实验九 蛋白质浓度的测定(四)──考马斯亮蓝染色法
目的要求
学习考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度的原理和方法。
实验原理
考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。
考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beer’s law）。此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。蛋白质―染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5µL/ml时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为10－100µg蛋白质，微量测定法测定范围是1－10µg蛋白质。此反应重复性好，精确度高，线性关系好。标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。 此方法干扰物少，研究表明：NaCl，KCl，MgCl2，乙醇，（NH4）2SO4无干扰。强碱缓冲液在测定中有一些颜色干扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。Tris，乙酸，2―巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如Triton X―100，SDS，玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。
试剂与器材
一、试剂
考马斯亮蓝试剂：
考马斯亮蓝G―250 100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G―250，4.7%(W/V)乙醇。
二、标准和待测蛋白质溶液 1．标准蛋白质溶液 结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15mol/LNaCl配制成1mg/ml，0.1mg/ml蛋白溶液。
2．未知蛋白质溶液。
三、器材
试管及试管架， 移液管（0.1ml及5ml），UV－2000型分光光度计。
操作方法
一、标准法制定标准曲线
取14支试管，分两组按下表a平行操作。 绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。
二、微量法制定标准曲线
取12支试管，分两组按下表b平行操作。 绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。
三、未知样品蛋白质浓度测定
测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度（mg/ml）。
摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色
摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色注意事项
（1） （1） 如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5－20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。
（2） （2） 测定中，蛋白－染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。
思考题：
根据下列所给的条件和要求，选择一种或几种常用蛋白质定量方法测定蛋白质的浓度：
（1） （1） 样品不易溶解，但要求结果较准确。 （2） （2） 要求在半天内测定60个样品。
（3） 要求很迅速地测定一系列试管（30支）中溶液的蛋白质浓度。
实验三、考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度
目的要求
1、学会蛋白质含量的测定方法。
2、掌握该测定方法的基本原理和优缺点。
原理
考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)测定蛋白浓度，是利用蛋白质一染料结合的原理。考马斯亮蓝G-250存在着两种不同颜色形式，红色和蓝色。此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变成蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm。在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律(Beer’s law)，因此可以通过测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2 min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1 h左右，因此测定过程快速，且不需要严格的时间控制。蛋白质染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5g/mL时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为10-100g蛋白质，微量测定法测定范围是1-10g蛋白质。此反应重复性好，精确度高，线性关系好。标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。
此方法干扰物少，研究表明:NaCl、KCl、MgCl2、乙醇、(NH4)2SO4不干扰测定。强碱性缓冲剂在测定中有一些颜色干扰，可以通过适当的缓冲液对照扣除其影响。Tris、乙酸、-巯基乙醇、蔗糖、甘油、EDTA、微量的去污剂（如Triton X-100，SDS）和玻璃去污剂均有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。
由于该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量测定。
试剂和器材
1试剂
(1)标准蛋白质溶液
1%OD1cm=6.6测定蛋白质结晶牛血清白蛋白，预先经微量凯氏定氮法或按牛血清白蛋白
含量，再用0.15 mol/L NaCl配制成1 mg/mL，0.1 mg/mL蛋白溶液。
(2)考马斯亮蓝试剂
考马斯亮蓝G-250 100 mg溶于50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000 mL，滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G-250，4.7%(W/V)乙醇，8.5%(W/V)磷酸。
2.待测样品
未知蛋白质溶液，要求蛋白浓度范围为0.1-5 mg/mL，若浓度过高时，需用0.15 mol/L NaCl溶液适当稀释。
3．器材
(1)722型分光光度计 (2)微量进样器
(3)移液管(0.1 mL及5 mL) (4)试管及试管架
3．操作方法
1．标准法制作标准曲线
摇匀，1 h内以0号试管为空白对照，在595nm处比色
以OD595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。
2．微量法制作标准曲线
取12支试管，分两组按下表平行操作。
摇匀，1 h内以0号试管为空白对照，在595 nm处比色 以OD595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。 3．未知样品蛋白质浓度的测定
测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内，根据所测定的OD595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL)。
4．注意事项
（1）如果测定要求很严格，可以再试剂加入后的5-20 min内测定光吸收，因为再这段时间内颜色最稳定。
（2）测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，但此复合物的吸附量可以忽略。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。
思考题
1. 请详究考马斯亮蓝与蛋白质的呈色原理。如何进行蛋白质的定量测定。
2. 采用该法测定样品的蛋白质含量时，样品中的什么物质对测定结果有干扰？作为标准蛋
白的牛血清白蛋白在应用时有何要求。
3. 使用分光光度计时，比色皿对所测样品的结果有无影响，该怎样处理？
1. 常规染色脱色方法：
a. 电泳结束后，取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，确保染色液可以充分覆盖凝胶。 b. 置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温染色1小时或更长时间。
注：具体的染色时间取决于凝胶的厚度和染色时的温度。凝胶较厚，温度较低，则染色时间宜适当延长。凝胶较薄，温度较高，
则染色时间可以适当缩短。通常染色至凝胶的颜色和染色液的颜色非常接近，在染色液中几乎看不清凝胶时，可以认为已染色充分。染色2-4个小时或更长时间不会对最终的染色效果产生负面影响。 c. 倒出染色液。染色液可以回收重复使用至少2-3次。
d. 加入适量考马斯亮蓝染色脱色液，确保脱色液可以充分覆盖凝胶。
注：脱色液可以选购碧云天的；如果希望自行配制，推荐的脱色液配方为：40%乙醇，10%乙酸，50％蒸馏水。也可以使用其它适当的脱色液。
e. 置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温脱色4-24小时。期间更换脱色液2-4次，直至蓝色背景基本上全部被脱去，并且蛋白条带染色效果达到预期。通常蛋白条带在脱色1-2小时后即可出现。
注：脱色期间可以在脱色液中加入一片吸水纸，可以使部分染料吸附在吸水纸上，加快脱色。脱色时间过长也会导致蛋白条带的颜色变浅。
f. 完成脱色后，可以把凝胶保存在水中，用于后续的拍照等。保存在水中的凝胶会发生溶涨。如需避免溶涨，可以把胶保存在含20%甘油的水中。长期保存可以制备干胶。
a. 电泳结束后，取胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，微波炉加热至接近沸腾或刚刚沸腾，立即停止加热。
通常对于胶浓度大于10％的胶比较坚韧，在发生煮沸时不易破损；对于胶浓度小于10%的胶，宜尽量避免煮沸，以免出现胶碎裂的情况。
b. 随后在染色液温度较高的情况下，在室温摇床上摇动5-10分钟。 c. 倒出染色液。染色液可以回收重复使用至少2-3次。
d. 加入适量考马斯亮蓝染色脱色液，确保染色液可以充分覆盖凝胶。
注：脱色液可以选购碧云天的；如果希望自行配制，推荐的脱色液配方为：40%乙醇，10%乙酸，50％蒸馏水。也可以使用其它适当的脱色液。
2. 快速染色脱色方法：
e. 微波炉加热至接近沸腾或刚刚沸腾，立即停止加热。
f. 随后在脱色液温度较高的情况下，在摇床上摇动5-10分钟。此时通常可以观察到比较清楚的蛋白条带。 g. 更换新鲜的脱色液，重复步骤e和步骤f，直至蓝色背景基本上全部被脱去，蛋白条带染色效果达到预期。
h. 完成脱色后，可以把凝胶保存在水中，用于后续的拍照等。保存在水中的凝胶会发生溶涨。如需避免溶涨，可以把胶保存在含20%甘油的水中。长期保存可以制备干胶。
常见问题: 1.
常规染色脱色方法和快速染色脱色方法的优缺点？
常规染色脱色方法耗时较长，但检测灵敏度更高，染色效果更加稳定。快速染色脱色方法通常检测灵敏度略低，并且在微波炉加热的过程中有时会出现暴沸导致凝胶碎裂的情况，需特别注意。另外微波炉加热导致的高温会引起染色液和脱色液中的乙酸的挥发，最好能在通风橱中进行。
考马斯亮蓝蛋白胶快速染色液Commassie Blue Fast Staining Solution 包装：
产品简介：
※考马斯亮蓝快速染色液(Commassie Blue Fast Staining Solution)是以考马斯亮蓝
R-250为染料配制而成的染色液，可用于SDS-PAGE或非变性PAGE蛋白电泳胶的快速染色，或Western转膜后PAGE胶上残余蛋白的检测。
※考马斯亮蓝快速染色液采取新配方，超薄胶只需染色10分钟，就可以显示出清晰的蛋白电泳条带；检测到低达10ng的蛋白电泳条带。
※无需对蛋白和凝胶进行固定，无需脱色，操作更加简单。
※本考马斯亮蓝快速染色液是一种无毒，无刺激性气味的高度环保型染色液。普通的常规方法需使用剧毒的甲醇及强刺激性的乙酸，而本公司生产的考马斯亮蓝快速染色液则采取全新配方，实现了无毒和无刺激性气味。
※本染色液和质谱分析兼容，即经过本染色液染色的蛋白条带或蛋白点可以用于后续的质谱分析。
贮存：
室温密封保存
使用说明
1.洗涤 电泳结束后，将凝胶剥离玻璃板，放入烧杯或塑料盒中，加入100ml的蒸馏水。煮沸或微波炉中加热至沸腾，维持1分钟，弃水。
2.染色 倒入适量染色液，煮沸或微波炉中加热至沸腾，维持2分钟；如果胶非常厚，染色的时间需适当延长。
注：在微波炉中适当加热，可以大大加快染色速度。加热时，敞开容器口，容器尽量大些 ，以免出现因暴沸而导致的凝胶碎裂。
3.脱色 到掉染色液（可以回收重复使用），加入适量水，煮沸或微波炉中加热至沸腾，维持2分钟；如果胶非常厚，脱色的时间需适当延长。也可换水3－4次，至背景无色 4.扫描或拍照记录
注意事项：
1.本染色液呈酸性，有轻微腐蚀性，使用时请作必要防护。
2.如果使用微波炉加热，敞开容器口，容器尽量大些，以免出现因暴沸而导致的凝胶碎裂。如果时间不是特别紧急，推荐按照常规方法进行：洗涤3次，每次摇床摇晃5分钟→染色1～2小时→脱色到出现清晰条带。 常见问题：
1. 无染色条带：可能SDS未除尽、染色时间过短或上样量太少，建议电泳时加适当量的BSA等作为阳性对照。
2. 背景太高：可能SDS等杂质没有除尽，建议延长洗涤时间或增加洗涤次数。
5.考马斯亮蓝染色
这种染色方法在单条电泳带中蛋白质最小检出量为0.1μg的蛋白。通常可以根据所需要的敏感度来选择是使用考马斯亮蓝染色或银染色。
⑴ 戴上手套避免将手指印留在电泳凝胶上，将凝胶移入一个小的盛有少量考马斯亮蓝(20ml已经足够)的容器内(小心不要将胶撕破)。或将玻璃板连同凝胶浸在染料中轻轻振荡直至凝胶脱落。
⑵ 对于0.75mm的凝胶，可在摇床上缓慢震荡5分钟~l0分钟，对于1.5mm的凝胶，则需10分钟～20分钟，在染色和脱色过程中要用盖子或封口膜密闭容器口。弃去染液，将凝胶在水中漂洗数次。戴手套以避免将双手染色。
⑶ 加入考马斯亮蓝脱色液(约50ml)，清晰的条带很快会显现出来，大部分凝胶脱色需要1h，使用过的脱色液则可用水冲洗掉。为了脱色完全，需数次更换脱色液并震荡过夜。
实验九 蛋白质浓度的测定(四)──考马斯亮蓝染色法
目的要求
学习考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度的原理和方法。
实验原理
考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。
考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beer’s law）。此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。蛋白质―染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5µL/ml时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为10－100µg蛋白质，微量测定法测定范围是1－10µg蛋白质。此反应重复性好，精确度高，线性关系好。标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。 此方法干扰物少，研究表明：NaCl，KCl，MgCl2，乙醇，（NH4）2SO4无干扰。强碱缓冲液在测定中有一些颜色干扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。Tris，乙酸，2―巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如Triton X―100，SDS，玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。
试剂与器材
一、试剂
考马斯亮蓝试剂：
考马斯亮蓝G―250 100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G―250，4.7%(W/V)乙醇。
二、标准和待测蛋白质溶液 1．标准蛋白质溶液 结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15mol/LNaCl配制成1mg/ml，0.1mg/ml蛋白溶液。
2．未知蛋白质溶液。
三、器材
试管及试管架， 移液管（0.1ml及5ml），UV－2000型分光光度计。
操作方法
一、标准法制定标准曲线
取14支试管，分两组按下表a平行操作。 绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。
二、微量法制定标准曲线
取12支试管，分两组按下表b平行操作。 绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。
三、未知样品蛋白质浓度测定
测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度（mg/ml）。
摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色
摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色注意事项
（1） （1） 如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5－20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。
（2） （2） 测定中，蛋白－染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。
思考题：
根据下列所给的条件和要求，选择一种或几种常用蛋白质定量方法测定蛋白质的浓度：
（1） （1） 样品不易溶解，但要求结果较准确。 （2） （2） 要求在半天内测定60个样品。
（3） 要求很迅速地测定一系列试管（30支）中溶液的蛋白质浓度。
实验三、考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度
目的要求
1、学会蛋白质含量的测定方法。
2、掌握该测定方法的基本原理和优缺点。
原理
考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)测定蛋白浓度，是利用蛋白质一染料结合的原理。考马斯亮蓝G-250存在着两种不同颜色形式，红色和蓝色。此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变成蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm。在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律(Beer’s law)，因此可以通过测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2 min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1 h左右，因此测定过程快速，且不需要严格的时间控制。蛋白质染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5g/mL时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为10-100g蛋白质，微量测定法测定范围是1-10g蛋白质。此反应重复性好，精确度高，线性关系好。标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。
此方法干扰物少，研究表明:NaCl、KCl、MgCl2、乙醇、(NH4)2SO4不干扰测定。强碱性缓冲剂在测定中有一些颜色干扰，可以通过适当的缓冲液对照扣除其影响。Tris、乙酸、-巯基乙醇、蔗糖、甘油、EDTA、微量的去污剂（如Triton X-100，SDS）和玻璃去污剂均有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。
由于该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量测定。
试剂和器材
1试剂
(1)标准蛋白质溶液
1%OD1cm=6.6测定蛋白质结晶牛血清白蛋白，预先经微量凯氏定氮法或按牛血清白蛋白
含量，再用0.15 mol/L NaCl配制成1 mg/mL，0.1 mg/mL蛋白溶液。
(2)考马斯亮蓝试剂
考马斯亮蓝G-250 100 mg溶于50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000 mL，滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G-250，4.7%(W/V)乙醇，8.5%(W/V)磷酸。
2.待测样品
未知蛋白质溶液，要求蛋白浓度范围为0.1-5 mg/mL，若浓度过高时，需用0.15 mol/L NaCl溶液适当稀释。
3．器材
(1)722型分光光度计 (2)微量进样器
(3)移液管(0.1 mL及5 mL) (4)试管及试管架
3．操作方法
1．标准法制作标准曲线
摇匀，1 h内以0号试管为空白对照，在595nm处比色
以OD595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。
2．微量法制作标准曲线
取12支试管，分两组按下表平行操作。
摇匀，1 h内以0号试管为空白对照，在595 nm处比色 以OD595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。 3．未知样品蛋白质浓度的测定
测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内，根据所测定的OD595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL)。
4．注意事项
（1）如果测定要求很严格，可以再试剂加入后的5-20 min内测定光吸收，因为再这段时间内颜色最稳定。
（2）测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，但此复合物的吸附量可以忽略。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。
思考题
1. 请详究考马斯亮蓝与蛋白质的呈色原理。如何进行蛋白质的定量测定。
2. 采用该法测定样品的蛋白质含量时，样品中的什么物质对测定结果有干扰？作为标准蛋
白的牛血清白蛋白在应用时有何要求。
3. 使用分光光度计时，比色皿对所测样品的结果有无影响，该怎样处理？
1. 常规染色脱色方法：
a. 电泳结束后，取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，确保染色液可以充分覆盖凝胶。 b. 置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温染色1小时或更长时间。
注：具体的染色时间取决于凝胶的厚度和染色时的温度。凝胶较厚，温度较低，则染色时间宜适当延长。凝胶较薄，温度较高，
则染色时间可以适当缩短。通常染色至凝胶的颜色和染色液的颜色非常接近，在染色液中几乎看不清凝胶时，可以认为已染色充分。染色2-4个小时或更长时间不会对最终的染色效果产生负面影响。 c. 倒出染色液。染色液可以回收重复使用至少2-3次。
d. 加入适量考马斯亮蓝染色脱色液，确保脱色液可以充分覆盖凝胶。
注：脱色液可以选购碧云天的；如果希望自行配制，推荐的脱色液配方为：40%乙醇，10%乙酸，50％蒸馏水。也可以使用其它适当的脱色液。
e. 置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温脱色4-24小时。期间更换脱色液2-4次，直至蓝色背景基本上全部被脱去，并且蛋白条带染色效果达到预期。通常蛋白条带在脱色1-2小时后即可出现。
注：脱色期间可以在脱色液中加入一片吸水纸，可以使部分染料吸附在吸水纸上，加快脱色。脱色时间过长也会导致蛋白条带的颜色变浅。
f. 完成脱色后，可以把凝胶保存在水中，用于后续的拍照等。保存在水中的凝胶会发生溶涨。如需避免溶涨，可以把胶保存在含20%甘油的水中。长期保存可以制备干胶。
a. 电泳结束后，取胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，微波炉加热至接近沸腾或刚刚沸腾，立即停止加热。
通常对于胶浓度大于10％的胶比较坚韧，在发生煮沸时不易破损；对于胶浓度小于10%的胶，宜尽量避免煮沸，以免出现胶碎裂的情况。
b. 随后在染色液温度较高的情况下，在室温摇床上摇动5-10分钟。 c. 倒出染色液。染色液可以回收重复使用至少2-3次。
d. 加入适量考马斯亮蓝染色脱色液，确保染色液可以充分覆盖凝胶。
注：脱色液可以选购碧云天的；如果希望自行配制，推荐的脱色液配方为：40%乙醇，10%乙酸，50％蒸馏水。也可以使用其它适当的脱色液。
2. 快速染色脱色方法：
e. 微波炉加热至接近沸腾或刚刚沸腾，立即停止加热。
f. 随后在脱色液温度较高的情况下，在摇床上摇动5-10分钟。此时通常可以观察到比较清楚的蛋白条带。 g. 更换新鲜的脱色液，重复步骤e和步骤f，直至蓝色背景基本上全部被脱去，蛋白条带染色效果达到预期。
h. 完成脱色后，可以把凝胶保存在水中，用于后续的拍照等。保存在水中的凝胶会发生溶涨。如需避免溶涨，可以把胶保存在含20%甘油的水中。长期保存可以制备干胶。
常见问题: 1.
常规染色脱色方法和快速染色脱色方法的优缺点？
常规染色脱色方法耗时较长，但检测灵敏度更高，染色效果更加稳定。快速染色脱色方法通常检测灵敏度略低，并且在微波炉加热的过程中有时会出现暴沸导致凝胶碎裂的情况，需特别注意。另外微波炉加热导致的高温会引起染色液和脱色液中的乙酸的挥发，最好能在通风橱中进行。
考马斯亮蓝蛋白胶快速染色液Commassie Blue Fast Staining Solution 包装：
产品简介：
※考马斯亮蓝快速染色液(Commassie Blue Fast Staining Solution)是以考马斯亮蓝
R-250为染料配制而成的染色液，可用于SDS-PAGE或非变性PAGE蛋白电泳胶的快速染色，或Western转膜后PAGE胶上残余蛋白的检测。
※考马斯亮蓝快速染色液采取新配方，超薄胶只需染色10分钟，就可以显示出清晰的蛋白电泳条带；检测到低达10ng的蛋白电泳条带。
※无需对蛋白和凝胶进行固定，无需脱色，操作更加简单。
※本考马斯亮蓝快速染色液是一种无毒，无刺激性气味的高度环保型染色液。普通的常规方法需使用剧毒的甲醇及强刺激性的乙酸，而本公司生产的考马斯亮蓝快速染色液则采取全新配方，实现了无毒和无刺激性气味。
※本染色液和质谱分析兼容，即经过本染色液染色的蛋白条带或蛋白点可以用于后续的质谱分析。
贮存：
室温密封保存
使用说明
1.洗涤 电泳结束后，将凝胶剥离玻璃板，放入烧杯或塑料盒中，加入100ml的蒸馏水。煮沸或微波炉中加热至沸腾，维持1分钟，弃水。
2.染色 倒入适量染色液，煮沸或微波炉中加热至沸腾，维持2分钟；如果胶非常厚，染色的时间需适当延长。
注：在微波炉中适当加热，可以大大加快染色速度。加热时，敞开容器口，容器尽量大些 ，以免出现因暴沸而导致的凝胶碎裂。
3.脱色 到掉染色液（可以回收重复使用），加入适量水，煮沸或微波炉中加热至沸腾，维持2分钟；如果胶非常厚，脱色的时间需适当延长。也可换水3－4次，至背景无色 4.扫描或拍照记录
注意事项：
1.本染色液呈酸性，有轻微腐蚀性，使用时请作必要防护。
2.如果使用微波炉加热，敞开容器口，容器尽量大些，以免出现因暴沸而导致的凝胶碎裂。如果时间不是特别紧急，推荐按照常规方法进行：洗涤3次，每次摇床摇晃5分钟→染色1～2小时→脱色到出现清晰条带。 常见问题：
1. 无染色条带：可能SDS未除尽、染色时间过短或上样量太少，建议电泳时加适当量的BSA等作为阳性对照。
2. 背景太高：可能SDS等杂质没有除尽，建议延长洗涤时间或增加洗涤次数。
5.考马斯亮蓝染色
这种染色方法在单条电泳带中蛋白质最小检出量为0.1μg的蛋白。通常可以根据所需要的敏感度来选择是使用考马斯亮蓝染色或银染色。
⑴ 戴上手套避免将手指印留在电泳凝胶上，将凝胶移入一个小的盛有少量考马斯亮蓝(20ml已经足够)的容器内(小心不要将胶撕破)。或将玻璃板连同凝胶浸在染料中轻轻振荡直至凝胶脱落。
⑵ 对于0.75mm的凝胶，可在摇床上缓慢震荡5分钟~l0分钟，对于1.5mm的凝胶，则需10分钟～20分钟，在染色和脱色过程中要用盖子或封口膜密闭容器口。弃去染液，将凝胶在水中漂洗数次。戴手套以避免将双手染色。
⑶ 加入考马斯亮蓝脱色液(约50ml)，清晰的条带很快会显现出来，大部分凝胶脱色需要1h，使用过的脱色液则可用水冲洗掉。为了脱色完全，需数次更换脱色液并震荡过夜。