蛋白质磷酸化修饰的研究进展

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生物技术通讯

Vol．20No．2Mar．,2009

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doi:10．3969／j．issn．1009－0002．2009．02．025

综述

蛋白质磷酸化修饰的研究进展

姜铮，王芳，何湘，刘大伟，陈宣男，赵红庆，黄留玉，袁静

中国人民解放军疾病预防控制研究所，北京100071［摘要］

蛋白质磷酸化是最常见、最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式，它参与和调控生物体内的许多生命活动。通过蛋

白质的磷酸化与去磷酸化，调控信号转导、基因表达、细胞周期等诸多细胞过程。随着蛋白质组学技术的发展和应用，蛋白质磷酸化的研究越来越受到广泛的重视。我们介绍了蛋白质磷酸化修饰的主要类型与功能、磷酸化蛋白质分析样品的富集及制备、磷酸化蛋白的鉴定及磷酸化位点的预测、蛋白分离后磷酸化蛋白的检测，及蛋白质磷酸化的分子机制，并综述了近年来国内外的主要相关研究进展。［关键词］

磷酸化修饰；磷酸化蛋白鉴定；磷酸化位点检测

［中图分类号］

Q52［文献标识码］A［文章编号］1009－0002(2009)02－0233－05

ProgressonProtein／PeptidePhosphorylation

JIANGZheng,WANGFang,HEXiang,LIUDa－Wei,

CHENXuan－Nan,ZHAOHong－Qing,HUANGLiu－Yu,YUANJing

InstituteofDiseaseControlandPrevention,AcademyofMilitaryMedicalSciences,100071Beijing,China

［Abstract］

Phosphorylationisoneofthemostimportantpost－translationalmodificationsofproteins,whichisrelatedto

manyactivitiesoflife．Byreversibleproteinphosphorylationeukaryotescontrolmanycellularprocessesincludingsignal

Thisarticlehasintroducedthemaintypesandfunctionsofthe

theidentificationofthe

transduction,geneexpression,andthecellcycleetc．Asthedevelopmentandapplicationoftheproteomics,thestudiesoftheproteinphosphorylationhavebecomemoreimportant．proteinphosphorylation,

theenrichmentandpreparationofphosphoproteinsandphosphopeptides,

phosphopeptides,thedeterminationandpredictionofthespecific－phosphorylation－site,thephosphorelatedmodificationsoftheproteins,andtheprogressonstudiesaboveaswell．

［Keywords］

phosphorelatedmodifications;identificationofthephosphopeptides;determinationofthespecific－phosphory-

lation－site

几乎所有的蛋白质在合成过程中或合成后都要经过某些形式的翻译后修饰，一些不合适的修饰常常与疾病相关，某些特定的翻译后修饰还被作为疾病的生物标志或治疗的靶标。

磷酸化是一种广泛的翻译后修饰，同时也是原核和真核生物中最重要的调控修饰形式[1－2]，由于蛋白质氨基酸侧链加入了一个带有强负电的磷酸基团，发生酯化作用，从而改变了蛋白质的构型、活性及与其他分子相互作用的能力，在许多生物学过程，如信号传导、基因表达、细胞分裂等的调控中起着重要作用，异常的蛋白质磷酸化通常与癌症有关。在真核生物中，磷酸化主要发生于丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸等残基；而在细菌中，蛋白质主要通过天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸等残基被磷酸化；有些蛋白质在原核生物和真核生物中均可被磷酸化，它们的磷酸化位点通常是精氨酸、赖氨酸和半胱氨酸残基。编码蛋白激酶和磷酸酶的基因约占真核生物基因组的2％～4％（酵母基因组中约有120个激酶基因和40个磷酸酶基因，人类基因组中约有500个激酶基因和100个磷酸酶基因）。人类蛋白质组中含有10万多个潜在的磷酸化位点，大多数磷酸化蛋白含有一个以上的磷酸化位点，并且以不同磷酸化形式的混合物存在，在胞内活性调控中发挥着重要的作用。此外，磷酸化蛋白质是各种磷酸化形式的复合

［收稿日期］2008－08－30

［基金项目］国家高技术研究发展计划（2007AA02Z118）；

国家自然科学基金（30771809）

［作者简介］姜铮（1980－），男，硕士研究生

［通信作者］袁静，（E－mail）yuanjing6216＠sohu．com

物，而且是动态变化的，所以对磷酸化蛋白质组的定量研究也非常重要。随着磷酸化蛋白质富集手段的发展及用于分析磷酸肽的质谱技术的提高，对磷酸化蛋白质的分析进展迅速。

对磷酸化蛋白质组（细胞内所有磷酸化蛋白质的统称）所涉及的磷酸化蛋白种类、磷酸化位点，以及不同条件下各种磷酸化形式的丰度组成的系统研究是目前的热点。

1蛋白质磷酸化的主要类型与功能

根据磷酸氨基酸残基的不同，可将磷酸化蛋白质分为4类，

即O－磷酸盐、N－磷酸盐、酰基磷酸盐和S－磷酸盐。O－磷酸盐是通过羟基氨基酸的磷酸化形成的，如丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸、羟脯氨酸或羟赖氨酸磷酸化；N－磷酸盐是通过精氨酸、赖氨酸或组氨酸的磷酸化形成的；酰基磷酸盐是通过天冬氨酸或谷氨酸

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的磷酸化形成的；而S－磷酸盐则通过半胱氨酸磷酸化形成。

蛋白质磷酸化具有以下功能：①磷酸化参与酶作用机制，在此过程磷酸化为反应中间产物（多为S－或N－磷酸盐），如在磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶依赖的磷酸转移酶系统（PTR）中的组氨酸蛋白激酶（HPr）；②磷酸化介导蛋白活性，蛋白分子通过蛋白激酶发生磷酸化，如蛋白激酶A（丝氨酸和苏氨酸残基）或不同的受体酪氨酸激酶（酪氨酸残基）；③天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸的磷酸化在细菌趋化反应的感觉性传导中发生解离。

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进行。第一种方法是在强碱性环境中加入硫基乙醇，替换丝氨酸和苏氨酸残基上的磷酸基团，使巯基暴露并与生物素亲和标签相结合，然后通过链霉素包被的磁珠将磷酸化蛋白或磷酸肽从复合体中分离出来。胱氨酸和甲硫氨酸也可以这种方法进行衍生，在反应之前须用蚁酸处理将其氧化。巯基乙醇处理时最大的缺点是它不能与磷酸化的酪氨酸反应，而且O－糖基化的丝氨酸和苏氨酸残基也会被这种方法衍生，因此需要进一步的实验来确认蛋白是否真的被磷酸化。第二种方法是通过碳二酰乙胺浓缩反应将胱胺加到磷酸基团上，再通过碘乙酰磁珠对磷酸化蛋白或磷酸肽进行亲和分离。

在以上这些基于层析技术的方法中，层析柱填料的性质是影响富集效果的关键因素。2004年，Pinkse等[13]利用TiO2填料自制层析柱，将自磷酸化蛋白PKG酶切产物分离后进行在线ESI－

2磷酸化蛋白质分析样品的富集及制备

通常在检测和鉴定磷酸化蛋白、定位磷酸化修饰位点，并定

量分析不同条件下的磷酸化情况时，由于很多样品是磷酸化和非磷酸化蛋白质的混合物，磷酸化肽段丰度很低，在质谱鉴定时易被其他肽段掩盖，所以常常需要对磷酸化蛋白质或肽段富集后再进行鉴定。

富集磷酸化蛋白质、肽段的经典方法有金属离子亲和层析（IMAC）[3]、生物素亲和素富集[4]、免疫沉淀[5]和磷酸化抗体亲和层析[6]等。利用抗体与磷酸化蛋白特异结合是最简单的富集方法，高亲和性抗体可以从复杂混合物中免疫沉淀特定的蛋白。酪氨酸磷酸化蛋白质的单克隆抗体是已知较好的检测抗体，可通过免疫共沉淀分离纯化酪氨酸磷酸化的蛋白质[7]。Tilley等[8]利用磷酸化酪氨酸抗体对小麦的高分子量谷蛋白进行了Western印迹分析，发现了酪氨酸磷酸化的高分子量谷蛋白亚基。Pandey等[5]利用特异性抗磷酸化酪氨酸抗体研究表皮生长因子（EGF）的信号途径，发现该途径正是靠酪氨酸的磷酸化调节的。EGF受体的寡聚体在EGF刺激下，通过其他亚单位的酪氨酸激酶的活性（自体磷酸化）诱导了一个潜在的激酶的活性，使寡聚体受体亚单位磷酸化。SRC同源体2结构域（SH2）或磷酸化酪氨酸相互作用结构域（PID）的蛋白被受体激活，特异性结合磷酸化酪氨酸的残基，并被磷酸化。他们进一步采用2种抗体的混合物分别免疫沉淀HeLa细胞中受EGF刺激和未受EGF刺激的含有磷酸化酪氨酸的蛋白，鉴定到9个酪氨酸磷酸化的蛋白对EGF有特异性应答，其中7个是已知的EGF途径中的蛋白，另外2个蛋白VAV2和STAM2是未知的。2002年，磷酸化酪氨酸特异的片段离子扫描技术被用于研究EGF途径，鉴定到10个组分，新发现了位于蛋白SHIP－2、Hrs、Cbl、STAM和STAM2的5个磷酸化位点[9]。此外，其他磷酸化残基如丝氨酸和苏氨酸的抗体也有相应的商品。

MS／MS分析，鉴定出PKG至少有8个磷酸化位点，并发现了Ser26和Ser44等2个新的磷酸化位点。他们认为TiO2填料可与磷

酸化肽段高效、特异地结合，可以有效富集磷酸化肽段。Larsen等

[14]

比较了反相树脂与石墨填料柱对磷酸化肽段的分离效果，认为

后者可有效滞留磷酸化肽段，更适合磷酸化肽段的富集、分离和鉴定。Steven等[15]发现在pH2．7左右大部分胰蛋白酶酶切肽段带有2个正电荷,而肽段上有一个磷酸化修饰时则带有1个正电荷，可利用强阳离子交换色谱将其富集，并在HeLa细胞核中鉴定出967个蛋白中的2002个磷酸化位点，得到了迄今最大的磷酸化蛋白谱。

3蛋白分离后磷酸化蛋白的检测

可以通过对磷酸化蛋白的选择性染色或标记检测胶中、膜

上及层析柱洗脱组分中的磷酸化蛋白质组。胶／膜的染色灵敏度较低，只能检测丰度很高的磷酸化蛋白，但有助于鉴定不同的磷酸化修饰形式（这些不同修饰形式的磷酸化蛋白在凝胶中的迁移形式会略有差别，如形成链状的点等），还可用于检测不同样品之间某些蛋白质是否发生了磷酸化，以及磷酸化程度明显不同的蛋白。

用32P选择性标记磷酸化蛋白是一种经典的技术，可以通过纯化激酶及［γ－32P］进行体外标记，或利用［γ－32P］－ATP或32PO43－（正磷酸盐）平衡胞内的ATP水平进行体内标记，然后通过SDS－

PAGE、2D－GE或薄层层析对蛋白质进行分离，再经放射自显影

或光学成像检测标记的磷酸化蛋白，单个蛋白点可以从胶上或膜上剪切出来，也可以从色谱柱中洗脱时收集放射性标记的蛋白质组分。体外检测到的磷酸化蛋白是否具有生物学意义，必须对它在体内的磷酸化情况进行验证，因为在体外情况下激酶可能会与许多在生理条件下因处于不同的细胞或亚细胞结构而根本无法接触到的蛋白质发生作用，从而得出假阳性结论；蛋白质被［γ－32P］－ATP放射性标记，通常在消化后通过凝胶电泳或薄层层析分离，可以鉴定磷酸化酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸。而体内磷酸化标记研究也取决于机体本身磷酸化的效率及靶蛋白磷酸化与非磷酸化形态之间的平衡关系。如果某一蛋白已经被磷酸基团所饱和，那么不论激酶的活性如何也不会有放射性标记的磷酸基团插入，因此也检测不到磷酸化蛋白；对于经体内32PO43－标记的蛋白质，需要通过双向电泳进行高分辨率的分离。如果蛋白或磷酸化的氨基酸残基可以通过荧光试剂衍生，那么就可以通

Gronborg等[10]用6种不同的检测丝氨酸和苏氨酸磷酸化蛋白质

的抗体对细胞总蛋白质进行免疫沉淀，其中3种抗体可对丝氨酸和苏氨酸发生磷酸化的蛋白质进行免疫沉淀，共鉴定出7个与丝氨酸和苏氨酸发生磷酸化的蛋白质。直接作用于磷酸化丝氨酸或磷酸化苏氨酸的抗体也能用于Western印迹分析，但由于在免疫共沉淀时抗体特异性不高，因而未得到广泛应用。

另一种磷酸肽的富集方法是金属离子亲和层析法[3]。磷酸基团与固相化的金属离子有高亲和力，可被选择性地吸附在上面，富集微量磷酸肽样品[11－12]，可以进行IMAC纯化的磷酸肽的离线分析与在线的电喷雾质谱分析。由于IMAC柱会与其他带负电的氨基酸如天冬氨酸和谷氨酸等相结合，层析之前应对蛋白样品中所有的羧酸基团进行甲酯化修饰。

亲和纯化磷酸肽时需要的起始材料较多，常采用2种方法

姜铮等：蛋白质磷酸化修饰的研究进展

过HPLC结合紫外检测鉴定和定量磷酸化残基。Lees－Miller等[16]利用放射性32P对人体内的2种热激蛋白进行了标记，最终鉴定出保守的丝氨酸磷酸化位点。deCarvalho等[17]在昆虫细胞表达了人单核细胞中的细胞质磷脂酶A2，并采用放射性32P标记法鉴定出磷酸化蛋白及其磷酸化位点。

同位素编码亲和标签（ICAT）[18]作为蛋白水平定量的质量标签，已被进一步扩展用于蛋白质磷酸化研究。目前，应用磷酸同位素标记亲和标签（PhIAT）已建立了2种从复杂混合物中专一分离磷酸化蛋白／肽的方法。Goshe等[19]将肽或蛋白混合物置于碱性硫代二乙醇溶液中，通过β－消除从磷酸化丝氨酸或苏氨酸中去掉H3PO4，形成的双键受到硫代二乙醇的作用，巯基取代磷酸根，生物素与巯基相连，这样标记过的蛋白肽即可用色谱分离。Zhou等[20]用另外一种方法修饰磷酸化肽，用碳二亚胺浓缩反应将半胱氨酸加在磷酸盐部分，修饰过的肽段以共价键与碘乙酰胺树脂结合，酸洗涤释放。此方法既可用于标记富集磷酸化酪氨酸，也可用于标记富集磷酸化丝氨酸和磷酸化苏氨酸。

从20世纪80年代起，人们开始研究蛋白质磷酸化的非放射性分析方法。Meyer等[21]用ABI470气相蛋白质顺序仪固相法非放射分析磷酸化酪氨酸，并采用毛细管电泳鉴定从顺序仪上收集得到的流出液中的磷酸化酪氨酸PTH衍生物。车发云等[22]进一步建立了运用毛细管电泳分析非放射性标记蛋白质或多肽中的各种O－磷酸化氨基酸的方法，在低（pmol）范围同时分析所有3种PTH－磷酸化氨基酸，进而分析蛋白质或多肽中磷酸化氨基酸残基，用3个模型对磷酸化肽及天然的磷酸化蛋白β－酪蛋白和卵黄高磷蛋白的磷酸化位点进行了分析，还以七肽（LR-

235

磷酸化肽段，进行埃德曼降解测序；或使用荧光标记磷酸肽，然后通过磷酸化残基特定的滞留时间、荧光标记或放射性标记的氨基酸的释放最终定位磷酸化位点释放的氨基酸进行鉴定。尽管目前二维肽谱与埃德曼降解仍然用于磷酸化位点分析，但大规模应用时工作量显然太大。质谱技术用于磷酸化蛋白分析是一个革命性突破。质谱技术主要基于2个原理：一是与非磷酸基团修饰的肽段相比，单磷酸基团修饰的肽段在相对分子质量上增加了79．983；二是磷酸肽还将产生一个可用于诊断的片段离子，而非磷酸化修饰的肽则没有这种现象。在实际应用中，磷酸化蛋白的质谱分析常常会遇到很大的麻烦，因为与非磷酸化形式相比，磷酸肽所占比例很低，而且由于许多影响因素不是很清楚，等摩尔混合的肽段可能会产生不同强度的信号，有时甚至检测不到，因而所获得的肽谱是不完全的。因为磷酸肽更难离子化，而且非修饰肽段还可能抑制磷酸肽的信号，因此在应用质谱鉴定磷酸肽之前，首先应对磷酸肽进行富集，并通过HPLC初步分离肽段，这可在一定程度上提高分析的成功率。应该注意的是，磷酸基团会抑制胰酶对相邻肽键的裂解反应，使得到的肽段对蛋白质的覆盖效率很差。当质谱分析不能提供足够数据时，埃德曼降解法仍然是一个很好的补充工具。

4．2MALDI－TOFMS对完整的磷酸肽离子的分析

MALDI－TOFMS常被用于分析完整的肽谱及对蛋白质进行

鉴定[3]。因此，如果是一个已知蛋白或通过肽谱匹配得到鉴定的蛋白，那么通过检测所得肽谱与理论肽谱中是否发生79．983的相对分子质量迁移就可以很简单地鉴定磷酸肽。此外，通过碱性磷酸酶处理样品，可使磷酸化的质量迁移的肽段迁回至理论预测位置，有助于确定磷酸化的肽段。如果该肽段只含有一个可能的磷酸化位点，而且含有某种激酶相应的靶位点或已对磷酸化残基的化学修饰进行过鉴定，就可能准确地鉴定出磷酸化修饰的位点。

RASLG，肯普肽，Kemptide）为蛋白激酶A的底物模型[23]，研究硫

代磷酸化和荧光标记反应条件及标记产物的性质，用荧光标记分析蛋白质磷酸化和蛋白激酶的专一性。杨琴等[24]利用免疫荧光标记技术对磷酸化组蛋白H3在乳腺癌细胞中的分布进行了研究。近年来发展了一些可以对一向或二向分离的凝胶、膜或层析组分中的所有磷酸化蛋白染色的技术。Schulenberg等[25]报道，荧光染料Pro－QDiamonddye可对磷酸化蛋白质特异性染色。

4．3片段离子分析

在磷酸化蛋白质组学研究中，磷酸肽会产生特异的离子片

段，如H2PO4－、PO3－、PO2－等，相对分子质量分别为97、79和63。因此，质谱中这些离子的出现表明样品中含有磷酸肽。此外，多肽骨架片段化技术可能使肽链序列重构，如果序列中包含磷酸化残基，则可以对其进行明确定位[29]。

电喷雾离子源在负电模式下激发带有负电的磷酸基团，进行串联质谱分析可以得到特异的磷酸化片段离子。碰撞诱导解离（CID）用于产生片段离子，所得到的片段离子再通过三联四极杆或更灵敏的四极杆－四极杆－飞行时间质谱进行分析（也可以用离子肼），从而鉴定磷酸肽[30]。片段离子分析技术可以与HPLC相结合，既可以是单独的反相液相色谱，也可以再连接其他的分离基质进行二维分离，如强阳离子交换树脂，这是目前鉴定蛋白质修饰惟一的高通量手段，如果与IMAC磷酸肽富集程序相结合，则可以简化分析物并减轻离子抑制效应。CID谱的解释是一个复杂的过程，通过对应于一套相互重叠的肽的片段离子的鉴定从而构建出其完整序列，计算组成性离子之间的相对分子质量差别，并将该差别与标准的氨基酸相对分子质量进行比较。

Martin等[26]利用Pro－QDiamonddye检验芯片上的蛋白质及多

肽的磷酸化水平，灵敏度可达到312～625fg，将芯片与高灵敏度检出方法结合提供了一个强有力的研究信号通路及磷酸酶抑制物的平台。商品化的Pro－QDiamond染色，可以与常用的SYPRO染色剂结合使用。此外，抗磷酸化酪氨酸抗体的Western印迹检测及荧光素对磷酸基团进行化学修饰标记等技术，也被用于对磷酸化蛋白的检测中，尽管抗磷酸化丝氨酸和苏氨酸的抗体在用于免疫共沉淀时亲和度不足，但通过免疫杂交分析检测固定于膜上的相应磷酸化蛋白还是绰绰有余的。Seisuke等[27]利用磷酸化蛋白富集试剂盒富集磷酸化蛋白后，用荧光双向差异凝胶电泳（2D－DIGE）技术进行差异分析，大大提高了对磷酸化蛋白的检测力。

4

4．1

磷酸化蛋白的鉴定及其磷酸化位点的预测

埃德曼降解与质谱

在20世纪90年代，磷酸化位点分析的标准途径是用32P标

Ficarro等[3]用胰酶消化酵母蛋白裂解物，将肽转变成甲基酯并通

过IMAC富集磷酸化肽，然后与纳升级HPLC连用，将片段离子直接进行电喷雾质谱分析，鉴定了1000多个磷酸肽，得到了

记纯化的磷酸化蛋白，通过一向的薄层电泳和二维的薄层层析（被称为二维肽谱）对所得到的肽段进行分离，放射自显影检测

216个肽段序列，并鉴定了383个磷酸化位点。

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表1已用各种激酶确定的磷酸化序列基序[28]

序列模体

酶

骨形态发生蛋白受体激酶蛋白激酶B蛋白激酶C

cGMP－依赖型激酶c－Myb激酶磷酸转移酶

细胞周期蛋白依赖型激酶神经酰胺活化的蛋白激酶

cAMP－依赖型蛋白的丝氨酸激酶糖原合成酶激酶3

自身磷酸化依赖型蛋白激酶钙调素依赖型蛋白激酶1a酪蛋白激酶

酪蛋白激酶Ⅱ

脯氨酸指导的蛋白激酶组蛋白H1激酶丝氨酸激酶

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蛋白质（底物）

Ser／Thr磷酸化Ser-Ser-Xaa-Ser(P)

Arg-Xaa-Arg-Yaa-Zaa-Ser(P)/Thr(P)-HydSer(P)-Xaa-His

Ser(P)-Leu-Gln-Xaa-AlaGlu-Val-Glu-Ser(P)Arg-Xaa-Xaa-Ser(P)Ser/Thr(P)-Pro-Xaa,Pro-Xaa-Thr(P)-Pro-XaaThr(p)-leu-ProArg-Xaa-Ser(P)

Ser-Xaa-Xaa-Xaa-Ser(P)

Arg-Xaa-(Xaa)-Ser(P)/Thr(P)-Xaa-Ser/Thr

Hyd-Xaa-Arg-Xaa-Xaa-Ser(P)/Thr(P)-Xaa-Xaa-Xaa-HydSer-Xaa-Glu-Ser(P)

Ser-Xaa-Xaa-Glu-Ser(P)Xaa-Ser(P)/Thr(P)-Pro-Xaa

Ser-Pro-Arg-Lys-Ser(P)-Pro-Arg-LysSer(P)-Pro-Lys/Arg-Lys/ArgLys-Ser(P)-Pro

Tyr磷酸化

Tyr(P)-Met-Asn-Met，Tyr(P)-Xaa-Xaa-MetTyr(P)-Met-Xaa-MetAsn-Pro-Xaa-Tyr(P)Tyr(P)-Xaa-Xaa-LeuGlu-Asp-Ala-Ile-Tyr(P)Thr和Tyr双磷酸化Thr(P)-Xaa-Tyr(P)

TGF－β家族调节因子Smad1蛋白

合成肽

Na，K－ATP酶

慢病毒属Vif蛋白脊椎动物c－Myb蛋白

血清反应因子，c－Fos，Nur77及40S核糖体蛋白S6细胞周期蛋白A或E

Raf蛋白

PⅡ蛋白（glnB基因产物）cAMP反应元件结合蛋白

髓鞘碱性蛋白多肽相似体牛骨桥蛋白，

源于鲨鱼、羊、鼠、牛和人的维生素K依赖型基质Gla蛋白牛骨桥蛋白Tau蛋白

海胆，精子特异性组蛋白H1和H2B鼠神经丝蛋白

磷脂酰肌醇－3－激酶，在细胞质尾部CD28T细胞共刺激受体粘着斑激酶，在细胞质结构域内蛋白酪氨酸激酶，在细胞质尾部蛋白酪氨酸激酶

细胞分裂素－激活的蛋白酶激酶

整合蛋白β3

肥大细胞功能相关抗原合成肽

P38细胞分裂素－激活的蛋白激酶

用于蛋白质测序的片段离子需要通过阳离子模式制备，在测序之前须进一步纯化并用合适的阴离子缓冲体系重新溶解。采用PSI扫描技术可以很容易地检测在磷酸化酪氨酸两侧多肽骨架的切割所产生的特异的相对分子质量为216．043的NH4＋片段，尽管该法无法用于对其他磷酸化残基的分析，但可以在阳离子模式下运行，这意味着它可以与其他策略相结合来鉴定磷酸化位点[31]。

尽管ESI－MS／MS是最广泛应用的磷酸化蛋白分析方法，但一些研究者也在MALDI－TOF中使用源后衰变来获取含磷酸基的离子和磷酸肽片段。可应用电子捕获解离（ECD），在傅立叶变换回旋共振质谱（FT－ICRMS）中通过用亚热电子轰击离子流来获取含磷酸基的离子和磷酸肽片段，FT－ICRMS是迄今准确度最高的质谱分析，可得到1～2ppm或更好的分辨率，适于磷酸化位点的分析。ECD技术可以轻松打开二硫键，而易断的翻译后修饰的共价键却可以在ECD破碎肽链时保存下来，因而适于翻译后修饰的研究，所得到的离子谱系比CID的更容易解释，对小的蛋白来说甚至可以不通过蛋白消化便确定其磷酸化位点[32－33]。

白质发生磷酸化，从而导致细胞内蛋白质的组成和数量发生变化，最终使生物体的生理状态发生改变。因此，当细胞中的蛋白激酶或磷酸酶的活性受到抑制或过表达时，蛋白质磷酸化过程就会紊乱，从而导致细胞周期调控异常。蛋白质磷酸化的分子机制对于癌症等重大疾病的研究具有相当的指导意义，已成为生物学研究领域中的热点。

随着蛋白质组学技术的不断发展，蛋白质组学研究已经进入定量分析及功能蛋白质组阶段，磷酸化修饰成为众多学者关注的重点。现有的磷酸化修饰研究技术只能发现或分析那些结

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Nat

5蛋白质磷酸化的研究趋势

蛋白质的磷酸化和去磷酸化过程调节着细胞信号转导、细

胞分化和细胞生长等几乎所有的生命活动过程，因此被生动形象地描述为细胞生理活动的分子开关。蛋白质在蛋白激酶作用下发生磷酸化，在磷酸酶的作用下去磷酸化。不同的蛋白激酶可识别和修饰不同蛋白质的不同位点，扩大了磷酸化蛋白质研究的复杂性，使磷酸化蛋白质成为蛋白质翻译后修饰研究的热点。大量实验已经表明，生物生长环境的改变可诱导生物体内的蛋

姜铮等：蛋白质磷酸化修饰的研究进展

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doi:10．3969／j．issn．1009－0002．2009．02．025

综述

蛋白质磷酸化修饰的研究进展

姜铮，王芳，何湘，刘大伟，陈宣男，赵红庆，黄留玉，袁静

中国人民解放军疾病预防控制研究所，北京100071［摘要］

蛋白质磷酸化是最常见、最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式，它参与和调控生物体内的许多生命活动。通过蛋

白质的磷酸化与去磷酸化，调控信号转导、基因表达、细胞周期等诸多细胞过程。随着蛋白质组学技术的发展和应用，蛋白质磷酸化的研究越来越受到广泛的重视。我们介绍了蛋白质磷酸化修饰的主要类型与功能、磷酸化蛋白质分析样品的富集及制备、磷酸化蛋白的鉴定及磷酸化位点的预测、蛋白分离后磷酸化蛋白的检测，及蛋白质磷酸化的分子机制，并综述了近年来国内外的主要相关研究进展。［关键词］

磷酸化修饰；磷酸化蛋白鉴定；磷酸化位点检测

［中图分类号］

Q52［文献标识码］A［文章编号］1009－0002(2009)02－0233－05

ProgressonProtein／PeptidePhosphorylation

JIANGZheng,WANGFang,HEXiang,LIUDa－Wei,

CHENXuan－Nan,ZHAOHong－Qing,HUANGLiu－Yu,YUANJing

InstituteofDiseaseControlandPrevention,AcademyofMilitaryMedicalSciences,100071Beijing,China

［Abstract］

Phosphorylationisoneofthemostimportantpost－translationalmodificationsofproteins,whichisrelatedto

manyactivitiesoflife．Byreversibleproteinphosphorylationeukaryotescontrolmanycellularprocessesincludingsignal

Thisarticlehasintroducedthemaintypesandfunctionsofthe

theidentificationofthe

transduction,geneexpression,andthecellcycleetc．Asthedevelopmentandapplicationoftheproteomics,thestudiesoftheproteinphosphorylationhavebecomemoreimportant．proteinphosphorylation,

theenrichmentandpreparationofphosphoproteinsandphosphopeptides,

phosphopeptides,thedeterminationandpredictionofthespecific－phosphorylation－site,thephosphorelatedmodificationsoftheproteins,andtheprogressonstudiesaboveaswell．

［Keywords］

phosphorelatedmodifications;identificationofthephosphopeptides;determinationofthespecific－phosphory-

lation－site

几乎所有的蛋白质在合成过程中或合成后都要经过某些形式的翻译后修饰，一些不合适的修饰常常与疾病相关，某些特定的翻译后修饰还被作为疾病的生物标志或治疗的靶标。

磷酸化是一种广泛的翻译后修饰，同时也是原核和真核生物中最重要的调控修饰形式[1－2]，由于蛋白质氨基酸侧链加入了一个带有强负电的磷酸基团，发生酯化作用，从而改变了蛋白质的构型、活性及与其他分子相互作用的能力，在许多生物学过程，如信号传导、基因表达、细胞分裂等的调控中起着重要作用，异常的蛋白质磷酸化通常与癌症有关。在真核生物中，磷酸化主要发生于丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸等残基；而在细菌中，蛋白质主要通过天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸等残基被磷酸化；有些蛋白质在原核生物和真核生物中均可被磷酸化，它们的磷酸化位点通常是精氨酸、赖氨酸和半胱氨酸残基。编码蛋白激酶和磷酸酶的基因约占真核生物基因组的2％～4％（酵母基因组中约有120个激酶基因和40个磷酸酶基因，人类基因组中约有500个激酶基因和100个磷酸酶基因）。人类蛋白质组中含有10万多个潜在的磷酸化位点，大多数磷酸化蛋白含有一个以上的磷酸化位点，并且以不同磷酸化形式的混合物存在，在胞内活性调控中发挥着重要的作用。此外，磷酸化蛋白质是各种磷酸化形式的复合

［收稿日期］2008－08－30

［基金项目］国家高技术研究发展计划（2007AA02Z118）；

国家自然科学基金（30771809）

［作者简介］姜铮（1980－），男，硕士研究生

［通信作者］袁静，（E－mail）yuanjing6216＠sohu．com

物，而且是动态变化的，所以对磷酸化蛋白质组的定量研究也非常重要。随着磷酸化蛋白质富集手段的发展及用于分析磷酸肽的质谱技术的提高，对磷酸化蛋白质的分析进展迅速。

对磷酸化蛋白质组（细胞内所有磷酸化蛋白质的统称）所涉及的磷酸化蛋白种类、磷酸化位点，以及不同条件下各种磷酸化形式的丰度组成的系统研究是目前的热点。

1蛋白质磷酸化的主要类型与功能

根据磷酸氨基酸残基的不同，可将磷酸化蛋白质分为4类，

即O－磷酸盐、N－磷酸盐、酰基磷酸盐和S－磷酸盐。O－磷酸盐是通过羟基氨基酸的磷酸化形成的，如丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸、羟脯氨酸或羟赖氨酸磷酸化；N－磷酸盐是通过精氨酸、赖氨酸或组氨酸的磷酸化形成的；酰基磷酸盐是通过天冬氨酸或谷氨酸

234

的磷酸化形成的；而S－磷酸盐则通过半胱氨酸磷酸化形成。

蛋白质磷酸化具有以下功能：①磷酸化参与酶作用机制，在此过程磷酸化为反应中间产物（多为S－或N－磷酸盐），如在磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶依赖的磷酸转移酶系统（PTR）中的组氨酸蛋白激酶（HPr）；②磷酸化介导蛋白活性，蛋白分子通过蛋白激酶发生磷酸化，如蛋白激酶A（丝氨酸和苏氨酸残基）或不同的受体酪氨酸激酶（酪氨酸残基）；③天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸的磷酸化在细菌趋化反应的感觉性传导中发生解离。

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进行。第一种方法是在强碱性环境中加入硫基乙醇，替换丝氨酸和苏氨酸残基上的磷酸基团，使巯基暴露并与生物素亲和标签相结合，然后通过链霉素包被的磁珠将磷酸化蛋白或磷酸肽从复合体中分离出来。胱氨酸和甲硫氨酸也可以这种方法进行衍生，在反应之前须用蚁酸处理将其氧化。巯基乙醇处理时最大的缺点是它不能与磷酸化的酪氨酸反应，而且O－糖基化的丝氨酸和苏氨酸残基也会被这种方法衍生，因此需要进一步的实验来确认蛋白是否真的被磷酸化。第二种方法是通过碳二酰乙胺浓缩反应将胱胺加到磷酸基团上，再通过碘乙酰磁珠对磷酸化蛋白或磷酸肽进行亲和分离。

在以上这些基于层析技术的方法中，层析柱填料的性质是影响富集效果的关键因素。2004年，Pinkse等[13]利用TiO2填料自制层析柱，将自磷酸化蛋白PKG酶切产物分离后进行在线ESI－

2磷酸化蛋白质分析样品的富集及制备

通常在检测和鉴定磷酸化蛋白、定位磷酸化修饰位点，并定

量分析不同条件下的磷酸化情况时，由于很多样品是磷酸化和非磷酸化蛋白质的混合物，磷酸化肽段丰度很低，在质谱鉴定时易被其他肽段掩盖，所以常常需要对磷酸化蛋白质或肽段富集后再进行鉴定。

富集磷酸化蛋白质、肽段的经典方法有金属离子亲和层析（IMAC）[3]、生物素亲和素富集[4]、免疫沉淀[5]和磷酸化抗体亲和层析[6]等。利用抗体与磷酸化蛋白特异结合是最简单的富集方法，高亲和性抗体可以从复杂混合物中免疫沉淀特定的蛋白。酪氨酸磷酸化蛋白质的单克隆抗体是已知较好的检测抗体，可通过免疫共沉淀分离纯化酪氨酸磷酸化的蛋白质[7]。Tilley等[8]利用磷酸化酪氨酸抗体对小麦的高分子量谷蛋白进行了Western印迹分析，发现了酪氨酸磷酸化的高分子量谷蛋白亚基。Pandey等[5]利用特异性抗磷酸化酪氨酸抗体研究表皮生长因子（EGF）的信号途径，发现该途径正是靠酪氨酸的磷酸化调节的。EGF受体的寡聚体在EGF刺激下，通过其他亚单位的酪氨酸激酶的活性（自体磷酸化）诱导了一个潜在的激酶的活性，使寡聚体受体亚单位磷酸化。SRC同源体2结构域（SH2）或磷酸化酪氨酸相互作用结构域（PID）的蛋白被受体激活，特异性结合磷酸化酪氨酸的残基，并被磷酸化。他们进一步采用2种抗体的混合物分别免疫沉淀HeLa细胞中受EGF刺激和未受EGF刺激的含有磷酸化酪氨酸的蛋白，鉴定到9个酪氨酸磷酸化的蛋白对EGF有特异性应答，其中7个是已知的EGF途径中的蛋白，另外2个蛋白VAV2和STAM2是未知的。2002年，磷酸化酪氨酸特异的片段离子扫描技术被用于研究EGF途径，鉴定到10个组分，新发现了位于蛋白SHIP－2、Hrs、Cbl、STAM和STAM2的5个磷酸化位点[9]。此外，其他磷酸化残基如丝氨酸和苏氨酸的抗体也有相应的商品。

MS／MS分析，鉴定出PKG至少有8个磷酸化位点，并发现了Ser26和Ser44等2个新的磷酸化位点。他们认为TiO2填料可与磷

酸化肽段高效、特异地结合，可以有效富集磷酸化肽段。Larsen等

[14]

比较了反相树脂与石墨填料柱对磷酸化肽段的分离效果，认为

后者可有效滞留磷酸化肽段，更适合磷酸化肽段的富集、分离和鉴定。Steven等[15]发现在pH2．7左右大部分胰蛋白酶酶切肽段带有2个正电荷,而肽段上有一个磷酸化修饰时则带有1个正电荷，可利用强阳离子交换色谱将其富集，并在HeLa细胞核中鉴定出967个蛋白中的2002个磷酸化位点，得到了迄今最大的磷酸化蛋白谱。

3蛋白分离后磷酸化蛋白的检测

可以通过对磷酸化蛋白的选择性染色或标记检测胶中、膜

上及层析柱洗脱组分中的磷酸化蛋白质组。胶／膜的染色灵敏度较低，只能检测丰度很高的磷酸化蛋白，但有助于鉴定不同的磷酸化修饰形式（这些不同修饰形式的磷酸化蛋白在凝胶中的迁移形式会略有差别，如形成链状的点等），还可用于检测不同样品之间某些蛋白质是否发生了磷酸化，以及磷酸化程度明显不同的蛋白。

用32P选择性标记磷酸化蛋白是一种经典的技术，可以通过纯化激酶及［γ－32P］进行体外标记，或利用［γ－32P］－ATP或32PO43－（正磷酸盐）平衡胞内的ATP水平进行体内标记，然后通过SDS－

PAGE、2D－GE或薄层层析对蛋白质进行分离，再经放射自显影

或光学成像检测标记的磷酸化蛋白，单个蛋白点可以从胶上或膜上剪切出来，也可以从色谱柱中洗脱时收集放射性标记的蛋白质组分。体外检测到的磷酸化蛋白是否具有生物学意义，必须对它在体内的磷酸化情况进行验证，因为在体外情况下激酶可能会与许多在生理条件下因处于不同的细胞或亚细胞结构而根本无法接触到的蛋白质发生作用，从而得出假阳性结论；蛋白质被［γ－32P］－ATP放射性标记，通常在消化后通过凝胶电泳或薄层层析分离，可以鉴定磷酸化酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸。而体内磷酸化标记研究也取决于机体本身磷酸化的效率及靶蛋白磷酸化与非磷酸化形态之间的平衡关系。如果某一蛋白已经被磷酸基团所饱和，那么不论激酶的活性如何也不会有放射性标记的磷酸基团插入，因此也检测不到磷酸化蛋白；对于经体内32PO43－标记的蛋白质，需要通过双向电泳进行高分辨率的分离。如果蛋白或磷酸化的氨基酸残基可以通过荧光试剂衍生，那么就可以通

Gronborg等[10]用6种不同的检测丝氨酸和苏氨酸磷酸化蛋白质

的抗体对细胞总蛋白质进行免疫沉淀，其中3种抗体可对丝氨酸和苏氨酸发生磷酸化的蛋白质进行免疫沉淀，共鉴定出7个与丝氨酸和苏氨酸发生磷酸化的蛋白质。直接作用于磷酸化丝氨酸或磷酸化苏氨酸的抗体也能用于Western印迹分析，但由于在免疫共沉淀时抗体特异性不高，因而未得到广泛应用。

另一种磷酸肽的富集方法是金属离子亲和层析法[3]。磷酸基团与固相化的金属离子有高亲和力，可被选择性地吸附在上面，富集微量磷酸肽样品[11－12]，可以进行IMAC纯化的磷酸肽的离线分析与在线的电喷雾质谱分析。由于IMAC柱会与其他带负电的氨基酸如天冬氨酸和谷氨酸等相结合，层析之前应对蛋白样品中所有的羧酸基团进行甲酯化修饰。

亲和纯化磷酸肽时需要的起始材料较多，常采用2种方法

姜铮等：蛋白质磷酸化修饰的研究进展

过HPLC结合紫外检测鉴定和定量磷酸化残基。Lees－Miller等[16]利用放射性32P对人体内的2种热激蛋白进行了标记，最终鉴定出保守的丝氨酸磷酸化位点。deCarvalho等[17]在昆虫细胞表达了人单核细胞中的细胞质磷脂酶A2，并采用放射性32P标记法鉴定出磷酸化蛋白及其磷酸化位点。

同位素编码亲和标签（ICAT）[18]作为蛋白水平定量的质量标签，已被进一步扩展用于蛋白质磷酸化研究。目前，应用磷酸同位素标记亲和标签（PhIAT）已建立了2种从复杂混合物中专一分离磷酸化蛋白／肽的方法。Goshe等[19]将肽或蛋白混合物置于碱性硫代二乙醇溶液中，通过β－消除从磷酸化丝氨酸或苏氨酸中去掉H3PO4，形成的双键受到硫代二乙醇的作用，巯基取代磷酸根，生物素与巯基相连，这样标记过的蛋白肽即可用色谱分离。Zhou等[20]用另外一种方法修饰磷酸化肽，用碳二亚胺浓缩反应将半胱氨酸加在磷酸盐部分，修饰过的肽段以共价键与碘乙酰胺树脂结合，酸洗涤释放。此方法既可用于标记富集磷酸化酪氨酸，也可用于标记富集磷酸化丝氨酸和磷酸化苏氨酸。

从20世纪80年代起，人们开始研究蛋白质磷酸化的非放射性分析方法。Meyer等[21]用ABI470气相蛋白质顺序仪固相法非放射分析磷酸化酪氨酸，并采用毛细管电泳鉴定从顺序仪上收集得到的流出液中的磷酸化酪氨酸PTH衍生物。车发云等[22]进一步建立了运用毛细管电泳分析非放射性标记蛋白质或多肽中的各种O－磷酸化氨基酸的方法，在低（pmol）范围同时分析所有3种PTH－磷酸化氨基酸，进而分析蛋白质或多肽中磷酸化氨基酸残基，用3个模型对磷酸化肽及天然的磷酸化蛋白β－酪蛋白和卵黄高磷蛋白的磷酸化位点进行了分析，还以七肽（LR-

235

磷酸化肽段，进行埃德曼降解测序；或使用荧光标记磷酸肽，然后通过磷酸化残基特定的滞留时间、荧光标记或放射性标记的氨基酸的释放最终定位磷酸化位点释放的氨基酸进行鉴定。尽管目前二维肽谱与埃德曼降解仍然用于磷酸化位点分析，但大规模应用时工作量显然太大。质谱技术用于磷酸化蛋白分析是一个革命性突破。质谱技术主要基于2个原理：一是与非磷酸基团修饰的肽段相比，单磷酸基团修饰的肽段在相对分子质量上增加了79．983；二是磷酸肽还将产生一个可用于诊断的片段离子，而非磷酸化修饰的肽则没有这种现象。在实际应用中，磷酸化蛋白的质谱分析常常会遇到很大的麻烦，因为与非磷酸化形式相比，磷酸肽所占比例很低，而且由于许多影响因素不是很清楚，等摩尔混合的肽段可能会产生不同强度的信号，有时甚至检测不到，因而所获得的肽谱是不完全的。因为磷酸肽更难离子化，而且非修饰肽段还可能抑制磷酸肽的信号，因此在应用质谱鉴定磷酸肽之前，首先应对磷酸肽进行富集，并通过HPLC初步分离肽段，这可在一定程度上提高分析的成功率。应该注意的是，磷酸基团会抑制胰酶对相邻肽键的裂解反应，使得到的肽段对蛋白质的覆盖效率很差。当质谱分析不能提供足够数据时，埃德曼降解法仍然是一个很好的补充工具。

4．2MALDI－TOFMS对完整的磷酸肽离子的分析

MALDI－TOFMS常被用于分析完整的肽谱及对蛋白质进行

鉴定[3]。因此，如果是一个已知蛋白或通过肽谱匹配得到鉴定的蛋白，那么通过检测所得肽谱与理论肽谱中是否发生79．983的相对分子质量迁移就可以很简单地鉴定磷酸肽。此外，通过碱性磷酸酶处理样品，可使磷酸化的质量迁移的肽段迁回至理论预测位置，有助于确定磷酸化的肽段。如果该肽段只含有一个可能的磷酸化位点，而且含有某种激酶相应的靶位点或已对磷酸化残基的化学修饰进行过鉴定，就可能准确地鉴定出磷酸化修饰的位点。

RASLG，肯普肽，Kemptide）为蛋白激酶A的底物模型[23]，研究硫

代磷酸化和荧光标记反应条件及标记产物的性质，用荧光标记分析蛋白质磷酸化和蛋白激酶的专一性。杨琴等[24]利用免疫荧光标记技术对磷酸化组蛋白H3在乳腺癌细胞中的分布进行了研究。近年来发展了一些可以对一向或二向分离的凝胶、膜或层析组分中的所有磷酸化蛋白染色的技术。Schulenberg等[25]报道，荧光染料Pro－QDiamonddye可对磷酸化蛋白质特异性染色。

4．3片段离子分析

在磷酸化蛋白质组学研究中，磷酸肽会产生特异的离子片

段，如H2PO4－、PO3－、PO2－等，相对分子质量分别为97、79和63。因此，质谱中这些离子的出现表明样品中含有磷酸肽。此外，多肽骨架片段化技术可能使肽链序列重构，如果序列中包含磷酸化残基，则可以对其进行明确定位[29]。

电喷雾离子源在负电模式下激发带有负电的磷酸基团，进行串联质谱分析可以得到特异的磷酸化片段离子。碰撞诱导解离（CID）用于产生片段离子，所得到的片段离子再通过三联四极杆或更灵敏的四极杆－四极杆－飞行时间质谱进行分析（也可以用离子肼），从而鉴定磷酸肽[30]。片段离子分析技术可以与HPLC相结合，既可以是单独的反相液相色谱，也可以再连接其他的分离基质进行二维分离，如强阳离子交换树脂，这是目前鉴定蛋白质修饰惟一的高通量手段，如果与IMAC磷酸肽富集程序相结合，则可以简化分析物并减轻离子抑制效应。CID谱的解释是一个复杂的过程，通过对应于一套相互重叠的肽的片段离子的鉴定从而构建出其完整序列，计算组成性离子之间的相对分子质量差别，并将该差别与标准的氨基酸相对分子质量进行比较。

Martin等[26]利用Pro－QDiamonddye检验芯片上的蛋白质及多

肽的磷酸化水平，灵敏度可达到312～625fg，将芯片与高灵敏度检出方法结合提供了一个强有力的研究信号通路及磷酸酶抑制物的平台。商品化的Pro－QDiamond染色，可以与常用的SYPRO染色剂结合使用。此外，抗磷酸化酪氨酸抗体的Western印迹检测及荧光素对磷酸基团进行化学修饰标记等技术，也被用于对磷酸化蛋白的检测中，尽管抗磷酸化丝氨酸和苏氨酸的抗体在用于免疫共沉淀时亲和度不足，但通过免疫杂交分析检测固定于膜上的相应磷酸化蛋白还是绰绰有余的。Seisuke等[27]利用磷酸化蛋白富集试剂盒富集磷酸化蛋白后，用荧光双向差异凝胶电泳（2D－DIGE）技术进行差异分析，大大提高了对磷酸化蛋白的检测力。

4

4．1

磷酸化蛋白的鉴定及其磷酸化位点的预测

埃德曼降解与质谱

在20世纪90年代，磷酸化位点分析的标准途径是用32P标

Ficarro等[3]用胰酶消化酵母蛋白裂解物，将肽转变成甲基酯并通

过IMAC富集磷酸化肽，然后与纳升级HPLC连用，将片段离子直接进行电喷雾质谱分析，鉴定了1000多个磷酸肽，得到了

记纯化的磷酸化蛋白，通过一向的薄层电泳和二维的薄层层析（被称为二维肽谱）对所得到的肽段进行分离，放射自显影检测

216个肽段序列，并鉴定了383个磷酸化位点。

236

LETTERSINBIOTECHNOLOGY

表1已用各种激酶确定的磷酸化序列基序[28]

序列模体

酶

骨形态发生蛋白受体激酶蛋白激酶B蛋白激酶C

cGMP－依赖型激酶c－Myb激酶磷酸转移酶

细胞周期蛋白依赖型激酶神经酰胺活化的蛋白激酶

cAMP－依赖型蛋白的丝氨酸激酶糖原合成酶激酶3

自身磷酸化依赖型蛋白激酶钙调素依赖型蛋白激酶1a酪蛋白激酶

酪蛋白激酶Ⅱ

脯氨酸指导的蛋白激酶组蛋白H1激酶丝氨酸激酶

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蛋白质（底物）

Ser／Thr磷酸化Ser-Ser-Xaa-Ser(P)

Arg-Xaa-Arg-Yaa-Zaa-Ser(P)/Thr(P)-HydSer(P)-Xaa-His

Ser(P)-Leu-Gln-Xaa-AlaGlu-Val-Glu-Ser(P)Arg-Xaa-Xaa-Ser(P)Ser/Thr(P)-Pro-Xaa,Pro-Xaa-Thr(P)-Pro-XaaThr(p)-leu-ProArg-Xaa-Ser(P)

Ser-Xaa-Xaa-Xaa-Ser(P)

Arg-Xaa-(Xaa)-Ser(P)/Thr(P)-Xaa-Ser/Thr

Hyd-Xaa-Arg-Xaa-Xaa-Ser(P)/Thr(P)-Xaa-Xaa-Xaa-HydSer-Xaa-Glu-Ser(P)

Ser-Xaa-Xaa-Glu-Ser(P)Xaa-Ser(P)/Thr(P)-Pro-Xaa

Ser-Pro-Arg-Lys-Ser(P)-Pro-Arg-LysSer(P)-Pro-Lys/Arg-Lys/ArgLys-Ser(P)-Pro

Tyr磷酸化

Tyr(P)-Met-Asn-Met，Tyr(P)-Xaa-Xaa-MetTyr(P)-Met-Xaa-MetAsn-Pro-Xaa-Tyr(P)Tyr(P)-Xaa-Xaa-LeuGlu-Asp-Ala-Ile-Tyr(P)Thr和Tyr双磷酸化Thr(P)-Xaa-Tyr(P)

TGF－β家族调节因子Smad1蛋白

合成肽

Na，K－ATP酶

慢病毒属Vif蛋白脊椎动物c－Myb蛋白

血清反应因子，c－Fos，Nur77及40S核糖体蛋白S6细胞周期蛋白A或E

Raf蛋白

PⅡ蛋白（glnB基因产物）cAMP反应元件结合蛋白

髓鞘碱性蛋白多肽相似体牛骨桥蛋白，

源于鲨鱼、羊、鼠、牛和人的维生素K依赖型基质Gla蛋白牛骨桥蛋白Tau蛋白

海胆，精子特异性组蛋白H1和H2B鼠神经丝蛋白

磷脂酰肌醇－3－激酶，在细胞质尾部CD28T细胞共刺激受体粘着斑激酶，在细胞质结构域内蛋白酪氨酸激酶，在细胞质尾部蛋白酪氨酸激酶

细胞分裂素－激活的蛋白酶激酶

整合蛋白β3

肥大细胞功能相关抗原合成肽

P38细胞分裂素－激活的蛋白激酶

用于蛋白质测序的片段离子需要通过阳离子模式制备，在测序之前须进一步纯化并用合适的阴离子缓冲体系重新溶解。采用PSI扫描技术可以很容易地检测在磷酸化酪氨酸两侧多肽骨架的切割所产生的特异的相对分子质量为216．043的NH4＋片段，尽管该法无法用于对其他磷酸化残基的分析，但可以在阳离子模式下运行，这意味着它可以与其他策略相结合来鉴定磷酸化位点[31]。

尽管ESI－MS／MS是最广泛应用的磷酸化蛋白分析方法，但一些研究者也在MALDI－TOF中使用源后衰变来获取含磷酸基的离子和磷酸肽片段。可应用电子捕获解离（ECD），在傅立叶变换回旋共振质谱（FT－ICRMS）中通过用亚热电子轰击离子流来获取含磷酸基的离子和磷酸肽片段，FT－ICRMS是迄今准确度最高的质谱分析，可得到1～2ppm或更好的分辨率，适于磷酸化位点的分析。ECD技术可以轻松打开二硫键，而易断的翻译后修饰的共价键却可以在ECD破碎肽链时保存下来，因而适于翻译后修饰的研究，所得到的离子谱系比CID的更容易解释，对小的蛋白来说甚至可以不通过蛋白消化便确定其磷酸化位点[32－33]。

白质发生磷酸化，从而导致细胞内蛋白质的组成和数量发生变化，最终使生物体的生理状态发生改变。因此，当细胞中的蛋白激酶或磷酸酶的活性受到抑制或过表达时，蛋白质磷酸化过程就会紊乱，从而导致细胞周期调控异常。蛋白质磷酸化的分子机制对于癌症等重大疾病的研究具有相当的指导意义，已成为生物学研究领域中的热点。

随着蛋白质组学技术的不断发展，蛋白质组学研究已经进入定量分析及功能蛋白质组阶段，磷酸化修饰成为众多学者关注的重点。现有的磷酸化修饰研究技术只能发现或分析那些结

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5蛋白质磷酸化的研究趋势

蛋白质的磷酸化和去磷酸化过程调节着细胞信号转导、细

胞分化和细胞生长等几乎所有的生命活动过程，因此被生动形象地描述为细胞生理活动的分子开关。蛋白质在蛋白激酶作用下发生磷酸化，在磷酸酶的作用下去磷酸化。不同的蛋白激酶可识别和修饰不同蛋白质的不同位点，扩大了磷酸化蛋白质研究的复杂性，使磷酸化蛋白质成为蛋白质翻译后修饰研究的热点。大量实验已经表明，生物生长环境的改变可诱导生物体内的蛋

姜铮等：蛋白质磷酸化修饰的研究进展

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