类泛素化修饰Neddylation对免疫细胞的调控作用

靳家扬等类泛素化修饰Neddylation 对免疫细胞的调控作用第5期·777·

doi ：10．3969/j．issn．1000-484X．2017．05．031

类泛素化修饰Neddylation 对免疫细胞的调控作用①

靳家扬

敬兆飞②

王

晶③

魏

林

（河北医科大学，石家庄050017）

484X （2017）05-0777-04文章编号1000-

中图分类号Ｒ392.11Ｒ392.12文献标志码

NEDD8（Neural precursor cell-expressed develop-mentally downregulated 8）是由81个氨基酸编码的

蛋白质，它和泛素蛋白（Ubiquitin ）具有60%的一致

［1］

性和80%的相似性。NEDD8分子在真核生物中具有十分重要的生物学功能，其序列在真核生物中

［2］

高度保守。

Neddylation 修饰需要的酶包括E1激活酶、E2

E3连接酶和去NEDD 化酶等［3］。已发现参结合酶、

与的E1激活酶是由APPBP1（Amyloid precursor

protein-binding protein 1）和UBA3（Ubiquitin-like modifier activating enzyme 3）组成的异源二聚体［4］；E2结合酶有UBC12和UBE2F ［5］；E3连接酶包括Ｒbx1、Dcn1、Mdm2、SCFFBXO11、c-Cbl 等［6］。与泛素有许多底物不同的是，已发现的NEDD8的内源

［7-9］

。Neddylation 系统最具有性蛋白底物非常有限

ＲINGE3特征性的底物是Cullins 。Cullins 是Cullin-泛素连接酶复合物的必要组成部分，对于蛋白降解［10］

NUB1L 、起关键的作用。其他底物包括NUB1、

ＲNF168、DNMT3B 、JunB 等；这些分子的功能也在不

1NEDD8和Neddylation

NEDD8是类泛素化蛋白家族的成员，通过一系

和底物蛋白的赖氨酸残列与泛素类似的酶促反应，

基共价结合，这个过程称为Neddylation 1. 1

［7］

。

NEDD8成熟NEDD8在酵母或者其他植物［14］

。NEDD8的成熟中被称为ＲUB1（和泛素相关）

需要其C 端剪切掉5个氨基酸，暴露76位甘氨酸，

与底物上的赖氨酸形成异构体；这种水解作用是由NEDD8特异性蛋白酶1（NEDD8-specific protease 1，

NEDP1）和UCH-LC3催化的，NEDP1也被称为

DEN1或者SENP8［15］。NEDP1是NEDD8特异性蛋UCH-L3也是加工泛素前体的酶。UCH-L3敲白酶，

低的小鼠是可以存活的，类泛素化的蛋白在没有UCH-L3的细胞内可以积累［16］，这说明在体内UCH-

LC3对于NEDD8加工不是必要的。

1. 2Neddylation 修饰与泛素化类似，成熟的NEDD8与目标蛋白的结合需要E1-E2-E3多酶系统的激活。Neddylation 第一步是成熟的NEDD8被E1NAE ）即NEDD8激活酶（NEDD8activating enzyme ，

NAE 是由APPBP1和UBA3形成的二聚体组激活，

NAE 与NEDD8形成硫酯在ATP 的作用下，成，键

［17］

断地被发现，例如NUB1和NUB1L 与NEDD8相互

作用，可引起26S 蛋白酶体的降解，而ＲNF168则与DNA 损伤有关，但仍有已发现的底物分子功能不清

［9，11］

。有报道称，小分子楚，需要进一步探究

MLN4924作为Neddylation 抑制剂可以作为一种治疗恶性肿瘤的方法，其作用机制为竞争性与ATP 同

。第二步为激活的NEDD8转移到E2即

E1酶结合，使其失去活性，从而阻止NEDD8的激

［12］

活，抑制Neddylation 的过程。Neddylation 对其底物蛋白的定位、稳定性和功能均具有调节作用

［13］

NEDD8结合酶UBC12上，与其形成另一个硫酯

［17］

键。E3即NEDD8连接酶短暂的与带有NEDD8的E2相互作用，然后通过在NEDD8C 端甘氨酸与底物赖氨酸残基形成异构肽将NEDD8转移到底物上。然后E3将E2释放掉，接受下一个带有NEDD8的E2，进行下一个循环（图1）。

NAE 是Neddylation 唯一的E1。小分子物质MLN4924可以特异性的抑制NAE ，阻止NAE 与NEDD8结合，因此，可以特异并有效的抑制Neddylation 的激活［18］。除了NAE ，泛素E1激活酶UBE1也可以作为非典型的E1，调节NEDD8与泛素

［19］

链的结合。到目前为止，只有两个E2被发现，UBC12和UBE2F 。在体内，UBC12和UBE2F 表现为两种Cullin Nedddylation 的不同类型：UBC12激活

。

①本文受北京市自然科学基金（5162026）的资助。②福建医科大学蛇毒研究所，福建350108。

③军事医学科学院基础医学研究所免疫研究室，北京100850。作者简介：靳家扬（1990年－），女，在读硕士，主要从事Neddylation 对

E-mail ：861313901@qq. com 。巨噬细胞功能方面的研究，

通讯作者及指导教师：魏

林（1961年－），女，博士，教授，博士生导师，主要从事分子免疫、感染免疫、补体与链E-mail ：weilin21@球菌感染机制方面的研究，sina. com 。

·778·中国免疫学杂志2017年第33卷

已被证明在各种疾病过程中发挥作用，包括不孕、纤

［26］

维化、代谢综合征、肝癌等。最近有研究表明，MLN4924作为Neddylation 的抑制剂在不影响巨噬

下调LPS 诱导巨噬细胞产生的炎细胞存活的情况，

28］6、TNF-1β［27，。下调IL-6症因子，包括IL-α和IL-和TNF-α的机制为MLN4924抑制了Cullin 的Ned-

图1Fig．1

Neddylation 生化反应过程Neddylation biochemical process

dylation ，使CＲLE3酶失活，导致I κB-α的积累。

I κB-α是CＲL的底物和核因子-κB （Nuclear Factor-NF-MLN4924阻κB ，κB ）信号通路的抑制剂。因此，［28］

1β断了NF-κB 调节的炎症因子的表达。而IL-水平降低，是由于MLN4924或者NEDD8缺陷影响

caspase-1加工，1β的成熟［27］。这表进而影响IL-Neddylation 途径在调节巨噬细胞分泌炎症介质明，

功能上起着重要作用，并预示Neddylation 抑制剂MLN4924可以作为潜在的抗炎药物［28］。除此之外，有文献报道，在巨噬细胞系Ｒaw264.7中，持久而强烈的抑制Neddylation 修饰可以诱导巨噬细胞G2期细胞阻滞，明显影响细胞阻滞，进一步诱导细胞凋亡，这说明Neddylation 在影响巨噬细胞存活和

［29］

增殖方面也具有非常重要的意义。

Neddylation 对于人类单纯疱疹另有研究发现，

HSV-1）诱导病毒Ⅰ型（Herpes simplex virus type Ⅰ，

［30］

的巨噬细胞Ⅰ型干扰素的早期产生是必需的。HSV-1在人群中普遍感染，在80%的成年人中终身

［5，20］

Cullins 1-4，。E3连接酶而UBE2F 激活CUL5

有很多种，在酵母，DCN1（defective in cullin

neddylation 1protein ）是其E3连接酶，作为底物和Neddylation E2UBC12相互作用的平台［21］。在哺乳动物，有5种DCN1类似的蛋白（DCNL ）作为其E3，

DCNL3促进其中DCNL1促进Cullin 1neddylation ，cullin 3neddylation

［19］

。其他E3neddylation 连接酶

c-CBI 、parkin 和IAP ，例如MDM2、均可以促进多种

［22］

细胞内蛋白发生Neddylation 。

2Deneddylation

Neddylation 在去Neddylation 酶的作用下，与

Deneddylation 维持着动态平衡。去Neddylation 的酶能够将NEDD8从修饰蛋白中解离下来，这些酶NEDP1、USP21、包括CSN （the CDP9signalosome ）、

Ataxin-3、UCHL1和UCH-L3［3］。在这些酶中，只有CSN 和NEDP1是NEDD8专一性，其他也可以调节泛素化修饰的去泛素化

［23］

。HSV-1主要引起口腔损害，偶尔引起夜盲

［31］

1感染的固有免疫和致命的散发脑炎。抗HSV-感染

Ⅰ型干扰素比如IFN-β具有重要抗病毒作中，

［32］用。Ⅰ型干扰素的转录是由NF-κB 和干扰素调节IＲF）例如IＲF3调因子（Interferon regulatory factor ，［33］

6炎症因子的节。机制与上述影响TNF-α和IL-Neddylation 抑制剂MLN4924和E1酶表达类似，

UBA3缺陷，并未影响IＲF3信号通路，而是导致HSV 感染早期阶段NF-κB 信号通路的激活障碍，从

［30］

而导致早期IFN-β产生减少。由此可见，Neddylation 对于巨噬细胞发挥抗病毒效应早期有重

［30］

要作用。

3. 2T 细胞CD4+T 细胞的活化是T 细胞抗原受

TCＲ）和共刺激的分子通过激活体（T cell receptor ，

［31］

。CSN 是最具有特征性

的去Neddylation 酶，它在动植物中高度保守。CSN

已反复被证明可以将NEDD8从Cullin 蛋白和非Cullin 蛋白上移除

［24］

。

3Neddylation 修饰对免疫细胞及炎症因子的影响

正是因为Neddylation 修饰的功能重要性，其在

肿瘤、神经发育、调节免疫系统中均发挥重要作用，

下面重点介绍Neddylation 修饰在调节免疫细胞中的作用。

3. 1Neddylation 修饰在巨噬细胞中的作用物入侵的应答中的关键细胞成分御的能力

［17］

［25］

巨噬

诱导其增殖，细胞因子产生，以及分某些信号通路，

化为辅助T 细胞（TH ）和记忆T 细胞亚群的过程

［34］

细胞属于单核巨噬细胞系统，是固有免疫病原微生

。巨噬细胞不

仅具有吞噬功能，还具有分泌炎症因子，调节宿主防

。这些炎症介质通过自分泌和旁分泌，

影响邻近细胞。巨噬细胞的这些介质的分泌失调，

。已有报道泛素和类泛素蛋白翻译后修饰是

［35］

调节T 细胞功能的一个重要机制。研究表明，Neddylation 对于TCＲ诱导的CD4+T 细胞增殖和激

［36］

活是必需的。TCＲ兴奋导致胞外信号调节激酶

（Extracellular signal-regulated kinase ，EＲK）的激活需

靳家扬等类泛素化修饰Neddylation 对免疫细胞的调控作用第5期·779·

要完整的Neddylation 系统；研究发现Shc 蛋白是Neddylation 影响EＲK信号通路的靶分子，Shc 蛋白Shc-Grb2的形成，从而影响促进信号复合物ZAP70-EＲK信号通路下游分子的活化［36］。Neddylation E2

酶UBC12表达降低会使初始CD4T 细胞比例增++

加，记忆CD4T 细胞比例降低；初始CD4T 细胞增

4展望

Neddylation 是一系列独特的活化酶综上所述，

最终使NEDD8与底物蛋白结合，完级联反应过程，

成蛋白质的修饰，从而调节细胞活动。虽然

Neddylation 研究在不断取得重大进展，但是还有许反应体系中的酶及其底物多问题有待解决。例如，还在不断被发现，其生物学功能也在不断被阐明。E3连接酶对于相同的底物是如何区别Neddylation 和泛素化，仍不清楚。Neddylation 与疾病的关系密切，已有大量报道发现Neddylation 促进肿瘤发生，MLN4924作为Neddylation 的抑制剂已进入临床Ⅰ期试验。而Neddylation 与免疫系统相关疾病的关系，仍在不断被探索发现。以上研究结果表明，Neddylation 与免疫细胞关系密切，与炎症性疾病和自身免疫疾病密切相关。因此，更进一步的研究Neddylation 与免疫系统的关系，可能有助于缓解免疫调节性疾病的进程。

UBC12敲低的CD4+T 细胞增殖被阻殖能力也降低，

滞在细胞周期G0/G1期，不能顺利进入S 期，同时

影响其向Th1和Th2分化；但UBC12缺陷并不影响CD4+T 细胞的存活［36］。进一步检测Neddylation 对CD4+T 细胞产生细胞因子的影响，发现TCＲ活化

2减少；抑制Neddylation ，使CD4T 细胞产生IL-时，

UBC12敲低的脾CD4+T 细胞在体外接受抗原刺激2的能力受损，这说明时，产生IFN-γ和IL-Neddylation 参与CD4+T 细胞对抗原刺激诱导的细

胞因子的产生；并且UBC12敲低的CD4T 细胞在

4的能向Th1和Th2分化环境中，产生IFN-γ和IL-说明Neddylation 对于其向Th1和Th2分力也下降，化是必要的

［36］

。用MLN4924抑制Neddylation 影响。除此之外，研究还发现NEDD8

参考文献：

［1］Kamitani T ，Kito K ，Fukuda-Kamitani T ，et al ．Targeting of NEDD8

and its conjugates for proteasomal degradation by NUB1［J ］．J Biol Chem ，2001，276（49）：46655-46660.

［2］Guthrie LA ，McPhail LC ，Henson PM ，et al ．Priming of neutrophils

for enhanced release of oxygen metabolites by bacterial lipopolysac-charide. Evidence for increased activity of the superoxide-producing enzyme ［J ］．J Exp Med ，1984，160（6）：1656-1671.

［3］Watson IＲ，Irwin MS ，Ohh M. NEDD8pathways in cancer ，Sine

J ］．Cancer Cell ，2011，19（2）：168-176. Quibus Non ［

［4］Tateishi K ，Omata M ，Tanaka K ，et al ．The NEDD8system is

essential for cell cycle progression and morphogenetic pathway in mice ［J ］．J Cell Biol ，2001，155（4）：571-579.

［5］Huang DT ，Ayrault O ，Hunt HW ，et al ．E2-ＲINGexpansion of the

NEDD8cascade confers specificity to cullin modification ［J ］．Mol Cell ，2009，33（4）：483-495.

［6］Zhao Y ，Sun Y. Cullin-ＲINGLigases as attractive anti-cancer

targets ［J ］．Curr Pharm Des ，2013，19（18）：3215-3225.

［7］Xirodimas DP. Novel substrates and functions for the ubiquitin-like

molecule NEDD8［J ］．Biochem Soc Trans ，2008，36（Pt 5）：802-806.

［8］Kim W ，Bennett EJ ，Huttlin EL ，et al ．Systematic and quantitative

assessment of the ubiquitin-modified proteome ［J ］．Mol Cell ，2011，44（2）：325-340. ［9］

Enchev ＲI，Schulman BA ，Peter M. Protein neddylation ：beyond cullin-ＲINGligases ［J ］．Nat ＲevMol Cell Biol ，2015，16（1）：30-44.

［10］Xie P ，Zhang M ，He S ，et al ．The covalent modifier Nedd8is

critical for the activation of Smurf1ubiquitin ligase in tumorigenesis ［J ］．Nat Commun ，2014，5：3733.

［11］Li H ，Zhu H ，Liu Y ，et al ．Itch promotes the neddylation of JunB

CD4+T 细胞产生细胞因子的能力与敲低UBC12基因的效果相同

［36］

途径对Th2调节的肺部炎症起促进作用，抑制

neddylation 可以减轻气道炎症，这也许为T 细胞介导的炎症性疾病和自身免疫病提供了治疗方法3. 3作用

［13，36］

。

树突状细胞（Dendritic cells ，

树突状细胞

［37］

DCs ）对于固有免疫和适应性免疫具有非常重要的

。DCs 受到炎性刺激物、细菌以及病毒刺

［38］

［39］

，并释放炎性因子。

激，就会上调共刺激分子子分泌的至关重要

［40］

Neddylation 在调节树突状细胞炎症因有研究报道，

。抑制Neddylation 在未影响

树突状细胞的存活的前提下，可以抑制DC 的Toll

like receptors ，TLＲ）和核苷酸低聚反应样受体（Toll-区域样受体下游信号通路激活，从而大大降低DC IL-6炎症因子的水平分泌TNF-α、的能力

［40］

。Neddylation

还抑制了DC 对T 细胞的激活功能和产生干扰素-γ

。机制为MLN4924抑制了NF-κB 的激

阻碍NF-κB 的入活：MLN4924抑制了I κB 的降解，

并降低其活性，但是没有影响到丝裂原活化蛋白核，

［40］

。激酶/胞外信号调节激酶通路（MAPK /EＲK）

炎症因子促进很多疾病的发生，包括慢性炎症性疾病、休克、自身免疫和移植物抗宿主免疫疾病

［41，42］

。

因此，阻断Neddylation 也许可以缓解免疫调节性疾

病的进程。

·780·

and regulates JunB-dependent transcription ［J ］．Cell Signal ，2016，28（9）：1186-1195.

［12］Godbersen JC ，Humphries LA ，Danilova OV ，et al ．The Nedd8-activating enzyme inhibitor MLN4924thwarts microenvironment-driven NF-kappaB activation and induces apoptosis in chronic 2014，20lymphocytic leukemia B cells ［J ］．Clin Cancer Ｒes，（6）：1576-1589.

［13］Zuo W ，Huang F ，Chiang YJ ，et al ．c-Cbl-mediated neddylation

antagonizes ubiquitination and degradation of the TGF-beta type II receptor ［J ］．Mol Cell ，2013，49（3）：499-510.

［14］Kumar S ，Yoshida Y ，Noda M. Cloning of a cDNA which encodes

a novel ubiquitin-like protein ［J ］．Biochem Biophys Ｒes1993，195（1）：393-399. Commun ，

［15］Frickel EM ，Quesada V ，Muething L ，et al ．Apicomplexan UCHL3

retains dual specificity for ubiquitin and Nedd8throughout J ］．Cell Microbiol ，2007，9（6）：1601-1610. evolution ［

［16］Kwon J ，Wang YL ，Setsuie Ｒ，et al ．Two closely related ubiquitin

C-terminal hydrolase isozymes function as reciprocal modulators of ．Am J Pathol ，2004，germ cell apoptosis in cryptorchid testis ［J ］165（4）：1367-1374.

［17］Gong L ，Yeh ET. Identification of the activating and conjugating

enzymes of the NEDD8conjugation pathway ［J ］．J Biol Chem ，1999，274（17）：12036-12042.

［18］Soucy TA ，Smith PG ，Milhollen MA ，et al ．An inhibitor of

NEDD8-activating enzyme as a new approach to treat cancer ［J ］．Nature ，2009，458（7239）：732-736.

［19］Huang G ，Kaufman

AJ ，Ｒamanathan

Y ，et

al ．SCCＲO

（DCUN1D1）promotes nuclear translocation and assembly of the neddylation E3complex ［J ］．J Biol Chem ，2011，286（12）：10297-10304.

［20］Embade N ，Fernandez-ＲamosD ，Varela-ＲeyM ，et al ．Murine

double minute 2regulates Hu antigen Ｒstability in human liver ．Hepatology ，2012，55and colon cancer through Neddylation ［J ］（4）：1237-1248.

［21］Kurz T ，Chou YC ，Willems AＲ，et al ．Dcn1functions as a

scaffold-type E3ligase for cullin neddylation ［J ］．Mol Cell ，2008，29（1）：23-35.

［22］Broemer M ，Tenev T ，ＲigboltKT ，et al ．Systematic in vivo ＲNAi

analysis identifies IAPs as NEDD8-E3ligases ［J ］．Mol Cell ，2010，40（5）：810-822.

［23］ＲabutG ，Peter

M. Function

and

regulation

protein

［40］

neddylation. ' Protein modifications ：beyond the usual suspects' review series ［J ］．EMBO Ｒep，2008，9（10）：969-976.

［24］Wei N ，Serino G ，Deng XW. The COP9signalosome ：more than a

protease ［J ］．Trends Biochem Sci ，2008，33（12）：592-600.

［25］

Hume DA. The mononuclear phagocyte system ［J ］．Curr Opin Immunol ，2006，18（1）：49-53.

［26］Wynn TA ，Barron

245-257.

［27］Segovia JA ，Tsai SY ，Chang TH ，et al ．Nedd8regulates

inflammasome-dependent caspase-1activation ［J ］．Mol Cell Biol ，2015，35（3）：582-597.

L. Macrophages ：

master

regulators

inflammation and fibrosis ［J ］．Semin Liver Dis ，2010，30（3）：

［31］

中国免疫学杂志2017年第33卷

［28］Chang FM ，ＲeynaSM ，Granados JC ，et al ．Inhibition of

neddylation represses lipopolysaccharide-induced proinflammatory J ］．J Biol Chem ，2012，cytokine production in macrophage cells ［287（42）：35756-35767.

［29］Li L ，Liu B ，Dong T ，et al ．Neddylation pathway regulates the pro-．Biochem Biophys Ｒesliferation and survival of macrophages ［J ］Commun ，2013，432（3）：494-498.

［30］Zhang X ，Ye Z ，Pei Y ，et al ．Neddylation is required for herpes

simplex virus type I （HSV-1）-induced early phase interferon-beta production ［J ］．Cell Mole Immunol ，2015，13（5）：578-583. Johnson KE ，Bottero V ，Flaherty S ，et al ．IFI16restricts HSV-1replication by accumulating on the hsv-1genome ，repressing HSV-1and directly or indirectly modulating histone modi-gene expression ，

fications ［J ］．PLoS Pathog ，2014，10（11）：e1004503.

［32］Murphy AA ，ＲosatoPC ，Parker ZM ，et al ．Synergistic control of

and IＲF-7revealed herpes simplex virus pathogenesis by IＲF-3，through non-invasive biolu minescence imaging ［J ］．Virology ，2013，444（1-2）：71-79.

［33］Clement JF ，Meloche S ，Servant MJ. The IKK-related kinases ：

from innate immunity to oncogenesis ［J ］．Cell Ｒes，2008，18（9）：889-899.

［34］Ockinger J ，Hagemann-Jensen M ，Kullberg S ，et al ．T-cell

activation and HLA-regulated response to smoking in the deep ．Clin Immunol ，airways of patients with multiple sclerosis ［J ］2016，169：114-120.

［35］Liu YC ，Penninger J ，Karin M. Immunity by ubiquitylation ：a

2005，5reversible process of modification ［J ］．Nat ＲevImmunol ，（12）：941-952.

［36］Jin HS ，Liao L ，Park Y ，et al ．Neddylation pathway regulates T-cell function by targeting an adaptor protein Shc and a protein kinase Erk signaling ［J ］．Proc Natl Acad Sci U S A ，2013，110（2）：624-629.

［37］Satpathy AT ，Wu X ，Albring JC ，et al ．Ｒe（de ）fining the dendritic

cell lineage ［J ］．Nat Immunol ，2012，13（12）：1145-1154.

［38］Turley SJ ，Inaba K ，Garrett WS ，et al ．Transport of peptide-MHC

class II complexes in developing dendritic cells ［J ］．Science ，2000，288（5465）：522-527.

［39］Mellman I ，Steinman

255-258.

Mathewson N ，Toubai T ，Kapeles S ，et al ．Neddylation plays an important role in the regulation of murine and human dendritic J ］．Blood ，2013，122（12）：2062-2073. cell function ［

［41］Tabas I ，Glass CK. Anti-inflammatory therapy in chronic disease ：

challenges and opportunities ［J ］．Science ，2013，339（6116）：166-172.

［42］Tawara I ，Koyama M ，Liu C ，et al ．Interleukin-6modulates graft-versus-host responses after experimental allogeneic bone marrow J ］．Clin Cancer Ｒes，2011，17（1）：77-88. transplantation ［

ＲM.Dendritic

cells ：specialized

and

regulated antigen processing machines ［J ］．Cell ，2001，106（3）：

［07-19收稿2016-09-12］修回2016-（编辑

倪

鹏）