生物技术制药
一， 绪论
生物技术制药（Biotechnological Pharmaceutics）是指运用生物技术，借助微生物，植物或动物细胞进行药品研发与生产的一门应用性科学。其主要产品是以蛋白质、多肽、基因片段为结构基础的疫苗、抗体、细胞因子等治疗预防诊断用途的药品。
结构基础
药理基础
制备方法
药物用途
举例 生物药品 多肽、蛋白质、核苷酸 免疫调节 生物工程与免疫学技术 预防、治疗、诊断 化药 中药 无机或有机化合物分子 单体分子或动植物混合物 生化生理代谢调节 化学合成 治疗 类似化药 物理或生物生化技术提取 治疗 板蓝根、六味地黄丸 乙肝疫苗、胰岛素、免疫试剂盒 抗生素
二， 基因工程制药
基因工程制药（genetic engineering pharmaceutics ）利用基因重组技术将外源基因导入宿主菌或细胞进行大规模培养，以获得核酸或蛋白质药物的过程称为基因工程制药 。
基本环节：上游【基因工程菌的构建与筛选（分子克隆）】——获得目的基因，构建重组质粒，构建筛选基因工
程菌/细胞
下游——培养工程菌/细胞，产物分离纯化，半成品制备与检定，成品制备与检定
分子克隆常用工具：
1、工具酶
限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease, RE) “手术刀”
DNA连接酶 “缝合线” 反转录酶 （RNA-DNA）
DNA聚合酶 （PCR：Taq） 核酸修饰酶 （核酸酶、磷酸化酶等）
2、载体
携带外源基因进入受体细胞在其中进行扩增或诱导表达
载体分类
1.克隆载体: 具组装、复制、扩增功能。如：pBR322、pUC18/19等。
2.表达载体: 不仅具组装、复制、扩增功能，还有转录表达功能。如：pBV220、
pKK223-3
突变载体、报告载体
载体的共同特征
① 携带外源性目的基因前后均能自主复制
② 易于扩增、分离纯化
③ 有单一酶切位点（多克隆位点，MCS）
单一酶切位点：一种酶在一个载体上只有一个酶切位点
多克隆位点：一个载体上的某一个区域含有多个单一酶切位点
④ 有选择标记基因
⑤ 表达载体还应有表达调控元件（启动子、增强子、终止子、SD序列等）
质粒（plasmid）：存在与细菌胞内的一类独立于染色体而可以自我复制的遗传物质。
3、外源基因表达的宿主细胞
原核： 大肠杆菌；枯草芽孢杆菌
真核： 酵母；哺乳动物细胞（CHO、COS、3T3）
大肠杆菌表达系统
枯草芽孢杆菌表达系统
酵母表达系统
动物细胞表达系统
外源（目的）基因的制备
1．直接从染色体DNA或质粒中分离：仅适用于原核生物基因的分离。
2．人工合成：适应于编码小分子多肽的基因。长片段的合成（重叠延伸PCR）。
3．从mRNA合成cDNA：通常可得到可表达的完整基因。
4．从基因文库中筛选：具有组织细胞特异性
5．利用PCR合成:已知目的基因两端的序列
PCR（Polymerase Chain Reaction）:即聚合酶链式反应,是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，按照碱基互补配对的原则体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。
修饰与改造的主要手段
1. 构建突变体：
点突变技术
✓ 寡核苷酸介导的基因突变
✓ 盒式突变或片段取代突变
✓ PCR介导的突变
2. 融合蛋白：
提高目的蛋白的表达
提高蛋白质的稳定性
调节目的蛋白的功能、活性（如佐剂，靶向蛋白等）
改变目的蛋白的构象
3. 化学结构修饰：
✓ PEG ✓ 高分子多聚物
✓ 糖及糖的衍生物 ✓ 生物大分子
三，蛋白质工程
蛋白质分离纯化的一般过程
1.前处理 (pretreatment) 把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不丢失生物活性。
2.粗分级分离 (rough fractionation) ：当蛋白质提取液(有时还杂有核酸、多糖之类)获得后，选用一套适当方法，将目的蛋白与大多数杂蛋白分离开来。
3.细分级分离 (fine fractionation) 即精细纯化，是根据蛋白分子的理化性质和生物学特性选用不同纯化方法。 分离纯化的技术要求：
①条件温和，保持产物生物活性。 ④两个技术间能直接衔接，无需样品处理。 ②选择性好，分辨率高。 ⑤纯化过程要快，满足高生产率的要求。
③收率要高。
盐析法
盐溶（Salting in）:蛋白质在纯水或低盐溶液中溶解度较低，若稍加一些无机盐则溶解度增加，这种现象称为“盐溶” 。
盐析（salting-out): 当盐浓度继续增加到某一浓度时，蛋白质又变得不溶而自动析出，这种现象称为“盐析”。 盐析原理
蛋白质在溶液中稳定存在的原因：
✓ 表面电荷 ✓ 水化膜
当盐浓度增加到一定浓度时，大量水同盐分子结合，破坏了蛋白质水化膜，容易沉淀出来 ；同时盐离子中和蛋白质分子，相互碰撞时发生聚集而沉淀出来，即出现“盐析”现象。常用无机盐：氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸
铵等。
层析法 (chromatography)层析技术也称色谱技术，是利用混和物中各组分理化性质（吸附力、分子形状、大小、分子极性、分子亲和力以及分配系数）的差异，在物质经过两相中进行分离的一种技术。按固定相基质的形式：柱层析、纸层析和薄层层析。
离子交换层析ion exchange chromatography
原理：
利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。电荷不同的蛋白质，对管柱上的离子交换剂有不同的亲和力，改变冲洗液的离子强度和pH值，物质就能依次从层析柱中分离出来。
凝胶过滤(gel filtration) 亦称凝胶色谱、排阻色谱或分子筛，是利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相，对混合中各组份按分子大小进行分离的层析技术。
应用
● 分离蛋白质 ● 蛋白质分子量的测定
● 脱盐 ● 蛋白质寡聚状态分析
亲和层析(affinity chromatography）是利用待分离物质与其特异性配体之间特异性的亲和力进行分离的一类特殊的层析技术。
原理：
四，动物细胞工程
动物细胞的培养特性：
无细胞壁，适应环境能力差 多贴壁生长，有接触抑制现象
倍增时间长，生长缓慢, >15h 产物分泌在细胞外，便于收集和纯化
对培养基要求高，易受微生物污染 对目的蛋白质进行翻译后修饰
培养基本技术：
1. 细胞原代培养
2. 细胞传代培养：将细胞从一个培养皿中消化、分散并接种至另一个培养皿。
3. 细胞克隆培养：即单细胞分离培养，将动物组织分散后，将一个细胞从群体细胞分离出，由单个细胞培养成
纯系细胞集群。常用于生产单克隆抗体的杂交瘤细胞株的筛选。
4. 动物细胞的冻存与复苏
动物细胞大规模培养
1、悬浮培养法：
细胞在反应器中自由悬浮生长，在微生物发酵的基础上发展起来的。用于重组蛋白和单抗生产。
转瓶、滚瓶、发酵罐。常用的生物反应器为搅拌式和气升式
2.微载体培养法
⏹ 用于贴壁细胞的大规模培养，其原理是将对细胞无害的微载体颗粒（60-250 um)加入培养容器的培养液中，
作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。
⏹ 使贴壁细胞的培养兼有悬浮培养和固定化培养的优点
3. 多孔载体培养法
多孔载体（如玻璃、陶瓷、明胶等）内部有很多网状小孔，细胞可以在里面生长，免受搅拌造成的机械损伤。即可以用于悬浮细胞的固定化连续培养，又可以用于细胞的贴壁培养。
4. 微囊化培养法
在无菌条件下将拟培养的细胞、生物活性物质及生长介质共同包裹在薄的半透膜中形成微囊, 再将微囊放入培养系统内进行培养。生长介质为1. 4 %海藻酸钠溶液, 半透膜由多聚赖氨酸形成。
5. 中空纤维培养法
模拟细胞在体内的三维状态，把细胞接种在中空纤维的外腔，利用中空纤维模拟毛细血管提供营养，使细胞高密度的生长。
转基因动物(transgenic animal)：
借助基因工程技术把外源目的基因导入生殖细胞、胚胎干细胞和早期胚胎，并在受体染色体上稳定整合，使之经过各种发育途径得到能把外源目的基因传给子代的个体。
应用：
⏹ 1. 基础研究，如发育生物学、遗传学等。
⏹ 2. 疾病模型，如肿瘤、心血管疾病等。
⏹ 3. 改良培育，如：生产出生长快、产肉、产毛、产奶更多而耗料极少的转基因家畜。
⏹ 4. 生物制药：tPA（组织型纤溶酶原激活剂）在转基因小鼠的乳汁中得到了表达，转基因山羊乳汁中表达抗凝血酶III
五，发酵工程
发酵工程（Fermentation Engineering）：利用微生物生长代谢活动产生的各种生理活性物质来生产商业产品。
发酵工程制药Fermentation Engineering Pharmaceutics：结合相关交叉学科的基本原理，利用微生物的某些特定性状，运用现代生物工程技术，在生物反应器中生产医药生物制品的一种技术体系。
过程
✧ 上游工程包括优良菌种的选育、最适发酵条件（培养基的组成、pH、温度和溶氧等）的优化等。
✧ 发酵生产是指在最适条件下，在发酵罐中生产细胞和代谢产物的工艺技术，本阶段是整个发酵工程的中心
环节，要有严格的无菌生长环境。
✧ 下游工程是指发酵液中产品的分离纯化与鉴定，副产物的回收，废物处理等。
发酵方式
分批发酵(batch fermentation)：是将发酵培养基组分一次性投入发酵罐，经灭菌、接种和发酵后，再一次性的将发酵液放出的一种间歇式发酵操作类型，又称间歇式发酵。分批发酵是一种准封闭系统，在发酵过程中除了控制温度，不断进行通气（好氧发酵）和加入酸碱溶液调节pH外，与外界没有其他物料交换。
补料-分批发酵(fed-batch fermentation)：是在分批发酵过程中间歇或连续的以某种方式补入新鲜料液，克服由于养分不足而导致发酵过早结束的问题。通过向培养系统中补充物料，可以使培养液中的底物浓度较长时间的保持在一定范围内，既保证菌体细胞的生长需要，又不造成阻遏抑制等不良影响，从而达到提高产物浓度和得率的目的。 半连续发酵(semi-continuous fermentation)：在补料分批培养基基础上，加上间歇放掉部分发酵液进入下游提取工段的发酵操作方式。补料分批发酵虽然可以通过补料补充养分或前体的不足，但由于有害代谢产物的积累，产物合成还是会受到阻遏。半连续培养不仅可以补充养分和前体，而且有害代谢物质被稀释，有利于产物的继续合成。 连续发酵(continuous fermentation)是当发酵过程进行到一定阶段时（如产物合成时期）一边连续补充发酵培养液，一边又以相同的流速放出发酵液，维持发酵液原来的体积的发酵方式，微生物在稳定状态下生长和代谢。连续发酵使微生物的生长和代谢活动保持旺盛的稳定状态，从而使产率和产品质量也相应保持稳定.
发酵过程的影响因素及控制
（一）菌体浓度的影响及控制：
菌体浓度(cell concentration)：是指单位体积培养液中菌体的含量。菌体浓度的大小，在一定条件下，不仅反映菌体细胞的多少，而且反映菌体细胞生理特性的不同阶段，因此在实验室研究和工业发酵上，它都是一个重要的参数。
（二）营养物质对发酵的影响及控制：
各种营养物质对微生物生长繁殖和代谢产物的合成都很重要，但在为微生物提供营养物质时，必须重视各种营养物质的浓度和配比，以达到维持正常的渗透压、节约原材料及提高代谢产物产量的目的。
（三）温度的影响及控制：
最适生长温度为37℃。大多数表达系统采用低于37℃ 的培养温度，因为低温使营养物的摄入和生长速率降低，乙酸盐及其他抑制性副产物的形成也随之减少。
（四）pH的影响和控制：
pH 梯度法，即生长期控制较高的pH 为7.O～7.3，加速菌体生长，生产期降低pH 至6.7～ 7.0，以减少异体蛋白的干扰，从而提高包涵体中目的蛋白的产量。
（五）溶氧的影响和控制：
溶氧是需氧微生物生长所必需的。在发酵过程中有多方面的限制因素，而溶氧往往最易成为限制因素。 溶解氧浓度的变化受供氧能力的变化、菌龄的不同、加料及补水措施、改变通风量等多因素影响。
控制好溶解氧浓度，需从供、需两方面考虑。在实际生产过程中，主要通过调节搅拌转速、通气速率及补料
速率来控制供氧。
（六）泡沫的影响及控制：
过多的泡沫会给发酵带来负面影响：
①降低生产能力；
②大量气泡引起“逃液”，造成原料和产物的损失；
③影响菌体呼吸；
④泡沫使部分菌体黏附在罐顶或罐壁上，使发酵液中菌体量减少；
⑤泡沫升至罐顶，顶至轴封或逃液，增加染菌机会；
⑥消泡剂的加入会给提取工艺带来困难。
六，疫苗
疫苗（vaccine）：主要是指将病原微生物及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的免疫制剂，例如流感疫苗、乙肝疫苗等。
1796年，Jenner进行了第一个预防天花人体实验,诞生了世界上第一个疫苗。
四次疫苗革命 十九世纪末，以疫苗之父巴斯德为代表，先后研制成减毒炭疽、霍乱及狂犬病疫苗，形成了第一次疫苗革命。 1962年，基因重组疫苗开始出现，并于1986
1992年，Tang2000 核酸疫苗又称基因疫苗，DNA疫苗，是指将含有编码某种抗原蛋白基因序列的质粒载体作为疫苗，直接导动物细胞内，从而通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，达到免疫的目的。 治疗性疫苗(Therapeutic vaccine)是指在已感染病原微生物或已患有某些疾病的机体中，通过诱导特异性的免疫应答，达到治疗或防止疾病恶化的天然、人工合成或用基因重组技术表达的产品或制品
反向疫苗学（reverse vaccinology ）是从全基因水平来筛选具有保护性免疫反应的候选抗原的疫苗发展策略。它以微生物基因组为平台，对毒力因子、外膜抗原、侵袭及毒力相关抗原等蛋白基因进行高通量克隆、表达，纯化出重组蛋白。然后，再对纯化后的抗原进行体内、体外评价，筛选出保护性抗原，进行疫苗研究。
疫苗的组成
抗原
稳定剂
佐剂
灭活剂
防腐剂
缓冲液、盐类等非活性成分
佐剂Adjuvant ：是指那些与抗原一起或先于抗原注入机体后可增强机体对该抗原的免疫应答能力或改变免疫应答类型的辅助物质。佐剂可以具备免疫原性，也可无免疫原性。
作用：
（1）增加抗原的表面积，从而增强抗原的免疫原性；
（2）佐剂与抗原混合能延长抗原在局部组织的存留时间，减低抗原的分解速度，使抗原缓慢释放至淋巴系统中，持续刺激机体产生高滴度的抗体；
（3）佐剂可以直接或间接激活免疫活性细胞并使之增生，从而增强了体液免疫、细胞免疫和非特异性免疫功能；
（4）良好的佐剂应具有无毒性或副作用低的特点。
抗原的选择要求
免疫原性好
表面暴露：易于接触机体免疫系统
特异性好：减少交叉反应
容易获得
功能重要
抗原的改造和优化
常用方法
截短表达：去除信号肽和跨膜区，免疫优势区域或优势表位；
融合表达：两个或多个蛋白融合表达，抗原与佐剂融合；
突变构建：去除抗原的生物学活性但保留免疫原性。
可用于人体的佐剂：
铝佐剂（Al(OH)3，AlPO4）
MF59：一种水包油的乳剂，包含1%鲨烯，0.5%Tween80 和0.5%三油酸聚山梨脂的水包油乳液。被用
于诺华公司的流感疫苗复立达中。
AS04：用于HPV疫苗
免疫程序内容
初次免疫起始月（年）龄
接种间隔
接种剂量
加强免疫
接种途径
联合免疫和几种疫苗同时接种
接种次数
七，抗体工程
抗体工程制药（antibody engineering pharmaceutics）以抗体的分子结构为基础，抗体的免疫效应功能为核心，利用基因工程、细胞工程和转基因技术生产抗体类生物诊断制剂和治疗药物。
多克隆抗体（polyclonal antibody, PcAb）大多数抗原分子具有多个表位，每一种表位均可刺激机体一个B细胞克隆产生一种特异性抗体。传统制备抗体的方法是用包含多种表位的抗原物质免疫动物，从而刺激多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。因此，所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物，称为多克隆抗体(polyclonal antibody，PcAb)。
单克隆抗体（McAb）由一个仅识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源抗体，称为单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb)。
杂交瘤技术的基本原理：通过融合两种细胞后同时保持两者的主要特性。
单克隆抗体的制备技术
（一）单克隆抗体的产生
（二）单克隆抗体的纯化
（三）单克隆抗体的性质鉴定
基因工程抗体的主要类型：
⏹ 人源化抗体 ⏹ 双特异性抗体
⏹ 小分子抗体 ⏹ 抗体库技术
⏹ 抗体融合蛋白
小分子抗体:具有结合抗原功能的分子片段称为小分子抗体。
优点：
1）可在原核细胞表达，生产成本低; 3）不含Fc 段，副作用小；
2）易于穿透血管或组织到靶细胞部位； 4）半衰期短，有利于毒素中和及清除。 小分子抗体包括：
① 抗原结合片段（fragment of antibody binding,Fab）：由一条完整的 L 链和约为1/2的 H 链组成，是完整抗
体 的 1/3，只有一个Ag 结合位点，它是将 McAb 重链V区和 CH1 区cDNA 与完整轻链 cDNA 连接，
在细胞启动子的控 制下分泌表达。
② 可变区片段（fragment of variabie region,Fv）：是由L链和H链的V区组成的单价小分子，是与抗原结合的
最小功能片段。
③ 单链抗体（single chain Fv,ScFv）用适当的寡核苷酸街头将L链和H链的V区（ VH 和 VL）连接起来，
使之形成单一的多肽链，称为单链抗体（ScFv） 。为单一抗原结合位点。
ScFv的优点是：分子量小，免疫原性弱、渗透力强，并可用于药物导向、中和毒素等功能。
缺点是：无抗体C区，不能介导抗体的其它生物学效应。
噬菌体展示技术（phage display）将蛋白分子或肽段的基因克隆到丝状噬菌体的基因组DNA中，与噬菌体的外壳蛋白形成融合蛋白，从而使该异源分子呈现于噬菌体表面。
噬菌体展示在抗体库技术中的应用
在基因III 蛋白和基因VIII蛋白末端插入外源蛋白，表达的融合蛋白可呈现在噬菌体表面，不影响噬菌体的
功能，因而gp3和gp8被应用于噬菌体展示（phage display）。
基因VIII蛋白在噬菌体颗粒外壳上有2700个拷贝，N-端1~5个氨基酸暴露于噬菌体表面，可插入外源蛋白，
但外源肽段多于十肽时会影响gp8的功能。
基因III蛋白在噬菌体颗粒外壳上有3-5个拷贝，将外源基因紧靠基因III上游，在噬菌体表面表达融合蛋白，
不影响噬菌体的功能。
八，酶工程
酶工程(Enzyme engineering)由酶学与化学工程技术、基因工程技术、微生物学技术相结合而产生的一门新的技术科学。是从应用的目的出发，研究和利用酶的特异性催化功能，通过适当工艺将相应的原料转化为有用物质。 固定化酶（细胞）Immobilized Enzyme (Cell) :是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶（细胞），能连续地进行反应，反应后的酶（细胞）可以回收重复使用。固定化细胞，能继续增殖、休眠和死亡，但其酶活性保持不变。 固定化酶（细胞）的制备传统方法
2.交联法
利用双功能或多功能交联试剂，在酶分子和交联试剂之间形成共价键的酶的固定化法。
区别：不使用载体。
3.包埋法
将载体与酶溶液混合后，借助引发剂进行聚合反应，通过物理作用将酶限定在载体的网格中，实现酶固化的方法。
固定化细胞的方法
化学交联法，絮凝法载体粘合法、凝胶体截留法和金属螯合法等多种。
固定化酶（细胞）的性质和指标
（一）固定化后酶活力的改变
①空间构象变化，影响活性中心的氨基酸；
②空间位阻，影响对底物的定位作用；
③内扩散阻力使底物分子接近受阻；
④包埋时受半透膜包围，大分子底物不能透膜与酶接近
（二）固定化对酶稳定性的影响
①热稳定性提高
②对有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高
③对pH、蛋白酶、贮存和操作条件的稳定性提高
（三）固定化酶的最适温度变化
热稳定性提高，最适温度也随之提高。
（四）固定化酶的最适pH变化
对底物作用的最适pH和酶活力-pH曲线偏移
（五）固定化酶的米氏常数（Km）变化
Km：酶动力学参数，由酶和底物相互关系决定。
Km值↑，酶和底物亲和力↓。
Km变化又受溶液中离子强度影响。
（六）固定化酶（细胞）的指标
固化后，其催化功能由均相体系反应变为固-液相不均一反应，酶的催化性质发生改变。
1. 酶（细胞）的活力：是指固定化酶（细胞）催化某一特定化学反应的能力，其大小可用在一定条件下它所催化的某一反应的反应初速度来表示。umol / min•mg（每毫克干重固化酶每分钟转化底物或生产产物的量）
2. 偶联率及相对活力的测定
偶联率=(加入酶蛋白活力-上清液酶蛋白活力)／加入酶蛋白活力×100%
偶联率＝1，固定化或扩散限制引起的酶失活不明显；
偶联率＜1，扩散限制对酶活力有影响；
偶联率＞1，有细胞分裂或从载体排除抑制剂等原因。
3. 固定化酶（细胞）的半衰期：是指在连续测定条件下，固定化酶（细胞）的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间，以t1／2表示。半衰期是衡量稳定性的指标
4. 固定化酶的热稳定性
将固定化酶在不同温度下温育1小时之后，在最适温度下测酶活力。固定化酶的活力一般应保持在60%以上。 九，新型生计
研究热点：
蛋白质和蛋白质复合物的结构功能
蛋白质在细胞内的动态变化
特定蛋白质在活体内的功能
全蛋白谱研究
蛋白质相互作用的图谱
基于蛋白质的药物设计
反义核酸：反义核酸是一些人工合成的单链反义分子，可以通过碱基互补原则与细胞内部的某个靶标mRNA或DNA结合，抑制或封闭该基因的转录和表达，或切割mRNA使其丧失功能。
RNA干扰：RNAi（RNA interference）是指在生物体细胞内，dsRNA引起同源mRNA的特异性降解，因而抑制相应基因表达的过程。
基因治疗Gene therapy：
经典概念：将具有正常功能的基因置换或增补患者体内的缺陷基因，从而达到治疗疾病的目的。
广义概念之为基因治疗。
生物技术制药
一， 绪论
生物技术制药（Biotechnological Pharmaceutics）是指运用生物技术，借助微生物，植物或动物细胞进行药品研发与生产的一门应用性科学。其主要产品是以蛋白质、多肽、基因片段为结构基础的疫苗、抗体、细胞因子等治疗预防诊断用途的药品。
结构基础
药理基础
制备方法
药物用途
举例 生物药品 多肽、蛋白质、核苷酸 免疫调节 生物工程与免疫学技术 预防、治疗、诊断 化药 中药 无机或有机化合物分子 单体分子或动植物混合物 生化生理代谢调节 化学合成 治疗 类似化药 物理或生物生化技术提取 治疗 板蓝根、六味地黄丸 乙肝疫苗、胰岛素、免疫试剂盒 抗生素
二， 基因工程制药
基因工程制药（genetic engineering pharmaceutics ）利用基因重组技术将外源基因导入宿主菌或细胞进行大规模培养，以获得核酸或蛋白质药物的过程称为基因工程制药 。
基本环节：上游【基因工程菌的构建与筛选（分子克隆）】——获得目的基因，构建重组质粒，构建筛选基因工
程菌/细胞
下游——培养工程菌/细胞，产物分离纯化，半成品制备与检定，成品制备与检定
分子克隆常用工具：
1、工具酶
限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease, RE) “手术刀”
DNA连接酶 “缝合线” 反转录酶 （RNA-DNA）
DNA聚合酶 （PCR：Taq） 核酸修饰酶 （核酸酶、磷酸化酶等）
2、载体
携带外源基因进入受体细胞在其中进行扩增或诱导表达
载体分类
1.克隆载体: 具组装、复制、扩增功能。如：pBR322、pUC18/19等。
2.表达载体: 不仅具组装、复制、扩增功能，还有转录表达功能。如：pBV220、
pKK223-3
突变载体、报告载体
载体的共同特征
① 携带外源性目的基因前后均能自主复制
② 易于扩增、分离纯化
③ 有单一酶切位点（多克隆位点，MCS）
单一酶切位点：一种酶在一个载体上只有一个酶切位点
多克隆位点：一个载体上的某一个区域含有多个单一酶切位点
④ 有选择标记基因
⑤ 表达载体还应有表达调控元件（启动子、增强子、终止子、SD序列等）
质粒（plasmid）：存在与细菌胞内的一类独立于染色体而可以自我复制的遗传物质。
3、外源基因表达的宿主细胞
原核： 大肠杆菌；枯草芽孢杆菌
真核： 酵母；哺乳动物细胞（CHO、COS、3T3）
大肠杆菌表达系统
枯草芽孢杆菌表达系统
酵母表达系统
动物细胞表达系统
外源（目的）基因的制备
1．直接从染色体DNA或质粒中分离：仅适用于原核生物基因的分离。
2．人工合成：适应于编码小分子多肽的基因。长片段的合成（重叠延伸PCR）。
3．从mRNA合成cDNA：通常可得到可表达的完整基因。
4．从基因文库中筛选：具有组织细胞特异性
5．利用PCR合成:已知目的基因两端的序列
PCR（Polymerase Chain Reaction）:即聚合酶链式反应,是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，按照碱基互补配对的原则体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。
修饰与改造的主要手段
1. 构建突变体：
点突变技术
✓ 寡核苷酸介导的基因突变
✓ 盒式突变或片段取代突变
✓ PCR介导的突变
2. 融合蛋白：
提高目的蛋白的表达
提高蛋白质的稳定性
调节目的蛋白的功能、活性（如佐剂，靶向蛋白等）
改变目的蛋白的构象
3. 化学结构修饰：
✓ PEG ✓ 高分子多聚物
✓ 糖及糖的衍生物 ✓ 生物大分子
三，蛋白质工程
蛋白质分离纯化的一般过程
1.前处理 (pretreatment) 把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不丢失生物活性。
2.粗分级分离 (rough fractionation) ：当蛋白质提取液(有时还杂有核酸、多糖之类)获得后，选用一套适当方法，将目的蛋白与大多数杂蛋白分离开来。
3.细分级分离 (fine fractionation) 即精细纯化，是根据蛋白分子的理化性质和生物学特性选用不同纯化方法。 分离纯化的技术要求：
①条件温和，保持产物生物活性。 ④两个技术间能直接衔接，无需样品处理。 ②选择性好，分辨率高。 ⑤纯化过程要快，满足高生产率的要求。
③收率要高。
盐析法
盐溶（Salting in）:蛋白质在纯水或低盐溶液中溶解度较低，若稍加一些无机盐则溶解度增加，这种现象称为“盐溶” 。
盐析（salting-out): 当盐浓度继续增加到某一浓度时，蛋白质又变得不溶而自动析出，这种现象称为“盐析”。 盐析原理
蛋白质在溶液中稳定存在的原因：
✓ 表面电荷 ✓ 水化膜
当盐浓度增加到一定浓度时，大量水同盐分子结合，破坏了蛋白质水化膜，容易沉淀出来 ；同时盐离子中和蛋白质分子，相互碰撞时发生聚集而沉淀出来，即出现“盐析”现象。常用无机盐：氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸
铵等。
层析法 (chromatography)层析技术也称色谱技术，是利用混和物中各组分理化性质（吸附力、分子形状、大小、分子极性、分子亲和力以及分配系数）的差异，在物质经过两相中进行分离的一种技术。按固定相基质的形式：柱层析、纸层析和薄层层析。
离子交换层析ion exchange chromatography
原理：
利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。电荷不同的蛋白质，对管柱上的离子交换剂有不同的亲和力，改变冲洗液的离子强度和pH值，物质就能依次从层析柱中分离出来。
凝胶过滤(gel filtration) 亦称凝胶色谱、排阻色谱或分子筛，是利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相，对混合中各组份按分子大小进行分离的层析技术。
应用
● 分离蛋白质 ● 蛋白质分子量的测定
● 脱盐 ● 蛋白质寡聚状态分析
亲和层析(affinity chromatography）是利用待分离物质与其特异性配体之间特异性的亲和力进行分离的一类特殊的层析技术。
原理：
四，动物细胞工程
动物细胞的培养特性：
无细胞壁，适应环境能力差 多贴壁生长，有接触抑制现象
倍增时间长，生长缓慢, >15h 产物分泌在细胞外，便于收集和纯化
对培养基要求高，易受微生物污染 对目的蛋白质进行翻译后修饰
培养基本技术：
1. 细胞原代培养
2. 细胞传代培养：将细胞从一个培养皿中消化、分散并接种至另一个培养皿。
3. 细胞克隆培养：即单细胞分离培养，将动物组织分散后，将一个细胞从群体细胞分离出，由单个细胞培养成
纯系细胞集群。常用于生产单克隆抗体的杂交瘤细胞株的筛选。
4. 动物细胞的冻存与复苏
动物细胞大规模培养
1、悬浮培养法：
细胞在反应器中自由悬浮生长，在微生物发酵的基础上发展起来的。用于重组蛋白和单抗生产。
转瓶、滚瓶、发酵罐。常用的生物反应器为搅拌式和气升式
2.微载体培养法
⏹ 用于贴壁细胞的大规模培养，其原理是将对细胞无害的微载体颗粒（60-250 um)加入培养容器的培养液中，
作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。
⏹ 使贴壁细胞的培养兼有悬浮培养和固定化培养的优点
3. 多孔载体培养法
多孔载体（如玻璃、陶瓷、明胶等）内部有很多网状小孔，细胞可以在里面生长，免受搅拌造成的机械损伤。即可以用于悬浮细胞的固定化连续培养，又可以用于细胞的贴壁培养。
4. 微囊化培养法
在无菌条件下将拟培养的细胞、生物活性物质及生长介质共同包裹在薄的半透膜中形成微囊, 再将微囊放入培养系统内进行培养。生长介质为1. 4 %海藻酸钠溶液, 半透膜由多聚赖氨酸形成。
5. 中空纤维培养法
模拟细胞在体内的三维状态，把细胞接种在中空纤维的外腔，利用中空纤维模拟毛细血管提供营养，使细胞高密度的生长。
转基因动物(transgenic animal)：
借助基因工程技术把外源目的基因导入生殖细胞、胚胎干细胞和早期胚胎，并在受体染色体上稳定整合，使之经过各种发育途径得到能把外源目的基因传给子代的个体。
应用：
⏹ 1. 基础研究，如发育生物学、遗传学等。
⏹ 2. 疾病模型，如肿瘤、心血管疾病等。
⏹ 3. 改良培育，如：生产出生长快、产肉、产毛、产奶更多而耗料极少的转基因家畜。
⏹ 4. 生物制药：tPA（组织型纤溶酶原激活剂）在转基因小鼠的乳汁中得到了表达，转基因山羊乳汁中表达抗凝血酶III
五，发酵工程
发酵工程（Fermentation Engineering）：利用微生物生长代谢活动产生的各种生理活性物质来生产商业产品。
发酵工程制药Fermentation Engineering Pharmaceutics：结合相关交叉学科的基本原理，利用微生物的某些特定性状，运用现代生物工程技术，在生物反应器中生产医药生物制品的一种技术体系。
过程
✧ 上游工程包括优良菌种的选育、最适发酵条件（培养基的组成、pH、温度和溶氧等）的优化等。
✧ 发酵生产是指在最适条件下，在发酵罐中生产细胞和代谢产物的工艺技术，本阶段是整个发酵工程的中心
环节，要有严格的无菌生长环境。
✧ 下游工程是指发酵液中产品的分离纯化与鉴定，副产物的回收，废物处理等。
发酵方式
分批发酵(batch fermentation)：是将发酵培养基组分一次性投入发酵罐，经灭菌、接种和发酵后，再一次性的将发酵液放出的一种间歇式发酵操作类型，又称间歇式发酵。分批发酵是一种准封闭系统，在发酵过程中除了控制温度，不断进行通气（好氧发酵）和加入酸碱溶液调节pH外，与外界没有其他物料交换。
补料-分批发酵(fed-batch fermentation)：是在分批发酵过程中间歇或连续的以某种方式补入新鲜料液，克服由于养分不足而导致发酵过早结束的问题。通过向培养系统中补充物料，可以使培养液中的底物浓度较长时间的保持在一定范围内，既保证菌体细胞的生长需要，又不造成阻遏抑制等不良影响，从而达到提高产物浓度和得率的目的。 半连续发酵(semi-continuous fermentation)：在补料分批培养基基础上，加上间歇放掉部分发酵液进入下游提取工段的发酵操作方式。补料分批发酵虽然可以通过补料补充养分或前体的不足，但由于有害代谢产物的积累，产物合成还是会受到阻遏。半连续培养不仅可以补充养分和前体，而且有害代谢物质被稀释，有利于产物的继续合成。 连续发酵(continuous fermentation)是当发酵过程进行到一定阶段时（如产物合成时期）一边连续补充发酵培养液，一边又以相同的流速放出发酵液，维持发酵液原来的体积的发酵方式，微生物在稳定状态下生长和代谢。连续发酵使微生物的生长和代谢活动保持旺盛的稳定状态，从而使产率和产品质量也相应保持稳定.
发酵过程的影响因素及控制
（一）菌体浓度的影响及控制：
菌体浓度(cell concentration)：是指单位体积培养液中菌体的含量。菌体浓度的大小，在一定条件下，不仅反映菌体细胞的多少，而且反映菌体细胞生理特性的不同阶段，因此在实验室研究和工业发酵上，它都是一个重要的参数。
（二）营养物质对发酵的影响及控制：
各种营养物质对微生物生长繁殖和代谢产物的合成都很重要，但在为微生物提供营养物质时，必须重视各种营养物质的浓度和配比，以达到维持正常的渗透压、节约原材料及提高代谢产物产量的目的。
（三）温度的影响及控制：
最适生长温度为37℃。大多数表达系统采用低于37℃ 的培养温度，因为低温使营养物的摄入和生长速率降低，乙酸盐及其他抑制性副产物的形成也随之减少。
（四）pH的影响和控制：
pH 梯度法，即生长期控制较高的pH 为7.O～7.3，加速菌体生长，生产期降低pH 至6.7～ 7.0，以减少异体蛋白的干扰，从而提高包涵体中目的蛋白的产量。
（五）溶氧的影响和控制：
溶氧是需氧微生物生长所必需的。在发酵过程中有多方面的限制因素，而溶氧往往最易成为限制因素。 溶解氧浓度的变化受供氧能力的变化、菌龄的不同、加料及补水措施、改变通风量等多因素影响。
控制好溶解氧浓度，需从供、需两方面考虑。在实际生产过程中，主要通过调节搅拌转速、通气速率及补料
速率来控制供氧。
（六）泡沫的影响及控制：
过多的泡沫会给发酵带来负面影响：
①降低生产能力；
②大量气泡引起“逃液”，造成原料和产物的损失；
③影响菌体呼吸；
④泡沫使部分菌体黏附在罐顶或罐壁上，使发酵液中菌体量减少；
⑤泡沫升至罐顶，顶至轴封或逃液，增加染菌机会；
⑥消泡剂的加入会给提取工艺带来困难。
六，疫苗
疫苗（vaccine）：主要是指将病原微生物及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的免疫制剂，例如流感疫苗、乙肝疫苗等。
1796年，Jenner进行了第一个预防天花人体实验,诞生了世界上第一个疫苗。
四次疫苗革命 十九世纪末，以疫苗之父巴斯德为代表，先后研制成减毒炭疽、霍乱及狂犬病疫苗，形成了第一次疫苗革命。 1962年，基因重组疫苗开始出现，并于1986
1992年，Tang2000 核酸疫苗又称基因疫苗，DNA疫苗，是指将含有编码某种抗原蛋白基因序列的质粒载体作为疫苗，直接导动物细胞内，从而通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，达到免疫的目的。 治疗性疫苗(Therapeutic vaccine)是指在已感染病原微生物或已患有某些疾病的机体中，通过诱导特异性的免疫应答，达到治疗或防止疾病恶化的天然、人工合成或用基因重组技术表达的产品或制品
反向疫苗学（reverse vaccinology ）是从全基因水平来筛选具有保护性免疫反应的候选抗原的疫苗发展策略。它以微生物基因组为平台，对毒力因子、外膜抗原、侵袭及毒力相关抗原等蛋白基因进行高通量克隆、表达，纯化出重组蛋白。然后，再对纯化后的抗原进行体内、体外评价，筛选出保护性抗原，进行疫苗研究。
疫苗的组成
抗原
稳定剂
佐剂
灭活剂
防腐剂
缓冲液、盐类等非活性成分
佐剂Adjuvant ：是指那些与抗原一起或先于抗原注入机体后可增强机体对该抗原的免疫应答能力或改变免疫应答类型的辅助物质。佐剂可以具备免疫原性，也可无免疫原性。
作用：
（1）增加抗原的表面积，从而增强抗原的免疫原性；
（2）佐剂与抗原混合能延长抗原在局部组织的存留时间，减低抗原的分解速度，使抗原缓慢释放至淋巴系统中，持续刺激机体产生高滴度的抗体；
（3）佐剂可以直接或间接激活免疫活性细胞并使之增生，从而增强了体液免疫、细胞免疫和非特异性免疫功能；
（4）良好的佐剂应具有无毒性或副作用低的特点。
抗原的选择要求
免疫原性好
表面暴露：易于接触机体免疫系统
特异性好：减少交叉反应
容易获得
功能重要
抗原的改造和优化
常用方法
截短表达：去除信号肽和跨膜区，免疫优势区域或优势表位；
融合表达：两个或多个蛋白融合表达，抗原与佐剂融合；
突变构建：去除抗原的生物学活性但保留免疫原性。
可用于人体的佐剂：
铝佐剂（Al(OH)3，AlPO4）
MF59：一种水包油的乳剂，包含1%鲨烯，0.5%Tween80 和0.5%三油酸聚山梨脂的水包油乳液。被用
于诺华公司的流感疫苗复立达中。
AS04：用于HPV疫苗
免疫程序内容
初次免疫起始月（年）龄
接种间隔
接种剂量
加强免疫
接种途径
联合免疫和几种疫苗同时接种
接种次数
七，抗体工程
抗体工程制药（antibody engineering pharmaceutics）以抗体的分子结构为基础，抗体的免疫效应功能为核心，利用基因工程、细胞工程和转基因技术生产抗体类生物诊断制剂和治疗药物。
多克隆抗体（polyclonal antibody, PcAb）大多数抗原分子具有多个表位，每一种表位均可刺激机体一个B细胞克隆产生一种特异性抗体。传统制备抗体的方法是用包含多种表位的抗原物质免疫动物，从而刺激多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。因此，所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物，称为多克隆抗体(polyclonal antibody，PcAb)。
单克隆抗体（McAb）由一个仅识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源抗体，称为单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb)。
杂交瘤技术的基本原理：通过融合两种细胞后同时保持两者的主要特性。
单克隆抗体的制备技术
（一）单克隆抗体的产生
（二）单克隆抗体的纯化
（三）单克隆抗体的性质鉴定
基因工程抗体的主要类型：
⏹ 人源化抗体 ⏹ 双特异性抗体
⏹ 小分子抗体 ⏹ 抗体库技术
⏹ 抗体融合蛋白
小分子抗体:具有结合抗原功能的分子片段称为小分子抗体。
优点：
1）可在原核细胞表达，生产成本低; 3）不含Fc 段，副作用小；
2）易于穿透血管或组织到靶细胞部位； 4）半衰期短，有利于毒素中和及清除。 小分子抗体包括：
① 抗原结合片段（fragment of antibody binding,Fab）：由一条完整的 L 链和约为1/2的 H 链组成，是完整抗
体 的 1/3，只有一个Ag 结合位点，它是将 McAb 重链V区和 CH1 区cDNA 与完整轻链 cDNA 连接，
在细胞启动子的控 制下分泌表达。
② 可变区片段（fragment of variabie region,Fv）：是由L链和H链的V区组成的单价小分子，是与抗原结合的
最小功能片段。
③ 单链抗体（single chain Fv,ScFv）用适当的寡核苷酸街头将L链和H链的V区（ VH 和 VL）连接起来，
使之形成单一的多肽链，称为单链抗体（ScFv） 。为单一抗原结合位点。
ScFv的优点是：分子量小，免疫原性弱、渗透力强，并可用于药物导向、中和毒素等功能。
缺点是：无抗体C区，不能介导抗体的其它生物学效应。
噬菌体展示技术（phage display）将蛋白分子或肽段的基因克隆到丝状噬菌体的基因组DNA中，与噬菌体的外壳蛋白形成融合蛋白，从而使该异源分子呈现于噬菌体表面。
噬菌体展示在抗体库技术中的应用
在基因III 蛋白和基因VIII蛋白末端插入外源蛋白，表达的融合蛋白可呈现在噬菌体表面，不影响噬菌体的
功能，因而gp3和gp8被应用于噬菌体展示（phage display）。
基因VIII蛋白在噬菌体颗粒外壳上有2700个拷贝，N-端1~5个氨基酸暴露于噬菌体表面，可插入外源蛋白，
但外源肽段多于十肽时会影响gp8的功能。
基因III蛋白在噬菌体颗粒外壳上有3-5个拷贝，将外源基因紧靠基因III上游，在噬菌体表面表达融合蛋白，
不影响噬菌体的功能。
八，酶工程
酶工程(Enzyme engineering)由酶学与化学工程技术、基因工程技术、微生物学技术相结合而产生的一门新的技术科学。是从应用的目的出发，研究和利用酶的特异性催化功能，通过适当工艺将相应的原料转化为有用物质。 固定化酶（细胞）Immobilized Enzyme (Cell) :是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶（细胞），能连续地进行反应，反应后的酶（细胞）可以回收重复使用。固定化细胞，能继续增殖、休眠和死亡，但其酶活性保持不变。 固定化酶（细胞）的制备传统方法
2.交联法
利用双功能或多功能交联试剂，在酶分子和交联试剂之间形成共价键的酶的固定化法。
区别：不使用载体。
3.包埋法
将载体与酶溶液混合后，借助引发剂进行聚合反应，通过物理作用将酶限定在载体的网格中，实现酶固化的方法。
固定化细胞的方法
化学交联法，絮凝法载体粘合法、凝胶体截留法和金属螯合法等多种。
固定化酶（细胞）的性质和指标
（一）固定化后酶活力的改变
①空间构象变化，影响活性中心的氨基酸；
②空间位阻，影响对底物的定位作用；
③内扩散阻力使底物分子接近受阻；
④包埋时受半透膜包围，大分子底物不能透膜与酶接近
（二）固定化对酶稳定性的影响
①热稳定性提高
②对有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高
③对pH、蛋白酶、贮存和操作条件的稳定性提高
（三）固定化酶的最适温度变化
热稳定性提高，最适温度也随之提高。
（四）固定化酶的最适pH变化
对底物作用的最适pH和酶活力-pH曲线偏移
（五）固定化酶的米氏常数（Km）变化
Km：酶动力学参数，由酶和底物相互关系决定。
Km值↑，酶和底物亲和力↓。
Km变化又受溶液中离子强度影响。
（六）固定化酶（细胞）的指标
固化后，其催化功能由均相体系反应变为固-液相不均一反应，酶的催化性质发生改变。
1. 酶（细胞）的活力：是指固定化酶（细胞）催化某一特定化学反应的能力，其大小可用在一定条件下它所催化的某一反应的反应初速度来表示。umol / min•mg（每毫克干重固化酶每分钟转化底物或生产产物的量）
2. 偶联率及相对活力的测定
偶联率=(加入酶蛋白活力-上清液酶蛋白活力)／加入酶蛋白活力×100%
偶联率＝1，固定化或扩散限制引起的酶失活不明显；
偶联率＜1，扩散限制对酶活力有影响；
偶联率＞1，有细胞分裂或从载体排除抑制剂等原因。
3. 固定化酶（细胞）的半衰期：是指在连续测定条件下，固定化酶（细胞）的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间，以t1／2表示。半衰期是衡量稳定性的指标
4. 固定化酶的热稳定性
将固定化酶在不同温度下温育1小时之后，在最适温度下测酶活力。固定化酶的活力一般应保持在60%以上。 九，新型生计
研究热点：
蛋白质和蛋白质复合物的结构功能
蛋白质在细胞内的动态变化
特定蛋白质在活体内的功能
全蛋白谱研究
蛋白质相互作用的图谱
基于蛋白质的药物设计
反义核酸：反义核酸是一些人工合成的单链反义分子，可以通过碱基互补原则与细胞内部的某个靶标mRNA或DNA结合，抑制或封闭该基因的转录和表达，或切割mRNA使其丧失功能。
RNA干扰：RNAi（RNA interference）是指在生物体细胞内，dsRNA引起同源mRNA的特异性降解，因而抑制相应基因表达的过程。
基因治疗Gene therapy：
经典概念：将具有正常功能的基因置换或增补患者体内的缺陷基因，从而达到治疗疾病的目的。
广义概念之为基因治疗。