对比实验方案
一、研究背景
根据国际和国内有关的慢性乙肝治疗特点，HBV 基因耐药情况作为慢性乙肝治疗过程中一种重要指标，其检测结果在确定肝癌患病风险、评估乙肝病毒感染阶段以及监控治疗过程方面具有非常重要的作用，因此，选择一种高覆盖度、检测准确的HBV 诊断试剂或检测方法对临床乙肝诊断和用药监控来说至关重要。
从我国临床开展HBV DNA检测以来，该项检测就广泛的应用于乙肝治疗的过程中。但因为乙肝耐药检测试剂国内没有完善的被CFDA 批准的解决方案，国内的乙肝治疗长期依据HBV DNA病毒载量的变化来指导治疗，用药方案的采用完全依赖医生经验，导致面对疑难病人时，医生不得不求助于第三方检测机构提供的科研检测手段获取病人耐药情况。结果品质无从保证。 上海伯豪医药科技有限公司是上海生物芯片有限公司/生物芯片（上海）国家工程中心下属子公司，公司主要从事基因测序技术的医学转化工作，秉承“传递人类健康价值”理念，基于美国生命技术公司（Life Technologies）3500Dx 基因分析仪技术平台，开发了乙型肝炎（HBV ）病毒耐药基因突变检测试剂盒产品。
基因测序和基因片段分析作为分子诊断的一个技术平台, 是分子诊断技术最精确的方法, 可应用于临床遗传风险筛选和遗传疾病的诊断, 提供给医生的信息对疾病诊断和治疗及健康状况的检测提供重要依据。 同时，基于经典一代测序的技术平台检测HBV 耐药基因突变情况，比现阶段已被批准的其它检测平台的试剂盒，具有位点覆盖度高，检测结果附加值高，检测准确度高，假阴性率低等特点，因此试剂刚刚研发完成，这些特点是否具有优势值得进一步评价。
二、研究目的
以上海伯豪医药科技有限公司的“乙型肝炎病毒耐药基因检测试剂盒（PCR-测序法）”作为待考评试剂，选择立菲达安公司HBV 病毒耐药基因检测试剂作为对
照试剂，针对临床样本进行对比试验研究，通过试验数据的统计分析评价两种试剂的灵敏度、特异性、定量准确性。并比较其在临床上的应用价值。
三、研究管理
本次试验研究由 教授担任负责人，临床试验前由各试验研究单位负责人协商、确定试验方案以及试验过程质量控制方案、试验数据管理、统计分析方法等。各研究单位按照确定的试验方案进行试验研究。
四、总体设计
（一）标准血清盘/标准品检测研究
用一支标准血清样品适当稀释至关键医疗决策浓度中，2000与20000两档（表1），检测伯豪医药试剂和立菲达安诊断试剂盒的灵敏度。
表1 在患者监控过程中使用HBV DNA病毒载量的治疗决策浓度
1、灵敏度参考品的制备： 将PCR 定量检测定值的高浓度HBV 参考品（>2.00E+07 IU/ml）稀释至2.00E+04 IU/ml、2.00E+03IU/ml、2.00E+02IU/ml。
2、对比测评方法
1）灵敏度评价：
用2.00E+02IU/ml、2.00E+03IU/ml、2.00E+04IU/ml样品评价两种试剂的检测下限即检测灵敏度，每个浓度重复检测3次。
2）精密度/重复性评价：
用2.00E+07IU/ml、2.00E+05IU/ml、2.00E+03IU/ml三个浓度评价两种试剂的精密度/重复性，每个浓度重复检测5次以上。求检测的片段大小，突变点的重复出现次数。重复出现次数应为5次。片段大小应在500bp 左右。
3）结果比对 选取50例临床样品，有确认突变的样品不少于30例，阴性样品不少于5例，剩余样品在HBV 定量检测中呈阳性的样品中随机选择，用两种试剂进行检测，测序结果均用life 公司推荐的软件分析六种核苷酸药物（阿德福韦酯、拉米夫定、替比夫定、恩替卡韦、替诺福韦酯、恩曲他滨）的耐药性情况，比对两种试剂的检测结果的一致性情况。
（二）临床试验样本检测研究
1. 研究样本要求及选择依据
本试验临床总体样本数不少于100例血清或血浆样本，每份样本的体积建议不少于1ml （以便不符样本的复检），每份样本用于2种诊断试剂的临床试验。其中204、108等位点突变的样本不少于10例（包括临床诊断为肝炎或疑似感染症状的
病例样本），其它位点样品不少于20例，阴性样本不少于5例（包括诊断为其他病因如丙型肝炎、梅毒等感染病例样本以及健康体检的正常样本）。根据临床的实际情况，可以适当选择一些临床特殊样本，如黄疸、溶血等样本。
样本请保存于-20±5℃（1个月以内），长期保存请置于-70℃以下。应避免反复冻融。
样本信息最好有患者姓名、性别、和基本的乙肝两对半信息和用药方案信息（此项信息依各方伦理具体要求而定）。
2. 参与临床研究对比的试剂
伯豪医药HBV 耐药基因检测试剂盒
立菲达安HBV 耐药基因检测试剂盒
3. 研究用产品的名称、规格、来源等（表2、3）
表2 对比试验所用试剂相关信息
4. 质量控制方法
本研究过程中，将由试验负责人指派的监查员对研究单位进行现场监查访问，以保证研究方案得到严格遵守与实施、研究资料填写正确。参加研究人员必须经过相关培训（可由试剂厂家提供培训），统一记录方式与判断标准。每一试验样本均填写相关的详细资料，确保填写内容完整真实、可靠。临床试验中所有观察结果和发现都应加以核实，以保证数据的可靠性，确保试验中各项结论来源于原始数据。
在试验和数据处理阶段均有相应的数据管理措施。
每次试验均使用阴性、阳性质控品，对每次试验进行严格的质量控制，以确保临床试验的质量。
5. 具体试验方法
将入选样本编码，分别用两种试剂进行检测，采用统计学方法对检测结果进行分析。
6. 统计分析方法
以立菲达安试剂的检测结果以及伯豪医药HBV 病毒检测试剂，将研究对象分为阳性组和阴性组两组，统计分析立菲达安试剂与伯豪试剂的检测结果，评价伯豪医药试剂的灵敏度和特异性；同时比较两种试剂的阳性一致性、阴性一致性、总一致性，并进行回归性等统计分析，评价试剂的有效性以及在临床乙肝诊断中的价值。同时，评价试剂的使用方便性、仪器适用性等方面，以评价试剂在国内市场的临床应用价值。
五 各方承担的职责
临床试验研究单位应具有与研究项目相适应的人员、场地、设备、仪器和管理制度，并保证所有研究数据和资料的真实性；临床试验单位及参加人员应当了解临床试验者的责任和义务，及时、准确、真实地做好临床试验记录，出具相应的研究报告等。
对比实验方案
一、研究背景
根据国际和国内有关的慢性乙肝治疗特点，HBV 基因耐药情况作为慢性乙肝治疗过程中一种重要指标，其检测结果在确定肝癌患病风险、评估乙肝病毒感染阶段以及监控治疗过程方面具有非常重要的作用，因此，选择一种高覆盖度、检测准确的HBV 诊断试剂或检测方法对临床乙肝诊断和用药监控来说至关重要。
从我国临床开展HBV DNA检测以来，该项检测就广泛的应用于乙肝治疗的过程中。但因为乙肝耐药检测试剂国内没有完善的被CFDA 批准的解决方案，国内的乙肝治疗长期依据HBV DNA病毒载量的变化来指导治疗，用药方案的采用完全依赖医生经验，导致面对疑难病人时，医生不得不求助于第三方检测机构提供的科研检测手段获取病人耐药情况。结果品质无从保证。 上海伯豪医药科技有限公司是上海生物芯片有限公司/生物芯片（上海）国家工程中心下属子公司，公司主要从事基因测序技术的医学转化工作，秉承“传递人类健康价值”理念，基于美国生命技术公司（Life Technologies）3500Dx 基因分析仪技术平台，开发了乙型肝炎（HBV ）病毒耐药基因突变检测试剂盒产品。
基因测序和基因片段分析作为分子诊断的一个技术平台, 是分子诊断技术最精确的方法, 可应用于临床遗传风险筛选和遗传疾病的诊断, 提供给医生的信息对疾病诊断和治疗及健康状况的检测提供重要依据。 同时，基于经典一代测序的技术平台检测HBV 耐药基因突变情况，比现阶段已被批准的其它检测平台的试剂盒，具有位点覆盖度高，检测结果附加值高，检测准确度高，假阴性率低等特点，因此试剂刚刚研发完成，这些特点是否具有优势值得进一步评价。
二、研究目的
以上海伯豪医药科技有限公司的“乙型肝炎病毒耐药基因检测试剂盒（PCR-测序法）”作为待考评试剂，选择立菲达安公司HBV 病毒耐药基因检测试剂作为对
照试剂，针对临床样本进行对比试验研究，通过试验数据的统计分析评价两种试剂的灵敏度、特异性、定量准确性。并比较其在临床上的应用价值。
三、研究管理
本次试验研究由 教授担任负责人，临床试验前由各试验研究单位负责人协商、确定试验方案以及试验过程质量控制方案、试验数据管理、统计分析方法等。各研究单位按照确定的试验方案进行试验研究。
四、总体设计
（一）标准血清盘/标准品检测研究
用一支标准血清样品适当稀释至关键医疗决策浓度中，2000与20000两档（表1），检测伯豪医药试剂和立菲达安诊断试剂盒的灵敏度。
表1 在患者监控过程中使用HBV DNA病毒载量的治疗决策浓度
1、灵敏度参考品的制备： 将PCR 定量检测定值的高浓度HBV 参考品（>2.00E+07 IU/ml）稀释至2.00E+04 IU/ml、2.00E+03IU/ml、2.00E+02IU/ml。
2、对比测评方法
1）灵敏度评价：
用2.00E+02IU/ml、2.00E+03IU/ml、2.00E+04IU/ml样品评价两种试剂的检测下限即检测灵敏度，每个浓度重复检测3次。
2）精密度/重复性评价：
用2.00E+07IU/ml、2.00E+05IU/ml、2.00E+03IU/ml三个浓度评价两种试剂的精密度/重复性，每个浓度重复检测5次以上。求检测的片段大小，突变点的重复出现次数。重复出现次数应为5次。片段大小应在500bp 左右。
3）结果比对 选取50例临床样品，有确认突变的样品不少于30例，阴性样品不少于5例，剩余样品在HBV 定量检测中呈阳性的样品中随机选择，用两种试剂进行检测，测序结果均用life 公司推荐的软件分析六种核苷酸药物（阿德福韦酯、拉米夫定、替比夫定、恩替卡韦、替诺福韦酯、恩曲他滨）的耐药性情况，比对两种试剂的检测结果的一致性情况。
（二）临床试验样本检测研究
1. 研究样本要求及选择依据
本试验临床总体样本数不少于100例血清或血浆样本，每份样本的体积建议不少于1ml （以便不符样本的复检），每份样本用于2种诊断试剂的临床试验。其中204、108等位点突变的样本不少于10例（包括临床诊断为肝炎或疑似感染症状的
病例样本），其它位点样品不少于20例，阴性样本不少于5例（包括诊断为其他病因如丙型肝炎、梅毒等感染病例样本以及健康体检的正常样本）。根据临床的实际情况，可以适当选择一些临床特殊样本，如黄疸、溶血等样本。
样本请保存于-20±5℃（1个月以内），长期保存请置于-70℃以下。应避免反复冻融。
样本信息最好有患者姓名、性别、和基本的乙肝两对半信息和用药方案信息（此项信息依各方伦理具体要求而定）。
2. 参与临床研究对比的试剂
伯豪医药HBV 耐药基因检测试剂盒
立菲达安HBV 耐药基因检测试剂盒
3. 研究用产品的名称、规格、来源等（表2、3）
表2 对比试验所用试剂相关信息
4. 质量控制方法
本研究过程中，将由试验负责人指派的监查员对研究单位进行现场监查访问，以保证研究方案得到严格遵守与实施、研究资料填写正确。参加研究人员必须经过相关培训（可由试剂厂家提供培训），统一记录方式与判断标准。每一试验样本均填写相关的详细资料，确保填写内容完整真实、可靠。临床试验中所有观察结果和发现都应加以核实，以保证数据的可靠性，确保试验中各项结论来源于原始数据。
在试验和数据处理阶段均有相应的数据管理措施。
每次试验均使用阴性、阳性质控品，对每次试验进行严格的质量控制，以确保临床试验的质量。
5. 具体试验方法
将入选样本编码，分别用两种试剂进行检测，采用统计学方法对检测结果进行分析。
6. 统计分析方法
以立菲达安试剂的检测结果以及伯豪医药HBV 病毒检测试剂，将研究对象分为阳性组和阴性组两组，统计分析立菲达安试剂与伯豪试剂的检测结果，评价伯豪医药试剂的灵敏度和特异性；同时比较两种试剂的阳性一致性、阴性一致性、总一致性，并进行回归性等统计分析，评价试剂的有效性以及在临床乙肝诊断中的价值。同时，评价试剂的使用方便性、仪器适用性等方面，以评价试剂在国内市场的临床应用价值。
五 各方承担的职责
临床试验研究单位应具有与研究项目相适应的人员、场地、设备、仪器和管理制度，并保证所有研究数据和资料的真实性；临床试验单位及参加人员应当了解临床试验者的责任和义务，及时、准确、真实地做好临床试验记录，出具相应的研究报告等。