蛴螬提取物抗肿瘤作用的体外血清
药理学实验
金龙男,孙抒。。杨万山,李基俊
(延边大学基础医学院,吉林延吉133000)
【摘要】目的探讨蛴螬提取物对人肺癌A549和人宫颈癌HeL且细胞株抗肿瘤作用。方法采用血清药理
学实验方法,观察含药血清体外对人肺癌”49和人宫颈癌HeLa细胞株抗增殖作用。结果血清药理学实验结果
显示,终浓度分别为20%、25%的灭活的蛴螬提取物含药大白鼠血清对A549细胞株的增殖抑制率分别为18.92%、37.54%;终浓度分别为10%、20%、25%的灭活的蛴螬提取物含药血清对HeLa细胞株的增殖抑制率分别为39.86%、24.86%及26.60%。结论蛴螬提取物含药血清对人肺癌A549和人宫颈癌HeLa细胞株增殖有抑制作用。
[关键词】
蛴螬提取物;血清药理学;抗增殖
[中图分类号】11979.1[文献标识码]
A
[文章编号】
1002-266X(2008)01-0031-02
Sero・-pharmacologicalexperimentofanti・-tumoreffectofthegrubextractinvitro
删厶昭-n,ar/,,SUNShu,yAⅣI;耽n—shan,12Ji-jun
(Medical
College
of
Yanbian
University,拖顽133000,P.R.China)
Abstract:Objective
Toinvestigatetheanti・tunloreffectofthegrub
extract
on
theA549humanlung
cRncer
and
HeLahumancervical
carcinoma.Methods
Anti-proliferationeffect
of
the掣ub
extract
to
theA549humanlung
cancerandHeLahumancervicalcarcinomawagobservedby8eruln
pharmacologymethod.Results
Thegrowthinhibition
rates
of
A549cells
treated
by
inactivated
grubextract—containingrat
8erulll
withconcentrationof20%and25%wel[℃18.92%and
37.54%.mspecfivdy.Thegrowthinhibition
rates
ofHeLacellstreated
by
inactivated孕1lb
extract-containing
rat
senlm
with
concentration
of
10%,20%and25%were39.86%,24.86%and26.60%r鹊pectivdy.Conclusion
The伊llb
extract-containing
8erull坞havetheeffect
on
anti-proliferation
ofA549
lung
cancer
cellllne
and
HeLacellline.
Keywords:subextract;sero-pharmacology;anti・-proliferation
由于肿瘤化学治疗毒副作用大,因此抗癌药物
生物学研究所提供,延边大学肿瘤研究中心传代培
的研究对象逐渐转向天然动植物,以期从中筛选出养。
疗效突出、毒副作用小或没有毒副作用的抗癌药物。1.2药物及其试剂本实验蛴螬提取物由延边大
蛴螬是鞘翅目金龟子总科的幼虫的总称,在延边长
学药学院天然植物化学教研室经石油醚提取后又用白山地区资源丰富。2005年3月一2006年3月,我多道工序提纯制得。细胞培养液配制:RPMll640们通过血清药理学实验观察蛴螬提取物含药血清体
(GIBCO公司产品)10.4g溶于双蒸水中,加2
g
外对人肺癌A549和人宫颈癌HeLa细胞株抗增殖作
NaHC03,加小牛血清10%,放人4℃冰箱备用。新
用的影响,旨在探索蛴螬提取物的抗肿瘤作用,为抗
生小牛血清,中美合资兰州民海生物工程有限公司肿瘤中药的开发提供理论和实验依据。
产品。经56℃水浴30rain灭活,一20℃冰箱保存。1材料与方法
MTI"为美国Sigma公司产品。胰蛋白酶为Difco公
1.1动物及细胞株Wistar大鼠,雌雄各半,体质量司产品。
200—220
g,延边大学医学部动物科提供。人宫颈癌
1.3主要仪器超净工作台(上海净化设备厂),倒
HeLa及人肺癌A549细胞株,中国科学院上海细胞
置显微镜(日本OLYMPUS产品),酶标仪(美国RT一2100型,¥22PC分光光度计(上海棱光技术有限公
[基金项目]国家自然科学基金资助项目(30460047)。
司)。
・通讯作者。E-mail:sumhu@ybu.edu.cn
1.4血清药理学实验
3l
万
方数据
1.4.1实验血清的制备制备两组实验血清,即无
药血清组和蛴螬提取物含药血清组。每组取大鼠4只,雌雄各半。实验前禁食不禁水18h。取蛴螬提取物1.1g/(kg・d)(生药),每日2次灌胃,连续2
d;无药血清组灌服等容积生理盐水。末次给药2
h
后乙醚麻醉,眼眶静脉无菌采血后拉颈处死。收集
的全血2
500
r/rain离心15min,取血清,合并同组血
清后,经56℃水浴,30min灭活,放入一20℃冰箱中保存,两周内使用。1.4.2MTr法检测细胞增殖实验分组4组,即空白对照组(无药血清)和不同浓度含药血清组(10%、20%、25%)。取对数生长期的人肺癌A549细胞或人宫颈癌HeLa,用RPMll640完全培养液调整至为1×105个/lIll细胞悬液,分别接种于96孔培养板
(100∥孔)上,置于37℃、5%C02细胞培养箱中培
养,第2天待到大部分细胞贴壁后,含药血清组加20灿l不同浓度含药血清,空白对照组加无药血清,每组
均设8个样本孔。置于37℃、5%C02细胞培养箱中培养20h。每孔加MTr20斗l(5mg/m1),继续培养4h进行显色反应;然后dx,b弃去上清液,加入二甲基亚砜(DMSO)160出,中速震荡5rain,放人酶标
仪,在492nnl波长下,测定吸光度(A)值。计算细
胞增殖抑制率,抑制率(%)=(1一实验组A均值/对照组A均值)×100%。
1.5统计学方法各组数据采用SPSS10.0软件进行分析处理。
2结果
蛴螬提取物含药血清在体外对肺癌A549和宫颈癌HeLa细胞株的增殖抑制作用见表l。
表1
蛴螬提取物含药血清对肺癌A549和宫颈癌HeLa细胞株的抑制作用
3讨论
我们前期研究证实…,蛴螬提取物属低毒中药,具有抗氧化作用,可能是其抗肿瘤机制之一,另外,其在体内具有抑制小鼠移植性S180肉瘤生长的作用。本实验利用血清药理学实验方法,旨在探讨蛴螬提取物对人肺癌A549和人宫颈癌HeLa细胞株增
殖的抑制作用。
中药血清药理学研究方法是将动物灌服中药或
复方制剂后,在一定时间内采集其血清液,分离血清
32
万
方数据以进行体外药理的实验方法【2J。它模拟了药物与机体相互作用的过程,在一定程度上克服了原体外实验方法中所存在的诸多不足之处,能较为客观真实地阐明中药的药效和作用机理,并能在一定程度上揭示中药在胃肠代谢过程中活性成分的转化和改变,有助于中药真正有效活性部位和有效成分的发现【3J。在目前含药血清中的有效成分的定量分析检测尚未见突破性进展的情况下,中药血清药理学方法仍不失为抗肿瘤复方研究的一条行之有效的途径。
在血清中含有体内固有的活性物质,如激素、
酶、抗体、补体及前列腺素等各种自体活性物质,直
接加入人体外实验系统中去,是否对体外培养的细
胞、病毒、病原菌以及直接作用于体外实验器官,会产生毒性及严重干扰,对此目前有几种观点。刘成海等认为含药血清应经56℃,30min灭活,从而有助于减少血清的非药理性因素的干扰,而且又符合常规细胞培养的要求。薛洁等认为含药血清不宜灭火L4J。金哲等报道,灌服蛴螬的含药血清组对MGC一803胃癌细胞株生长抑制率达28.93%L5J。
本实验结果显示,蛴螬提取物含药血清对人肺癌A549和宫颈癌HeLa细胞有明显的抑制作用。MTT法分别检测A549和HeLa细胞增殖情况,发现终浓度分别为20%、25%的灭活的蛴螬提取物含药大白鼠血清对A549细胞株的增殖抑制率分别为
18.92%、37.54%;终浓度分别为10%、20%、25%的
灭活的蛴螬提取物含药血清对HeLa细胞株的增殖抑制率分别为39.86%、24.86%及26.60%,提示蛴
螬提取物含药血清有良好的肿瘤细胞增殖抑制作用。蛴螬提取物在诱导凋亡和抗肿瘤基因表达,以
及蛴螬提取物中抗肿瘤活性成分的提取、提纯工艺等方面有待进一步研究,以期开发出毒副作用低、具有良好的抗肿瘤活性的传统中药。
[参考文献]
[1]金龙男,孙抒,杨万山。等.蛴螬提取物抗肿瘤作用的实验研究
[J].山东医药,2007,47(27):63-65.
[23曹俊,张红梅。王旋.中药血清药理学研究概况[J].中国中医药
信息杂志.2002,9(1):80-82.
[3]林志彬.灵芝的抗肿瘤作用机制[J].基础医学与临床,2000,20
(5):391-393.
[43薛洁,谢梅林.中药血清药理学的方法学研究近况[J].中草药,
2003,34(6):106-108.
[53金哲,孙抒,李基俊,等.蛴螬提取物体外对人MGC-803胃癌细胞
株的血清药理学研究[J】.中华中西医杂志,2003,4(10):1441.1442.
(收稿日期:2007.11-05)
蛴螬提取物抗肿瘤作用的体外血清
药理学实验
金龙男,孙抒。。杨万山,李基俊
(延边大学基础医学院,吉林延吉133000)
【摘要】目的探讨蛴螬提取物对人肺癌A549和人宫颈癌HeL且细胞株抗肿瘤作用。方法采用血清药理
学实验方法,观察含药血清体外对人肺癌”49和人宫颈癌HeLa细胞株抗增殖作用。结果血清药理学实验结果
显示,终浓度分别为20%、25%的灭活的蛴螬提取物含药大白鼠血清对A549细胞株的增殖抑制率分别为18.92%、37.54%;终浓度分别为10%、20%、25%的灭活的蛴螬提取物含药血清对HeLa细胞株的增殖抑制率分别为39.86%、24.86%及26.60%。结论蛴螬提取物含药血清对人肺癌A549和人宫颈癌HeLa细胞株增殖有抑制作用。
[关键词】
蛴螬提取物;血清药理学;抗增殖
[中图分类号】11979.1[文献标识码]
A
[文章编号】
1002-266X(2008)01-0031-02
Sero・-pharmacologicalexperimentofanti・-tumoreffectofthegrubextractinvitro
删厶昭-n,ar/,,SUNShu,yAⅣI;耽n—shan,12Ji-jun
(Medical
College
of
Yanbian
University,拖顽133000,P.R.China)
Abstract:Objective
Toinvestigatetheanti・tunloreffectofthegrub
extract
on
theA549humanlung
cRncer
and
HeLahumancervical
carcinoma.Methods
Anti-proliferationeffect
of
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to
theA549humanlung
cancerandHeLahumancervicalcarcinomawagobservedby8eruln
pharmacologymethod.Results
Thegrowthinhibition
rates
of
A549cells
treated
by
inactivated
grubextract—containingrat
8erulll
withconcentrationof20%and25%wel[℃18.92%and
37.54%.mspecfivdy.Thegrowthinhibition
rates
ofHeLacellstreated
by
inactivated孕1lb
extract-containing
rat
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with
concentration
of
10%,20%and25%were39.86%,24.86%and26.60%r鹊pectivdy.Conclusion
The伊llb
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8erull坞havetheeffect
on
anti-proliferation
ofA549
lung
cancer
cellllne
and
HeLacellline.
Keywords:subextract;sero-pharmacology;anti・-proliferation
由于肿瘤化学治疗毒副作用大,因此抗癌药物
生物学研究所提供,延边大学肿瘤研究中心传代培
的研究对象逐渐转向天然动植物,以期从中筛选出养。
疗效突出、毒副作用小或没有毒副作用的抗癌药物。1.2药物及其试剂本实验蛴螬提取物由延边大
蛴螬是鞘翅目金龟子总科的幼虫的总称,在延边长
学药学院天然植物化学教研室经石油醚提取后又用白山地区资源丰富。2005年3月一2006年3月,我多道工序提纯制得。细胞培养液配制:RPMll640们通过血清药理学实验观察蛴螬提取物含药血清体
(GIBCO公司产品)10.4g溶于双蒸水中,加2
g
外对人肺癌A549和人宫颈癌HeLa细胞株抗增殖作
NaHC03,加小牛血清10%,放人4℃冰箱备用。新
用的影响,旨在探索蛴螬提取物的抗肿瘤作用,为抗
生小牛血清,中美合资兰州民海生物工程有限公司肿瘤中药的开发提供理论和实验依据。
产品。经56℃水浴30rain灭活,一20℃冰箱保存。1材料与方法
MTI"为美国Sigma公司产品。胰蛋白酶为Difco公
1.1动物及细胞株Wistar大鼠,雌雄各半,体质量司产品。
200—220
g,延边大学医学部动物科提供。人宫颈癌
1.3主要仪器超净工作台(上海净化设备厂),倒
HeLa及人肺癌A549细胞株,中国科学院上海细胞
置显微镜(日本OLYMPUS产品),酶标仪(美国RT一2100型,¥22PC分光光度计(上海棱光技术有限公
[基金项目]国家自然科学基金资助项目(30460047)。
司)。
・通讯作者。E-mail:sumhu@ybu.edu.cn
1.4血清药理学实验
3l
万
方数据
1.4.1实验血清的制备制备两组实验血清,即无
药血清组和蛴螬提取物含药血清组。每组取大鼠4只,雌雄各半。实验前禁食不禁水18h。取蛴螬提取物1.1g/(kg・d)(生药),每日2次灌胃,连续2
d;无药血清组灌服等容积生理盐水。末次给药2
h
后乙醚麻醉,眼眶静脉无菌采血后拉颈处死。收集
的全血2
500
r/rain离心15min,取血清,合并同组血
清后,经56℃水浴,30min灭活,放入一20℃冰箱中保存,两周内使用。1.4.2MTr法检测细胞增殖实验分组4组,即空白对照组(无药血清)和不同浓度含药血清组(10%、20%、25%)。取对数生长期的人肺癌A549细胞或人宫颈癌HeLa,用RPMll640完全培养液调整至为1×105个/lIll细胞悬液,分别接种于96孔培养板
(100∥孔)上,置于37℃、5%C02细胞培养箱中培
养,第2天待到大部分细胞贴壁后,含药血清组加20灿l不同浓度含药血清,空白对照组加无药血清,每组
均设8个样本孔。置于37℃、5%C02细胞培养箱中培养20h。每孔加MTr20斗l(5mg/m1),继续培养4h进行显色反应;然后dx,b弃去上清液,加入二甲基亚砜(DMSO)160出,中速震荡5rain,放人酶标
仪,在492nnl波长下,测定吸光度(A)值。计算细
胞增殖抑制率,抑制率(%)=(1一实验组A均值/对照组A均值)×100%。
1.5统计学方法各组数据采用SPSS10.0软件进行分析处理。
2结果
蛴螬提取物含药血清在体外对肺癌A549和宫颈癌HeLa细胞株的增殖抑制作用见表l。
表1
蛴螬提取物含药血清对肺癌A549和宫颈癌HeLa细胞株的抑制作用
3讨论
我们前期研究证实…,蛴螬提取物属低毒中药,具有抗氧化作用,可能是其抗肿瘤机制之一,另外,其在体内具有抑制小鼠移植性S180肉瘤生长的作用。本实验利用血清药理学实验方法,旨在探讨蛴螬提取物对人肺癌A549和人宫颈癌HeLa细胞株增
殖的抑制作用。
中药血清药理学研究方法是将动物灌服中药或
复方制剂后,在一定时间内采集其血清液,分离血清
32
万
方数据以进行体外药理的实验方法【2J。它模拟了药物与机体相互作用的过程,在一定程度上克服了原体外实验方法中所存在的诸多不足之处,能较为客观真实地阐明中药的药效和作用机理,并能在一定程度上揭示中药在胃肠代谢过程中活性成分的转化和改变,有助于中药真正有效活性部位和有效成分的发现【3J。在目前含药血清中的有效成分的定量分析检测尚未见突破性进展的情况下,中药血清药理学方法仍不失为抗肿瘤复方研究的一条行之有效的途径。
在血清中含有体内固有的活性物质,如激素、
酶、抗体、补体及前列腺素等各种自体活性物质,直
接加入人体外实验系统中去,是否对体外培养的细
胞、病毒、病原菌以及直接作用于体外实验器官,会产生毒性及严重干扰,对此目前有几种观点。刘成海等认为含药血清应经56℃,30min灭活,从而有助于减少血清的非药理性因素的干扰,而且又符合常规细胞培养的要求。薛洁等认为含药血清不宜灭火L4J。金哲等报道,灌服蛴螬的含药血清组对MGC一803胃癌细胞株生长抑制率达28.93%L5J。
本实验结果显示,蛴螬提取物含药血清对人肺癌A549和宫颈癌HeLa细胞有明显的抑制作用。MTT法分别检测A549和HeLa细胞增殖情况,发现终浓度分别为20%、25%的灭活的蛴螬提取物含药大白鼠血清对A549细胞株的增殖抑制率分别为
18.92%、37.54%;终浓度分别为10%、20%、25%的
灭活的蛴螬提取物含药血清对HeLa细胞株的增殖抑制率分别为39.86%、24.86%及26.60%,提示蛴
螬提取物含药血清有良好的肿瘤细胞增殖抑制作用。蛴螬提取物在诱导凋亡和抗肿瘤基因表达,以
及蛴螬提取物中抗肿瘤活性成分的提取、提纯工艺等方面有待进一步研究,以期开发出毒副作用低、具有良好的抗肿瘤活性的传统中药。
[参考文献]
[1]金龙男,孙抒,杨万山。等.蛴螬提取物抗肿瘤作用的实验研究
[J].山东医药,2007,47(27):63-65.
[23曹俊,张红梅。王旋.中药血清药理学研究概况[J].中国中医药
信息杂志.2002,9(1):80-82.
[3]林志彬.灵芝的抗肿瘤作用机制[J].基础医学与临床,2000,20
(5):391-393.
[43薛洁,谢梅林.中药血清药理学的方法学研究近况[J].中草药,
2003,34(6):106-108.
[53金哲,孙抒,李基俊,等.蛴螬提取物体外对人MGC-803胃癌细胞
株的血清药理学研究[J】.中华中西医杂志,2003,4(10):1441.1442.
(收稿日期:2007.11-05)