21]。3. 3 遗传因素
这也是芽孢形成的重要因素。有关芽孢形成的基因发生突变则该菌不形成芽孢。有人已构建了Clost ri di um bei j eri nckii 和Clost ri di um aceto 2
but y licum 的spo0A 破坏和缺失菌株。两个菌株不
能形成羧菌感受态细胞和芽孢[22]。这方面最显著的是在湿热抗性方面喜温菌的芽孢比中温菌芽孢抗性强, 低温微生物的芽孢对湿热的抗性最弱。
键。它发生在芽孢形成的起始, 并在没有芽孢形成的条件下触发芽孢的形成[17]。鸟嘌呤核苷酸水平下降解除了Cod Y 对p hrA 、p hr E 、kinB 间接的抑制, 从而为Spo0F 编码一种激酶[15]。因此Cod Y 与鸟嘌呤核苷酸水平下降相关并活化磷酸中继酶。以前认为杆菌和羧状芽孢杆菌之间的芽孢形成的机制相似, 但基因组测序显示羧状芽孢杆菌中不存在磷酸中继成分(Spo0A 例外) 。杆菌对营养限制的响应并形成芽孢, 保证存活到能获得新的底物。羧状芽孢杆菌用形成芽孢的方式来逃避因发酵形成的有机酸产生的恶劣的生存条件, 并伴随着外部和内部的p H 减小, 细胞质膜质子梯度消散
[18]
4 生产中获得较高芽孢率的措施
微生物工业的核心是实行规模化的微生物发酵。它的发展和创新性, 都必须处理好下面的问题:就是优良的菌种, 适当的反应器, 发酵用培养基的选定以及适合的、良好的检验方法。4. 1 在培养基中限量添加碳源、氮源, 有时限量添加磷源
B. s ubtilis 的芽孢形成是通过营养限量诱导
。且杆菌只形成一个芽孢, 梭状芽孢杆菌则可
在母细胞中形成众多的芽孢[19]。
的, 碳源、氮源和磷源都能作为相关的限制生长的底物, 因此, 在生产中有必要选择合适的碳源、氮源和磷源, 并注意限量添加, 同时加入必要的金属离子尤其是二价阳离子Mn 2+、Mg 2+、Ca 2+。在形成芽孢的培养基中添加Mn 2+能使芽孢的得率、稳定性提高、皮层结构改善, 并增加其热抵抗能力。Mn 2+与碳水化合物的代谢有密切关系。Mn 2+也在皮层生物合成的相关酶活性和(或) 基因表达中发
3 影响芽孢形成的主要因素
3. 1 降低GTP 浓度
反映环境中营养状况的胞内鸟嘌呤磷酸化水平的关键效应蛋白Cod Y 也是通过抑制p hrA 、p hr E 及KinB 等来影响Spo0A 磷酸化水平的[15]。
减少GTP 汇集的一个办法就是用德夸菌素(decoy 2inine ) 这种药物。德夸菌素是GM P 合成的一种抑制剂并阻止XM P 向GM P 转变, 这是导致GDP 和GTP 浓度降低的原因, 当被加到快速生长的细胞
挥作用。4. 2 菌种活化及一些必要的处理确保良好的遗传性状
用80℃或更高温度水浴一定时间以有效杀死菌种中的营养体和可能潜在的杂菌及可能存在的
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好的效果。接种量、溶解氧、初始p H 和芽孢形成时
的p H 值也是影响芽孢形成的重要因素。梭状芽孢杆菌的培养基中添加适量的淀粉对芽孢形成有一定的促进作用, 发酵培养时间是影响菌体浓度及芽孢成熟率的重要因素。
不产生芽孢的变异菌株, 将芽孢接种到培养基中活化培养, 使之得到有效地提纯和复壮[23], 这对提高菌数和芽孢率均有显著的影响。但目前这在国内微生物制剂的生产中较少采用。大多数是直接将冻干管菌种加入适温培养基中培养, 培养前最好洗脱低温保护剂, 更换新鲜培养液。菌种用培养基一定要选择合适的营养丰富的培养基, 在最佳条件下培养, 这样可在一定程度上防止菌种退化。Clos 2t ri di um per f ri ngens 在p H2的环境中暴露30min 后, 其芽孢形成能力增加了。这些表明, 在生产前对菌种作一些必要的处理有利于提高芽孢的得率。4. 3 采用分段培养的策略同的。, 刺激产生更多的菌体, 。通过采用这种策略和最佳的实验条件, 菌体(B acill us coag ul ans R K 202) 增加了大约55%, 芽孢在每克干菌体中达到109～1011[24]。4. 4 芽孢的萌发
对于益生菌, 芽孢在胃肠道中的萌发是它起作用的关键, 只有萌发后它才能发挥免疫的调节作用和分泌抗微生物物质[25]。如采用菌落计数法检测芽孢率则也必须考虑萌发因素。芽孢萌发是一系列通过特殊萌发剂触发的连续的降解事件, 会导致其丧失特殊的芽孢特性。将芽孢暴露于亚致死量的NaO H 溶液中抽提一些芽孢衣蛋白比没有处理的芽孢萌发更快。芽孢自然萌发可能仅是对萌发剂的反应。当营养萌发剂结合到受体复合物并激活芽孢萌发专一的皮层溶解酶。这些萌发剂通常是特定的氨基酸、糖类或嘌呤核苷酸, 此外也有引发芽孢萌发的营养混合物, 一个是天门冬氨酸、葡萄糖、果糖和K +(A GF K ) 混合物引发枯草芽孢杆菌萌发[26]。除营养物外芽孢也能通过多种非营养因素引发芽孢萌发[27], 包括溶菌酶、Ca 2+–DPA , 阳离子表面活性剂、高压和盐等。近年来国内对益生芽孢菌也有较多的研究, 李野、张小平等对蜡质芽孢杆菌DL SL 22的发酵条件和培养基作了一些探索工作[28]。吴俊罡、张秉胜等对枯草芽孢杆菌发酵培养基的进行了优化实验[29]。杜冰、刘长海对芽孢乳酸杆菌D 21的液体深层发酵培养进行了探讨[30]。匡群、孙梅、施大林对酪酸梭状芽孢杆菌的培养条件进行了研究[31], 并取得了较
5 存在的问题及展望
德国细菌学家R. 科赫于年已揭示炭疽病杆状弧菌, 观察到炭疽芽。可是, 尽管付。对提、芽孢率的方法的研究虽有较大进展但仍不太系统, 缺乏可靠的、普遍适用的理论指导, 在研究中对影响因素考虑也欠全面, 主要集中在培养基的优化及一些常规培养条件优化上。在芽孢菌剂的生产中仍存在菌数低、芽孢率不高且不可控等问题。不过, 在芽孢菌剂生产中从以下方面入手一般能取得较好的生产效果:1) 微生物具有易变异的特点, 且芽孢是在特定的条件下才能形成, 生产中在保证制剂的疗效和安全性的基础上不断筛选、培育出生产周期短, 菌体、芽孢得率高的菌种;2) 减少接种传代次数, 种子培养阶段培养基营养要适当丰富;3) 从发酵培养基成分、发酵工艺上创造芽孢形成的条件, 提高芽孢率;4) 结合适当的后工序措施, 延长芽孢菌剂的贮存期; 5) 努力探索适于特定菌种的检测方法。
芽孢的抗性机制和形成机制的研究对食品业、农业、医药业都具有极为重要的意义。随着分子生物学技术和现代发酵调控技术的发展, 对芽孢的抗性形成机制和分子机制的研究将会更深入的、更清析。数学的发展也为我们研究多因素问题提供了的方法上的指导。单细胞生物的代谢调节主要是酶的调节, 酶的催化作用具有高效性、专一性和需要适宜条件的特点。微生物在生长过程中, 机体的复杂代谢过程是互相协调和高度有序, 又能对外界环境的改变迅速作出反应。因此, 芽孢菌活菌制剂的生产也必将会更加全面地考虑影响芽孢形成的诸多因素, 优化芽孢菌的培养和芽孢形成条件, 逐步达到芽孢率高、稳定性好、生产成本低、生产可控化、贮存期较长的目标。芽孢益生菌剂将以其独特的保健和治疗功能为人类的健康事业作出贡献。
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(责任编辑:李春丽)
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所必需的[6]。皮层对维持芽孢的抗性和休眠状态
很重要。
芽孢核心含有如DNA 等细胞代谢的必需成分。芽孢核心高度矿化, 主要包含Ca 2+, Mn 2+和Mg 2+, 它们与芽孢特殊成分吡啶二羧酸结合以螯合物的形式存在。在休眠芽孢中核心被脱水使得它的内含物具有热抵抗能力。核心的矿质化与降低核心水分含量有关, 。吡啶二羧酸(DPA ) , 。在枯草FB 基因发生突变的, DPA 合成酶的两个亚单[], H 2O 2的抗性, 可是DPA 含量减少的芽孢对紫外线的抗性没有降低甚至比其野生亲本更具抗性。在核心内含量很少的α/β型小的酸溶性芽孢蛋白(SASPs ) 在芽孢核心浓缩, 这与芽孢DNA 抗性有关且主要与紫外线抵抗力有关[8]。这些蛋白质也保护DNA 由热引起的损伤。没有α/β型小的酸溶性芽孢蛋白(SASPs ) 的芽孢比野生型芽孢的热抗性弱[9]。芽孢核心的低渗透性也在芽孢对有毒化学物质的抗性方面起重要作用。用于杀灭芽孢的有毒化学物质绝大多数是水溶性的并在水中进行反应, 这有理由猜测芽孢核心的水分含量较低能降低有毒化学物质同在芽孢核心的靶标的反应。
能产生芽孢的细菌主要是属于G +细菌的好气性的芽孢杆菌属(B acill us ) 和厌氧性的梭菌属(Clost ri di um ) 。芽孢(endospore 、spore ) 是产芽孢菌在生长发育后期在细胞内形成的圆形或椭圆形、厚壁含水量低、抗逆性强的休眠构造。芽孢没有新陈代谢, 能经受多种环境伤害, 包括热、紫外线、多种溶剂、酸、碱、酚类、醛、酶和烷基化试剂的处理[1]。作为微生态制剂中的微生物, 在制剂过程中要经过干燥、制粒、甚至是压片等处理过程; 口服制剂还需耐胃酸、胆盐; 在贮存期内需保持其活性; 甚至一些益生菌剂的疗效只归结为芽孢或它们在肠道外的营养生长[2]。因此, 通过干燥、制剂、, 性的重要指标理、的生物功能, 。
1 芽孢的结构
芽孢的基本结构存在于所有的芽孢形成菌的芽孢中。芽孢的抗性应归于很多因素, 并通过独特的芽孢结构来控制。芽孢的结构较为复杂, 它由芽孢囊和芽孢两大部分组成。芽孢又由胞外壁, 芽孢衣, 皮层和核心组成。核心包括芽孢壁、芽孢质、核区三个部分。
芽孢衣是由多达25种常有高度横向联系的多肽组成
[3]
。芽孢衣的蛋白质产生于母细胞内, 并沉
2 芽孢形成的分子机制
杆菌和梭菌中芽孢的形成在形态、生理学和分子生物学细胞事件方面显示出显著的相似性。主要差别是梭菌感受态细胞的形成和淀粉粒的积累[10]。活跃生长的枯草芽孢杆菌细胞通过碳源、氮源和在某些情况下的磷源限量添加, 起始信号导致控制转录的调节子Spo0A 通过磷酸化而活化, 随后在RNA 聚合酶σ因子的一系列作用下形成芽孢[11]。在37℃芽孢的形成大概需要7h 。激活的Spo0A 引起非对称的芽孢形成分裂和spo IIA , spo IIE 和spo IIG 位点的转录, 它们编码关键的芽
积在发展中的前芽孢表面。芽孢衣蛋白皮层的包裹确保芽孢免受溶菌酶等大分子的攻击。一株完全丧失芽孢衣层的枯草芽孢杆菌对溶菌酶高度敏感, 但是对热显示普通的抵抗力[4]。也有资料显示芽孢衣能保护芽孢抵抗小分子化学试剂的致死作用, 包括戊二醛、碘和一些氧化剂。这种作用的机制还不清楚, 可能芽孢衣是一些化学物质的渗透屏障, 或有毒化学物质只与芽孢衣起作用, 这就降低了对在芽孢核心的酶或DNA 等更中心的芽孢物质的损伤。尤其是它能防止肽聚糖溶解酶进入芽孢皮层。但对于一些有毒化学物质(如烷基化试剂) , 芽孢衣在其抗性方面不起什么作用[5]。
芽孢衣内侧一层是由几乎达到总芽孢干重的10%厚厚的肽聚糖构成皮层。近来对枯草芽孢杆
菌的芽孢肽聚糖生物合成的研究表明, 交联有明显的梯度。然而这种梯度不是核心脱水所必需的。这表明芽孢肽聚糖的低交联度是起一种平衡作用, 皮层的可降解性是芽孢生长和芽孢核心脱水效果
孢形成调节剂。芽孢化分裂产生两个命运迥然不同的细胞, 较小的前芽孢发展为芽孢, 母细胞是芽孢形成所必需的但最后溶解(细胞程序性死亡) 。通过前芽孢中芽孢形成专一的RNA 聚合酶σ因σF 和母细胞中σE 指导, 大概分裂后1h , 前芽孢子、
被母细胞吞噬。在基因调节下通过各部分信号把全局性的变化与各部分的形态变化偶联起来, 最后导致表征成熟芽孢的抗性的产生。
第4期徐世荣等:细菌芽孢形成机制在微生态制剂生产中的应用123
Spo0A 磷酸化是芽孢形成所必需的正向调节
剂, 它激活几种芽孢形成专一基因的转录, 特别是spo IIA , spo IIE 和spo IIG 基因。有研究成果显示,
中, 德夸菌素能导致芽孢高效率地形成, 甚至在营
养丰富的培养基中[20]。饥饿与芽孢形成相联系的唯一可能的指示剂也是降低胞内GTP 的浓度。3. 2 提高菌群密度
在早期的母细胞的发育期间,Spo0A 可能就是芽孢
形成一种重要的因子[12]。基因组分析已指出Spo0A 直接调节121个基因的转录, 有三分之一被
激活, 其余的被抑制。其中包括几个转录因子, 更进一步甚至达400个基因直接受到Spo0A 的控制[13]。Spo0A 的不同的角色, 大概是由不同的磷酸化水平决定的。其他关键的芽孢形成的正向调节剂是一种σ因子σ, H 与核心RNA 聚合酶相互作用并指导它起始转录从至少49个启动子控制87个或
σH 和Spo0A 更多基因[14]。
切地相互联系、重叠, 。
对Rap 蛋白A 节来于p hrA , p hrC E 。值得注意的是p hr 基因转录受Cod Y 抑制[15]。Cod Y GTP 水平的启动相有重要作用, 并且作为中间代谢状态的主要指示剂[15]。Cod Y 是鸟嘌呤核苷酸水平的感受器[16]。GTP 和GDP 的浓度急剧下降是芽孢形成起始的关
近年来的研究表明, 许多种类的细菌在高细胞密度条件下也能通过化学信号(自体诱导物,auto 2inducer ) 传递帮助细胞监控细菌群体浓度的变化, 这一现象常常被称为“群体调节”(quorum sensing QS ) 。, 、多样。枯草芽胞杆菌(B acill us
也利用QS 系统对自身发育进行调控, 当
, 信号分子浓度相应增高启动了芽孢形成基因的表达[21]。3. 3 遗传因素
这也是芽孢形成的重要因素。有关芽孢形成的基因发生突变则该菌不形成芽孢。有人已构建了Clost ri di um bei j eri nckii 和Clost ri di um aceto 2
but y licum 的spo0A 破坏和缺失菌株。两个菌株不
能形成羧菌感受态细胞和芽孢[22]。这方面最显著的是在湿热抗性方面喜温菌的芽孢比中温菌芽孢抗性强, 低温微生物的芽孢对湿热的抗性最弱。
键。它发生在芽孢形成的起始, 并在没有芽孢形成的条件下触发芽孢的形成[17]。鸟嘌呤核苷酸水平下降解除了Cod Y 对p hrA 、p hr E 、kinB 间接的抑制, 从而为Spo0F 编码一种激酶[15]。因此Cod Y 与鸟嘌呤核苷酸水平下降相关并活化磷酸中继酶。以前认为杆菌和羧状芽孢杆菌之间的芽孢形成的机制相似, 但基因组测序显示羧状芽孢杆菌中不存在磷酸中继成分(Spo0A 例外) 。杆菌对营养限制的响应并形成芽孢, 保证存活到能获得新的底物。羧状芽孢杆菌用形成芽孢的方式来逃避因发酵形成的有机酸产生的恶劣的生存条件, 并伴随着外部和内部的p H 减小, 细胞质膜质子梯度消散
[18]
4 生产中获得较高芽孢率的措施
微生物工业的核心是实行规模化的微生物发酵。它的发展和创新性, 都必须处理好下面的问题:就是优良的菌种, 适当的反应器, 发酵用培养基的选定以及适合的、良好的检验方法。4. 1 在培养基中限量添加碳源、氮源, 有时限量添加磷源
B. s ubtilis 的芽孢形成是通过营养限量诱导
。且杆菌只形成一个芽孢, 梭状芽孢杆菌则可
在母细胞中形成众多的芽孢[19]。
的, 碳源、氮源和磷源都能作为相关的限制生长的底物, 因此, 在生产中有必要选择合适的碳源、氮源和磷源, 并注意限量添加, 同时加入必要的金属离子尤其是二价阳离子Mn 2+、Mg 2+、Ca 2+。在形成芽孢的培养基中添加Mn 2+能使芽孢的得率、稳定性提高、皮层结构改善, 并增加其热抵抗能力。Mn 2+与碳水化合物的代谢有密切关系。Mn 2+也在皮层生物合成的相关酶活性和(或) 基因表达中发
3 影响芽孢形成的主要因素
3. 1 降低GTP 浓度
反映环境中营养状况的胞内鸟嘌呤磷酸化水平的关键效应蛋白Cod Y 也是通过抑制p hrA 、p hr E 及KinB 等来影响Spo0A 磷酸化水平的[15]。
减少GTP 汇集的一个办法就是用德夸菌素(decoy 2inine ) 这种药物。德夸菌素是GM P 合成的一种抑制剂并阻止XM P 向GM P 转变, 这是导致GDP 和GTP 浓度降低的原因, 当被加到快速生长的细胞
挥作用。4. 2 菌种活化及一些必要的处理确保良好的遗传性状
用80℃或更高温度水浴一定时间以有效杀死菌种中的营养体和可能潜在的杂菌及可能存在的
124食 品 与 生 物 技 术 学 报 第26卷
好的效果。接种量、溶解氧、初始p H 和芽孢形成时
的p H 值也是影响芽孢形成的重要因素。梭状芽孢杆菌的培养基中添加适量的淀粉对芽孢形成有一定的促进作用, 发酵培养时间是影响菌体浓度及芽孢成熟率的重要因素。
不产生芽孢的变异菌株, 将芽孢接种到培养基中活化培养, 使之得到有效地提纯和复壮[23], 这对提高菌数和芽孢率均有显著的影响。但目前这在国内微生物制剂的生产中较少采用。大多数是直接将冻干管菌种加入适温培养基中培养, 培养前最好洗脱低温保护剂, 更换新鲜培养液。菌种用培养基一定要选择合适的营养丰富的培养基, 在最佳条件下培养, 这样可在一定程度上防止菌种退化。Clos 2t ri di um per f ri ngens 在p H2的环境中暴露30min 后, 其芽孢形成能力增加了。这些表明, 在生产前对菌种作一些必要的处理有利于提高芽孢的得率。4. 3 采用分段培养的策略同的。, 刺激产生更多的菌体, 。通过采用这种策略和最佳的实验条件, 菌体(B acill us coag ul ans R K 202) 增加了大约55%, 芽孢在每克干菌体中达到109～1011[24]。4. 4 芽孢的萌发
对于益生菌, 芽孢在胃肠道中的萌发是它起作用的关键, 只有萌发后它才能发挥免疫的调节作用和分泌抗微生物物质[25]。如采用菌落计数法检测芽孢率则也必须考虑萌发因素。芽孢萌发是一系列通过特殊萌发剂触发的连续的降解事件, 会导致其丧失特殊的芽孢特性。将芽孢暴露于亚致死量的NaO H 溶液中抽提一些芽孢衣蛋白比没有处理的芽孢萌发更快。芽孢自然萌发可能仅是对萌发剂的反应。当营养萌发剂结合到受体复合物并激活芽孢萌发专一的皮层溶解酶。这些萌发剂通常是特定的氨基酸、糖类或嘌呤核苷酸, 此外也有引发芽孢萌发的营养混合物, 一个是天门冬氨酸、葡萄糖、果糖和K +(A GF K ) 混合物引发枯草芽孢杆菌萌发[26]。除营养物外芽孢也能通过多种非营养因素引发芽孢萌发[27], 包括溶菌酶、Ca 2+–DPA , 阳离子表面活性剂、高压和盐等。近年来国内对益生芽孢菌也有较多的研究, 李野、张小平等对蜡质芽孢杆菌DL SL 22的发酵条件和培养基作了一些探索工作[28]。吴俊罡、张秉胜等对枯草芽孢杆菌发酵培养基的进行了优化实验[29]。杜冰、刘长海对芽孢乳酸杆菌D 21的液体深层发酵培养进行了探讨[30]。匡群、孙梅、施大林对酪酸梭状芽孢杆菌的培养条件进行了研究[31], 并取得了较
5 存在的问题及展望
德国细菌学家R. 科赫于年已揭示炭疽病杆状弧菌, 观察到炭疽芽。可是, 尽管付。对提、芽孢率的方法的研究虽有较大进展但仍不太系统, 缺乏可靠的、普遍适用的理论指导, 在研究中对影响因素考虑也欠全面, 主要集中在培养基的优化及一些常规培养条件优化上。在芽孢菌剂的生产中仍存在菌数低、芽孢率不高且不可控等问题。不过, 在芽孢菌剂生产中从以下方面入手一般能取得较好的生产效果:1) 微生物具有易变异的特点, 且芽孢是在特定的条件下才能形成, 生产中在保证制剂的疗效和安全性的基础上不断筛选、培育出生产周期短, 菌体、芽孢得率高的菌种;2) 减少接种传代次数, 种子培养阶段培养基营养要适当丰富;3) 从发酵培养基成分、发酵工艺上创造芽孢形成的条件, 提高芽孢率;4) 结合适当的后工序措施, 延长芽孢菌剂的贮存期; 5) 努力探索适于特定菌种的检测方法。
芽孢的抗性机制和形成机制的研究对食品业、农业、医药业都具有极为重要的意义。随着分子生物学技术和现代发酵调控技术的发展, 对芽孢的抗性形成机制和分子机制的研究将会更深入的、更清析。数学的发展也为我们研究多因素问题提供了的方法上的指导。单细胞生物的代谢调节主要是酶的调节, 酶的催化作用具有高效性、专一性和需要适宜条件的特点。微生物在生长过程中, 机体的复杂代谢过程是互相协调和高度有序, 又能对外界环境的改变迅速作出反应。因此, 芽孢菌活菌制剂的生产也必将会更加全面地考虑影响芽孢形成的诸多因素, 优化芽孢菌的培养和芽孢形成条件, 逐步达到芽孢率高、稳定性好、生产成本低、生产可控化、贮存期较长的目标。芽孢益生菌剂将以其独特的保健和治疗功能为人类的健康事业作出贡献。
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(责任编辑:李春丽)
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