中国职业医学 2009年12月第36卷第6期 Ch i n O ccup M ed, Dece mber, 2009, Vol . 36, No . 6
文章编号:1000-6486(2009) 06-0507-03
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【综 述】
半数致死量及其计算方法概述
Summary of median lethal dose and its calculati on methods
顾兵, 张政, 李玉萍, 余日跃, 王心如
1
2
1
2
12123
3
G U B ing , ZHANG Zheng , L I Yu 2p ing , Y U R i 2yue , WANG Xin 2ru
关键词:半数致死量; 毒性参数; 计算方法 中图分类号:R965. 3 文献标识码:A
在毒理学、药理学、微生物学等领域和新药筛选中, 往往需要研究某个因素对生物体的作用, 通过1个量化指标直观地表述其药效、毒性或效价[1]。1927年TRE VAN 首先采用半数致死量(Median lethal dose, LD 50) 作为检定分析的方法, 该量度方法有助于减少所需实验次数, 减少量度极端情况所带来的问题。
1 LD 50的概念
的公式:LD 50=lg -1[X n -i (-0. 75) ];SE 50=
2n n
; 95%的平均可信限:LD 50±4. 5×LD 50×SE 50;
n -1
2
根据医学主题词表的定义, LD 50之有害物质、量之比来表示, 如mg/kg。
2 LD 50的计算方法
目前计算LD 50的方法很多, 有的计算简便, 但结果粗略; 有的结果较准确, 但计算复杂。国外多采用L I T CHF I E LD 和W I L 2C OXON 的坐标纸图解法。在我国普遍采用的方法可以归纳为2类:一类是死亡率-剂量反应相关, 要求为正态分布, 其中概率单位图解法和改良寇氏法较为常用; 另一类是不要求为正态分布, 计算时只查对有关表格即可得到LD 50值, 如霍恩氏法等。现就常用的计算方法及其优缺点作一概述。2. 1 寇氏法
寇氏法(Karber 氏法) 是在1931年由K ARBER 提出, 由于它计算复杂, 当时并没有得到广泛推广。1963年孙瑞元设计了合理的实验, 改进并发展了寇氏法, 使其计算简化, 即为LD 50的综合计算方法, 后称之为改良寇氏法。主要计算公式为:
l og LD 50=X m -i (∑p -0. 5) ; SE 50=i l og LD K =l og LD 50-5-Y K
b
; SE K =
Y -Y 2
; b =;
n -1i (N -H )
式中:X n 为最高反应组剂量的对数; i 为相邻2组对数剂量之差
值(即组距; m ; ∑m 为各组动物反应数的; ∑m 2; n 为每组动物数; h 为, 由于寇氏法及其改, 不需要因为数据不精确而, 省去了其他更复杂的统计计算。其计算结果精确, 能求出标准误, 只是应用时必须满足3个条件:①反应量大致呈正态分布; ②剂量必须按等比级数分布; ③各组动物数相等。虽然有条件限制, 但还是有很多研究者为能运用该法计算而合理地设计实验。因此, 寇氏法仍是最常用的LD 50计算方法之一。钟以禧[3]用该法计算大鼠灌胃马拉硫磷的毒性, 同时进行了区间估计, 实验结果和其他方法很接近。2. 2 累计法
累计法又称Reed 2Muench 法, 是用呈等比级数排列的剂量进行实验, 要求每组动物数相等。它是先将实验死亡动物数和存活动物数进行累计加和, 再用加和的数据计算死亡率。在死亡率中有2个数据A 和B , 且A 刚好大于50%, B 刚好小于50%。由于累计死亡率的直线性较不累计时的好, 在这里用上述2个数据可以得出1条直线, 且将该直线近似为死亡率与剂量关系的直线, 即50%死亡率的点在该直线上。根据数学计算可以得出比例系数r , 即r =(A -50%) /(A -B ) , r 与等比数列公比的乘积, 就是50%死亡率时的剂量与死亡率为A 时的剂量的差, 所以可以求得50%死亡率时的剂量, 即LD 50。累计法计算方便, 更多地运用在微生物学中, 尤其在稀释分析中[4]; 但此法最大的缺点是不考虑操作误差, 有个“近似”, 使得计算结果不够精确, 只可以作为实验过程中LD 50的粗略判断。2. 3 加权法
[5]
加权法又称B liss 法, 创建于1938年, 后为F I N NEY 所发展的加权机率单位法。大体计算过程为:①在坐标纸上, 根据对数剂量与经验概率单位(ye m ) 构成点, 并绘制出1条直线, 并由直线找出各对数剂量相当的概率单位称期望概率单位(Y ) ; ②计算出作业概率单位(y ) , 对Y 进行校正, y =(Y -P /Z ) +P /Z 或者y =(Y +Q /Z ) -Q /Z; ③将各点加权(n w ) , 用X 2作直线性检验。如果各点不显著偏离直线, 即可计算回归直线方程, 如果由直线方程得到的期望概率单位(Y 1) 与前次的不够接近, 则
SE 50) 2nH (N -H )
5-Y K b i
2
) 2。
在简洁度上优于累计法、寇氏法等方法, 在精确度上亦较寇氏法有所进步, 计算结果与B liss 机率单位法很接近。1974年杨世洪[2]将其运算过程进一步简化, 缩减了计算量, 推导出了新 基金项目:国家科学技术委员会“九五”科技攻关项目(9629062042
11) ; 江西省卫生厅科技计划项目(20072036)
作者单位:1. 江西科技师范学院药学院, 江西南昌330013; 2. 江西中医学院药学院, 330006; 3. 南京医科大学公共卫生学院, 210029 作者简介:顾兵(1971—) , 男, 博士后, 副教授、硕士生导师, 主要从事药理学、食品毒理学教学和神经精神药物学研究
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的新旧方法进行对比研究, 结果其毒性分级一致率为87. 2%。
可以用其代替一直沿用的LD 50法, 而且可为危险度评价提供较为足够的资料, 包括中毒作用性质、中毒发生时间、持续时间和
[13]
实验结果等。F DP 法设固定剂量以观察动物的实验反应, 不以死亡为依据, 而是按毒性症状来判断受试物质的毒性。一个实验只需10～20只动物, 首先采用1只动物(多为雌性) 顺次间隔一定时间进行5、50、500、2000mg/kg固定剂量的毒性测试, 采用流程图和结果判别表格, 操作过程大大简化。应用本法分级结果与我国毒性分级基本相似。OEC D 提出, 如果500mg/kg处理时, 无毒性反应时则做1次2000mg/kg的限度试验, 仍无毒性反应且动物全部存活时即可终止实验[14]。
2. 7 logistic 模型法
对Y 1再次校正; ④将各X 值代入直线方程Y 2=y +b (X -x ) 。反应率等于0. 5时, Y 2=5代入方程:Y 2=y +b (X -x ) 得到的值即LD 50的对数值(m ) 。B liss 法是目前最为精确、可靠的LD 50测定方法。由于其在数理上严谨精密, 甚至称其为机率单位正规法[6]。在早期, 因为其计算过程太烦琐, 很难推广。随着计算机的普及, 研究者更多运用基于B liss 法的计算程序计算LD 50。1988年我国学者应用Basic 语言开始在App le 机上计算LD 50。2. 4 霍恩氏法
霍恩氏法又称目测图解法, 与回归直线法的统计思想一样, 各种能转换成在几何上呈规则图形的数据都能运用。计算LD 50时, 一般是将剂量变换成对数剂量X 作为横坐标, 将死亡率(%) 转换成概率单位Y 作为纵坐标, 使得死亡率与对数剂量呈线性关系[7]。霍恩氏法根据实验数据直接在坐标纸上描点画出直线。直线上相当于概率单位为5(反应率为50%) 的剂量即为LD 50; 95%平均可信限:LD 50±1. 4×(LD 84-LD 16) /, 其中m 为5%～95%死亡率所用动物数。直线回归法较目测图解法精确, 但相应的计算量较大。先求出各组数据的平均值x 、
2
y , 再计算(X -x ) (Y -y ) 和(X -x ) 及∑(X -x ) (Y -y ) 和
2
∑(X -x ) 求得回归系数b, 将x 和b 代入直线回归方程Y =y +
[8]
b (X -x ) , 就能得到回归直线方程。这2种方法的特点是简单易行, 节省动物, 不足的是所得LD 50, 精确。, 得结果极为相近[9]效的。-LD 50, 不必查对数表和反应率-, 从而使计算更为简便。2. 5 序贯法
序贯法其名称源出于WALD 在1948年发表的一本同名著作, 它的研究对象是序贯抽样方案, 以及如何用这种抽样方案得到的样本去作统计推断。应用在LD 50的计算时, 序贯法也称上下法(Up 2and 2down p r ocedure, UDP ) , 最早由D I XON 和MOOD 提出。BRUCE [10]于1985年在Funda m App l T oxicol 上对UDP 进行了改进, 用于获取大概的LD 50。经济合作与发展组织(OECD ) 经过多次修订, 于2001年正式采纳UDP 法以评价受试物的急性经口毒性[11]。此外, UDP 还被美国食品药品管理局(F DA ) 和美国环保署(EP A ) 接受作为标准试验方法。我国国家食品药品监督管理局(SF DA ) 颁布的《化学药物急性毒性试验技术指导原则》也推荐使用该方法, 其主要的计算原理是通过阴性、阳性反应的数目来估计LD 50。UDP 由限度试验和主试验组成, 要求先把剂量集中使用在50%反应率的上下, 这样可以节约实验动物。方法是选择一系列按等比级数排列的剂量, 将动物逐只序贯地进行实验, 即先通过预实验得到一个近50%反应率的剂量, 此时开始计算实验次数。当动物出现阴性反应的时候, 就选用较高一级的剂量给予下一只动物; 当动物出现阳性反应的时候, 就选用较低一级的剂量给予下一只动物。实验所需的有效动物总数n , 应在实验开始前决定。UDP 现有计算机程序, 操作更为便利, 节约动物, 能够观察毒性表现, 得到LD 50的估计值及相应的置信区间, 所需的受试物量少[12]; 但是实验的剂量要求成等比级数排列, 而且不能求得误差, 无法对2种不同处理所求得的结果进行显著性检验。2. 6 固定剂量法(Fixed dose p r ocedure, F DP )
1984年英国毒理学会提出F DP 。布鲁塞尔协议后, 由欧洲
章元明等[15]提出用logistic 模型来确定LD 50的方法, 并于
1997年给出了抽样方差。logistic 回归是一种概率模型, 它以疾
病、死亡等结果发生的概率为因变量, 影响疾病发生的因素为
自变量建立回归模型, 通过寻找合适的模型进行l ogit 变换, 即l ogit (p ) =ln[p /(1-p ) ]来确定其方程。后经许多实例证明, logistic 模型法的结果可靠, 且多数毒性实验LD 50估计值的误差不大。在测定LD 50的实验数据中, 因剂量(x ) 与死亡率(y, %)
k /(1+e a -bx ) 拟合剂量与死呈S , f (。LD y (%x 。在毒性实模型参数k 的生物学意k =, 于是50%=100%/(1+e e -b LD 50) 。根据实验数据, 用非线性模型参数估计的麦夸脱(M arquardt ) 法, 估计模型参数a 和b , 就可以得到LD 50=a /b。同理, 也可以获得稀释度剂量的LD 50。由于稀释度一般较小, 在模型拟合时可能产生计算误差, 为使变换后的变量与死亡率仍呈S 形曲线, 故分别采用对数剂量(-LD ) 和对数剂量相反数的倒数(1/LD) 为自变量, 用logistic 模型进行拟合其曲线以确定LD 50。当自变量取-LD 时, LD 50为y 取50(%) 时所对应的-x , 则LD 50=-a /b ; 当自变量取1/LD时, LD 50为y 取50(%) 时所对应的1/x , 则LD 50=用此法计算马拉硫磷对雌性大鼠灌胃, LD 50
为1314mg/kg,与Karber 氏法的结果(1307mg/kg) 很接近。相比Karber 氏法, 此法的计算较为简单, 但若求置信度95%的区间估计, 则较难。
b /a 。章元明等
[15]
3 展望
以上介绍的各种方法同样也适用于与LD 50相似的毒性参数的计算, 如半数致死浓度(LC 50) 、半数感染量(I D 50) 、致死中
[16]
浓度(I C 50) 、半数耐受限量(MT L 48) 等。随着计算机的普及, 用计算机程序计算LD 50成为最直接、最准确、最有效的方法; 但是, 由于LD 50的求算造成了不必要的动物等资源浪费, 受到了广泛的伦理学批评。动物权利国际组织一直批评用动物进行LD 50测试, 特别是一些物质可能令动物在长时间痛苦的状态下死去[17]。英国等一些国家已开始禁止口服LD 50测试。OEC D 亦在2001年废除对口服毒性测试的要求, 而开展各种离体和替代方法的研究和论证[18]。新药的开发, 通常没有必要求出精确的LD 50, 所要关注的是动物出现的毒性与剂量间的量效关系。对于啮齿类动物, 不再需要给予致死水平的剂量。只是在特殊情况下, 从科学的角度需要测定出较为精确的LD 50, 如细胞毒类抗癌药物通常用LD 50的1/10来估计Ⅰ期临床试验的安全起始剂量。
(下转第511页)
委员会出资在世界33个实验室, 对20个化合物急性毒性实验
中国职业医学 2009年12月第36卷第6期 Ch i n O ccup M ed, Dece mber, 2009, Vol . 36, No . 6
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(收稿日期:2009-07-28 修回日期:2009-09-22)
(上接第508页) 参考文献:
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寇氏法(Karber 氏法) 是在1931年由K ARBER 提出, 由于它计算复杂, 当时并没有得到广泛推广。1963年孙瑞元设计了合理的实验, 改进并发展了寇氏法, 使其计算简化, 即为LD 50的综合计算方法, 后称之为改良寇氏法。主要计算公式为:
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b
; SE K =
Y -Y 2
; b =;
n -1i (N -H )
式中:X n 为最高反应组剂量的对数; i 为相邻2组对数剂量之差
值(即组距; m ; ∑m 为各组动物反应数的; ∑m 2; n 为每组动物数; h 为, 由于寇氏法及其改, 不需要因为数据不精确而, 省去了其他更复杂的统计计算。其计算结果精确, 能求出标准误, 只是应用时必须满足3个条件:①反应量大致呈正态分布; ②剂量必须按等比级数分布; ③各组动物数相等。虽然有条件限制, 但还是有很多研究者为能运用该法计算而合理地设计实验。因此, 寇氏法仍是最常用的LD 50计算方法之一。钟以禧[3]用该法计算大鼠灌胃马拉硫磷的毒性, 同时进行了区间估计, 实验结果和其他方法很接近。2. 2 累计法
累计法又称Reed 2Muench 法, 是用呈等比级数排列的剂量进行实验, 要求每组动物数相等。它是先将实验死亡动物数和存活动物数进行累计加和, 再用加和的数据计算死亡率。在死亡率中有2个数据A 和B , 且A 刚好大于50%, B 刚好小于50%。由于累计死亡率的直线性较不累计时的好, 在这里用上述2个数据可以得出1条直线, 且将该直线近似为死亡率与剂量关系的直线, 即50%死亡率的点在该直线上。根据数学计算可以得出比例系数r , 即r =(A -50%) /(A -B ) , r 与等比数列公比的乘积, 就是50%死亡率时的剂量与死亡率为A 时的剂量的差, 所以可以求得50%死亡率时的剂量, 即LD 50。累计法计算方便, 更多地运用在微生物学中, 尤其在稀释分析中[4]; 但此法最大的缺点是不考虑操作误差, 有个“近似”, 使得计算结果不够精确, 只可以作为实验过程中LD 50的粗略判断。2. 3 加权法
[5]
加权法又称B liss 法, 创建于1938年, 后为F I N NEY 所发展的加权机率单位法。大体计算过程为:①在坐标纸上, 根据对数剂量与经验概率单位(ye m ) 构成点, 并绘制出1条直线, 并由直线找出各对数剂量相当的概率单位称期望概率单位(Y ) ; ②计算出作业概率单位(y ) , 对Y 进行校正, y =(Y -P /Z ) +P /Z 或者y =(Y +Q /Z ) -Q /Z; ③将各点加权(n w ) , 用X 2作直线性检验。如果各点不显著偏离直线, 即可计算回归直线方程, 如果由直线方程得到的期望概率单位(Y 1) 与前次的不够接近, 则
SE 50) 2nH (N -H )
5-Y K b i
2
) 2。
在简洁度上优于累计法、寇氏法等方法, 在精确度上亦较寇氏法有所进步, 计算结果与B liss 机率单位法很接近。1974年杨世洪[2]将其运算过程进一步简化, 缩减了计算量, 推导出了新 基金项目:国家科学技术委员会“九五”科技攻关项目(9629062042
11) ; 江西省卫生厅科技计划项目(20072036)
作者单位:1. 江西科技师范学院药学院, 江西南昌330013; 2. 江西中医学院药学院, 330006; 3. 南京医科大学公共卫生学院, 210029 作者简介:顾兵(1971—) , 男, 博士后, 副教授、硕士生导师, 主要从事药理学、食品毒理学教学和神经精神药物学研究
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的新旧方法进行对比研究, 结果其毒性分级一致率为87. 2%。
可以用其代替一直沿用的LD 50法, 而且可为危险度评价提供较为足够的资料, 包括中毒作用性质、中毒发生时间、持续时间和
[13]
实验结果等。F DP 法设固定剂量以观察动物的实验反应, 不以死亡为依据, 而是按毒性症状来判断受试物质的毒性。一个实验只需10～20只动物, 首先采用1只动物(多为雌性) 顺次间隔一定时间进行5、50、500、2000mg/kg固定剂量的毒性测试, 采用流程图和结果判别表格, 操作过程大大简化。应用本法分级结果与我国毒性分级基本相似。OEC D 提出, 如果500mg/kg处理时, 无毒性反应时则做1次2000mg/kg的限度试验, 仍无毒性反应且动物全部存活时即可终止实验[14]。
2. 7 logistic 模型法
对Y 1再次校正; ④将各X 值代入直线方程Y 2=y +b (X -x ) 。反应率等于0. 5时, Y 2=5代入方程:Y 2=y +b (X -x ) 得到的值即LD 50的对数值(m ) 。B liss 法是目前最为精确、可靠的LD 50测定方法。由于其在数理上严谨精密, 甚至称其为机率单位正规法[6]。在早期, 因为其计算过程太烦琐, 很难推广。随着计算机的普及, 研究者更多运用基于B liss 法的计算程序计算LD 50。1988年我国学者应用Basic 语言开始在App le 机上计算LD 50。2. 4 霍恩氏法
霍恩氏法又称目测图解法, 与回归直线法的统计思想一样, 各种能转换成在几何上呈规则图形的数据都能运用。计算LD 50时, 一般是将剂量变换成对数剂量X 作为横坐标, 将死亡率(%) 转换成概率单位Y 作为纵坐标, 使得死亡率与对数剂量呈线性关系[7]。霍恩氏法根据实验数据直接在坐标纸上描点画出直线。直线上相当于概率单位为5(反应率为50%) 的剂量即为LD 50; 95%平均可信限:LD 50±1. 4×(LD 84-LD 16) /, 其中m 为5%～95%死亡率所用动物数。直线回归法较目测图解法精确, 但相应的计算量较大。先求出各组数据的平均值x 、
2
y , 再计算(X -x ) (Y -y ) 和(X -x ) 及∑(X -x ) (Y -y ) 和
2
∑(X -x ) 求得回归系数b, 将x 和b 代入直线回归方程Y =y +
[8]
b (X -x ) , 就能得到回归直线方程。这2种方法的特点是简单易行, 节省动物, 不足的是所得LD 50, 精确。, 得结果极为相近[9]效的。-LD 50, 不必查对数表和反应率-, 从而使计算更为简便。2. 5 序贯法
序贯法其名称源出于WALD 在1948年发表的一本同名著作, 它的研究对象是序贯抽样方案, 以及如何用这种抽样方案得到的样本去作统计推断。应用在LD 50的计算时, 序贯法也称上下法(Up 2and 2down p r ocedure, UDP ) , 最早由D I XON 和MOOD 提出。BRUCE [10]于1985年在Funda m App l T oxicol 上对UDP 进行了改进, 用于获取大概的LD 50。经济合作与发展组织(OECD ) 经过多次修订, 于2001年正式采纳UDP 法以评价受试物的急性经口毒性[11]。此外, UDP 还被美国食品药品管理局(F DA ) 和美国环保署(EP A ) 接受作为标准试验方法。我国国家食品药品监督管理局(SF DA ) 颁布的《化学药物急性毒性试验技术指导原则》也推荐使用该方法, 其主要的计算原理是通过阴性、阳性反应的数目来估计LD 50。UDP 由限度试验和主试验组成, 要求先把剂量集中使用在50%反应率的上下, 这样可以节约实验动物。方法是选择一系列按等比级数排列的剂量, 将动物逐只序贯地进行实验, 即先通过预实验得到一个近50%反应率的剂量, 此时开始计算实验次数。当动物出现阴性反应的时候, 就选用较高一级的剂量给予下一只动物; 当动物出现阳性反应的时候, 就选用较低一级的剂量给予下一只动物。实验所需的有效动物总数n , 应在实验开始前决定。UDP 现有计算机程序, 操作更为便利, 节约动物, 能够观察毒性表现, 得到LD 50的估计值及相应的置信区间, 所需的受试物量少[12]; 但是实验的剂量要求成等比级数排列, 而且不能求得误差, 无法对2种不同处理所求得的结果进行显著性检验。2. 6 固定剂量法(Fixed dose p r ocedure, F DP )
1984年英国毒理学会提出F DP 。布鲁塞尔协议后, 由欧洲
章元明等[15]提出用logistic 模型来确定LD 50的方法, 并于
1997年给出了抽样方差。logistic 回归是一种概率模型, 它以疾
病、死亡等结果发生的概率为因变量, 影响疾病发生的因素为
自变量建立回归模型, 通过寻找合适的模型进行l ogit 变换, 即l ogit (p ) =ln[p /(1-p ) ]来确定其方程。后经许多实例证明, logistic 模型法的结果可靠, 且多数毒性实验LD 50估计值的误差不大。在测定LD 50的实验数据中, 因剂量(x ) 与死亡率(y, %)
k /(1+e a -bx ) 拟合剂量与死呈S , f (。LD y (%x 。在毒性实模型参数k 的生物学意k =, 于是50%=100%/(1+e e -b LD 50) 。根据实验数据, 用非线性模型参数估计的麦夸脱(M arquardt ) 法, 估计模型参数a 和b , 就可以得到LD 50=a /b。同理, 也可以获得稀释度剂量的LD 50。由于稀释度一般较小, 在模型拟合时可能产生计算误差, 为使变换后的变量与死亡率仍呈S 形曲线, 故分别采用对数剂量(-LD ) 和对数剂量相反数的倒数(1/LD) 为自变量, 用logistic 模型进行拟合其曲线以确定LD 50。当自变量取-LD 时, LD 50为y 取50(%) 时所对应的-x , 则LD 50=-a /b ; 当自变量取1/LD时, LD 50为y 取50(%) 时所对应的1/x , 则LD 50=用此法计算马拉硫磷对雌性大鼠灌胃, LD 50
为1314mg/kg,与Karber 氏法的结果(1307mg/kg) 很接近。相比Karber 氏法, 此法的计算较为简单, 但若求置信度95%的区间估计, 则较难。
b /a 。章元明等
[15]
3 展望
以上介绍的各种方法同样也适用于与LD 50相似的毒性参数的计算, 如半数致死浓度(LC 50) 、半数感染量(I D 50) 、致死中
[16]
浓度(I C 50) 、半数耐受限量(MT L 48) 等。随着计算机的普及, 用计算机程序计算LD 50成为最直接、最准确、最有效的方法; 但是, 由于LD 50的求算造成了不必要的动物等资源浪费, 受到了广泛的伦理学批评。动物权利国际组织一直批评用动物进行LD 50测试, 特别是一些物质可能令动物在长时间痛苦的状态下死去[17]。英国等一些国家已开始禁止口服LD 50测试。OEC D 亦在2001年废除对口服毒性测试的要求, 而开展各种离体和替代方法的研究和论证[18]。新药的开发, 通常没有必要求出精确的LD 50, 所要关注的是动物出现的毒性与剂量间的量效关系。对于啮齿类动物, 不再需要给予致死水平的剂量。只是在特殊情况下, 从科学的角度需要测定出较为精确的LD 50, 如细胞毒类抗癌药物通常用LD 50的1/10来估计Ⅰ期临床试验的安全起始剂量。
(下转第511页)
委员会出资在世界33个实验室, 对20个化合物急性毒性实验
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(收稿日期:2009-07-28 修回日期:2009-09-22)
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