代谢物的测定-理论知识部分
一．相关定义与前言
药物进入体内后一般需经历物理变化和化学变化, 物理变化是指药物与生物大分子如血浆蛋白的结合反应；化学变化是指体内代谢反应。
体内代谢反应也称生物转化，分为一相代谢和二相代谢，一相代谢是指药物在体内发生的氧化反应、还原反应、水解反应。二相代谢是指药物在体内的结合反应，包括：葡萄糖醛酸结合、硫酸酯化、甲基化、乙酰基化、氨基酸缀合、谷胱甘肽缀合等。
体内药物及其代谢产物的分析研究将为药浓度、药效和毒性之间的关系，为药物作用机理及药代动力学的研究提供科学的依据，因此近年来的进展令人瞩目， 已成为药物研究的重要分支，并形成了一门新型的学科。
1.1本节有关定义
生物利用度(Bioavailability)：剂型中的药物被吸收进入血液的速率和程度。 生物等效性(Bioequivalence)：一种药物的不同制剂在相同的试验条件下，给以相同的剂量，反映其吸收速率和程度的主要动力学参数没有明显的统计学差异。
二．研究代谢物测定的意义
2. 1测定药物及其代谢物在血液组织及脏器内的分布量，是衡量药物的有效性和安全性的重要指标；
2.2测定药物及其代谢物浓度的经时变化，提供可靠的药代动力学数据；
2.3研究药物的代谢途径，代谢物的药理活性，生成与消除速度，对于合理用药，避免药物的毒性以及寻找新药有一定意义。
2.4有利于生物样品的保存 当生物样品如血液采集之后，血浆酯酶有可能继续水解样品中的酯类药物，其他酶类也可能对样品药物继续产生代谢反应，因此，常需加入酶抑制剂。
2.5有利于分析方法选择 大多数药物的体内代谢反应，只是药物分子结构上某些基团的改变，使代谢物与母体药物的化学结构十分相似，从而导致某些物理性质无较大差异，光谱分析及免疫分析法经常面临代谢物的干扰，欲测定生物样
品中的药物和代谢物含量时，应用色谱法是适当的选择，因其具备分离、分析功能，能避开代谢物的干扰或直接测定代谢物。
2.6有利于选择样品分离、提取的方法 药物经体内代谢后，生成的代谢物一般极性增大，水溶性增强，因此将药物自生物样品中分离、提取时，常利用它们之间极性和离解行为为的差别，选择适当pH 的缓冲液和溶剂系统将其分开。
三．体内代谢物需要被测定的情况
3.1在做药物的1期临床药代动力学试验时，
3.1.1如果已知有活性代谢物（药理和毒理），并且浓度足够高，可以测定 a）研究的是其药代情况，需要测定代谢物
b）仅仅做生物等效性实验，并且原药可以测定时可以不测定代谢产物
3.1.2如果已知有活性代谢物，但是浓度低，不易测定，可以不测定
3.1.3如果代谢产物会影响药物的代谢，分布和排泄时，在研究其药代特征时应该考虑进行代谢产物测定
但是代谢产物是否在人体具有活性很难判断，因为其是否有活性均是由其临床前资料支持的。这时候可以参考05年3月版的《化学药物临床药代动力学研究技术指导原则》和FDA 的《Bioavailability and Bioequivalence Studies for Orally Administered Drug Products - General Considerations》（2003年）
3.2在对生物样品中代谢物浓度的检测时，
3.2.1代谢物能影响药物的安全性和有效性时:
药代动力学研究:同时测定母体药物和代谢物的浓度，
等效性试验:同时测定母体药物和代谢物的浓度, 等效性评价时以母体药物作为主要判断指标。
3.2.2主要代谢物活性不清楚时:
药代动力学研究:测定母体药物和代谢物浓度，
等效性试验:测定母体药物浓度。
3.2.3前药浓度很低, 代谢物为体内主要存在形式时:
药代动力学研究:测定母体药物和代谢物浓度，
等效性评价:测定代谢物的浓度。
3.2.4前体药物:
药代动力学研究:测定母体药物(如果能测到) 和代谢物浓度，
等效性试验:测定代谢物浓度。
四．代谢物测定时常用的生物样本
代谢物测定时常用的生物样本血样（血浆、血清和全血）、尿样、唾液。
常用生物样本的采集与储存：血浆——全血加抗凝剂，离心，取上清液；血清——全血离心，取上清液。采血后必须尽快离心分离出血浆或血清，置－20℃以下冷冻保存。尿样——收集服药后一定时间内尿样，记录体积，混合均匀后取一定量, 测定尿中药物浓度，计算一定时间内尿中药物的累积量。唾液——漱口15分钟后收集口内自然流出或经舌在口内搅动后流出的混合唾液，离心后取上清液。样本采集后不能及时测定，可置4℃冷藏，若放置时间较长，则需-20℃～-80℃冷冻保存。
五. 代谢物测定的方法
代谢产物的测定是药物代谢研究中最经典、同时也是十分有效的方法之一。 由于药物最终会通过与母核相关的一种或多种代谢物排出体外，因此，分离鉴定测定代谢产物可在一定程度上了解药物的代谢途径。近年来，HPLC,GC-MS,LC-MS 及GC-MS-MS,LC-MS-MS,LC-NMR 及LC-MS-NMR 等高速、高效、高灵敏度的分析方法已用于代谢产物的分析和测定。
5.1.HPLC 的方法
由于体液中药物及代谢产物含量极微， 又与大量内源性成分相混杂， 因此， 只有分析方法可靠才能保证分析结果准确。气相色谱- 质谱法（GC-MS ）是分析微量乃至超微量化合物的有力工具，在这一领域中应用颇多。但是许多药物和代谢产物缺乏挥发性和热稳定性， 限制了它的应用。近年来，高效液相色谱法(HPLC)以适用范围广、分离效率高、组分易回收及快速简便为特点，伴以灵敏度高、选择性强的检测器的开发和应用，在诸多的分析方法中后来居上，成为分析体内药物代谢产物的不可缺少的手段之一。
因为体内药物及代谢产物含量甚微，很难收集到足够的样品量测定四大光谱
即红外、紫外、核磁共振和质谱。因此，以HPLC 为工具定未知物就成为需要解决的难题之一。LC-MS 虽然有效，却因仪器价格昂贵不能广泛应用。目前仍常用以经验推断的化合物为对为了去除内源性成分的干扰，保证色谱柱的柱效和寿命， 进行生物样品的前处理是极其重要的。
5.1.1分离
对于选用的不同的生物样品类型进行不同的预处理。如血样（包括血清、血浆）可直接上样进行固相萃取，但若药物与蛋白结合，则会降低萃取回收率，故要去除代谢物中蛋白质，使结合型药物释放出来，以测定总浓度。得到较“干净”的提取液，减少乳化，消除对测定的干扰。而唾液样品则主要采用离心沉淀除去粘蛋白，取上清液测定药物浓度。要测定尿液中的缀合物常需采用酸水解法或酶水解法使缀合物水解。
常用去蛋白质方法：
蛋白质沉淀法——生成不溶性盐或盐析和脱水作用。常用的蛋白质沉淀剂包括有机溶剂（乙腈、甲醇、乙醇及丙酮等）、碳酸铵盐、无机酸（三氯乙酸、高氯酸等）和重金属盐（汞盐、钨酸盐及铜盐等）。由于经有机溶剂或酸处理后的生物样品与反相HPLC 分析相匹配，因此应用最为广泛。
组织酶消化法——蛋白水解酶，如胰蛋白酶、胃蛋白酶等。
近年来，用微孔膜滤除蛋白质的方法已见报道，具有简便快速的优点，但只能测定游离状态的化合物。用酸碱性离子交换树脂去除与碱酸性化合物共存的蛋白质，可同时完成纯化和富集过程, 因此也常被应用。
5.1.2 提取
从生物样品中提取待测物通常有液相提取和固相提取两种，分析超微量化合物时尤为必要。
液相提取亦即溶剂提取，常用的有机溶剂有：正醇、二氯甲烷、氯仿、 乙酸乙酯、乙醚、苯及正己烷等等以及它们的混合溶液。有时为了减少乳化可加入少量的甲醇或乙醇。为了有效地提取酸、碱性药物，通常需要调节样品的p H， 碱药物一般调至高于其pKa 12个单位，酸性药物则调至低于其pKa12个单位， 使药物处于非解离状态而易被提取。 提取高度电离的化合物（如季铵盐或磺酸盐） 以及两性化合物（如氨基酸）时，则须加入离子对试制。酸性化合物一般选用季
铵盐或叔铵盐，碱性化合物则选用烷基或芳基磺酸盐类以形成离子对，提高有机溶剂由于有机溶剂一般有毒易燃， 蒸发去除溶剂可能引起待测物损失以及有时出现乳化现象等，因此，更为简便有效的提取方法成为寻求的目标。
其中固相提取法显示出广阔的前景。经典的固相提取剂有氧化铝、活性炭及硅藻土等。由于氧化铝能选择地吸附邻酚羟基化合物，因此至今仍常使用，通常在弱碱性介质ph8左右）中进行吸附，水洗去杂质后用酸洗脱待测物。 影响液-液提取的因素：有水相pH 值、提取溶剂和离子强度等
1) 水相pH
碱性药物：PH 高于药物的pKa 2～3单位；酸性物质：＜pKa 2～3单位
2) 提取溶剂
提取溶剂的选择既要考虑提取的选择性，同时也要考虑操作是否方便，在满足提取效率的同时选取极性尽可能小的溶剂，使既有合适的回收率，又可将干扰物质降到最低。
一般可根据相似相溶原则进行选择，选择沸点低的溶剂。
当样品中药物性质未知时，可用乙醚、氯仿分别作为酸性和碱性药物的提取溶剂。
3) 离子强度
在水相中加中性盐，如NaCl ，可增加离子强度，使溶液中水分子与无机离子强烈缔合，导致与药物缔合的水分子减少，使药物在水相中溶解度变小，有利于有机溶剂提取。
4）有机相和水相体积 1:1或2:1
影响液-固提取的因素：
分离度和回收率是反映提取效率的重要指标，影响提取率的主要因素是：
1）洗脱液流速——流速太快，分离度下降，样品流失，回收率低，重现性差。
2）样品装载量——有效装载量取决于被测物的容量因子、固定相量和样品浓度。过载，导致样品流失。
根据药物的pKa 值、亲脂性、溶解度、分配系数等选择其预处理及检测方法
A）具有亲脂性的药物在适当的pH 值下用溶剂萃取
B）具有强极性或亲水性的药物选择沉淀蛋白、固相萃取、离子对萃取或衍
生化后萃取的方法等
C）具有挥发性的药物选择GC 测定法
D）具有光谱或电化学特性选择分析检测方法
E ）要根据药物的稳定性选择萃取浓缩技术：对酸碱不稳定避免使用强酸或强碱性溶剂，对热不稳定的药物避免高温蒸发溶剂， 对光不稳定的药物避免见光。
样品处理步骤与分析方法的选择如下图所示
5.2其他测定代谢物的方法
由于药物最终会通过与母核相关的一种或多种代谢物排出体外，因此，分离鉴定代谢产物可在一定程度上了解药物的代谢途径。这时也可用特殊的分析手段如GC-MS ，HPLC-MS ，GC-MS-MS,LC-MS-MS,LC-NMR 及LC-MS-NMR 分析方法，它们具有高速、高效、高灵敏度的特点，并且有着绝对的专一性。并且可在检测出极微量代谢产物的同时鉴定代谢产物的结构。
吸收度比，光电二极管矩阵检测，蒸发光散射检测，或双检测器(紫外、荧
光) 的应用也是一些特殊的方法。在缺乏上述技术时，应仔细比较各色谱峰的峰型和保留时间。
PS: 测定代谢物具体方法分析的文献见队友的文档。
代谢物的测定-理论知识部分
一．相关定义与前言
药物进入体内后一般需经历物理变化和化学变化, 物理变化是指药物与生物大分子如血浆蛋白的结合反应；化学变化是指体内代谢反应。
体内代谢反应也称生物转化，分为一相代谢和二相代谢，一相代谢是指药物在体内发生的氧化反应、还原反应、水解反应。二相代谢是指药物在体内的结合反应，包括：葡萄糖醛酸结合、硫酸酯化、甲基化、乙酰基化、氨基酸缀合、谷胱甘肽缀合等。
体内药物及其代谢产物的分析研究将为药浓度、药效和毒性之间的关系，为药物作用机理及药代动力学的研究提供科学的依据，因此近年来的进展令人瞩目， 已成为药物研究的重要分支，并形成了一门新型的学科。
1.1本节有关定义
生物利用度(Bioavailability)：剂型中的药物被吸收进入血液的速率和程度。 生物等效性(Bioequivalence)：一种药物的不同制剂在相同的试验条件下，给以相同的剂量，反映其吸收速率和程度的主要动力学参数没有明显的统计学差异。
二．研究代谢物测定的意义
2. 1测定药物及其代谢物在血液组织及脏器内的分布量，是衡量药物的有效性和安全性的重要指标；
2.2测定药物及其代谢物浓度的经时变化，提供可靠的药代动力学数据；
2.3研究药物的代谢途径，代谢物的药理活性，生成与消除速度，对于合理用药，避免药物的毒性以及寻找新药有一定意义。
2.4有利于生物样品的保存 当生物样品如血液采集之后，血浆酯酶有可能继续水解样品中的酯类药物，其他酶类也可能对样品药物继续产生代谢反应，因此，常需加入酶抑制剂。
2.5有利于分析方法选择 大多数药物的体内代谢反应，只是药物分子结构上某些基团的改变，使代谢物与母体药物的化学结构十分相似，从而导致某些物理性质无较大差异，光谱分析及免疫分析法经常面临代谢物的干扰，欲测定生物样
品中的药物和代谢物含量时，应用色谱法是适当的选择，因其具备分离、分析功能，能避开代谢物的干扰或直接测定代谢物。
2.6有利于选择样品分离、提取的方法 药物经体内代谢后，生成的代谢物一般极性增大，水溶性增强，因此将药物自生物样品中分离、提取时，常利用它们之间极性和离解行为为的差别，选择适当pH 的缓冲液和溶剂系统将其分开。
三．体内代谢物需要被测定的情况
3.1在做药物的1期临床药代动力学试验时，
3.1.1如果已知有活性代谢物（药理和毒理），并且浓度足够高，可以测定 a）研究的是其药代情况，需要测定代谢物
b）仅仅做生物等效性实验，并且原药可以测定时可以不测定代谢产物
3.1.2如果已知有活性代谢物，但是浓度低，不易测定，可以不测定
3.1.3如果代谢产物会影响药物的代谢，分布和排泄时，在研究其药代特征时应该考虑进行代谢产物测定
但是代谢产物是否在人体具有活性很难判断，因为其是否有活性均是由其临床前资料支持的。这时候可以参考05年3月版的《化学药物临床药代动力学研究技术指导原则》和FDA 的《Bioavailability and Bioequivalence Studies for Orally Administered Drug Products - General Considerations》（2003年）
3.2在对生物样品中代谢物浓度的检测时，
3.2.1代谢物能影响药物的安全性和有效性时:
药代动力学研究:同时测定母体药物和代谢物的浓度，
等效性试验:同时测定母体药物和代谢物的浓度, 等效性评价时以母体药物作为主要判断指标。
3.2.2主要代谢物活性不清楚时:
药代动力学研究:测定母体药物和代谢物浓度，
等效性试验:测定母体药物浓度。
3.2.3前药浓度很低, 代谢物为体内主要存在形式时:
药代动力学研究:测定母体药物和代谢物浓度，
等效性评价:测定代谢物的浓度。
3.2.4前体药物:
药代动力学研究:测定母体药物(如果能测到) 和代谢物浓度，
等效性试验:测定代谢物浓度。
四．代谢物测定时常用的生物样本
代谢物测定时常用的生物样本血样（血浆、血清和全血）、尿样、唾液。
常用生物样本的采集与储存：血浆——全血加抗凝剂，离心，取上清液；血清——全血离心，取上清液。采血后必须尽快离心分离出血浆或血清，置－20℃以下冷冻保存。尿样——收集服药后一定时间内尿样，记录体积，混合均匀后取一定量, 测定尿中药物浓度，计算一定时间内尿中药物的累积量。唾液——漱口15分钟后收集口内自然流出或经舌在口内搅动后流出的混合唾液，离心后取上清液。样本采集后不能及时测定，可置4℃冷藏，若放置时间较长，则需-20℃～-80℃冷冻保存。
五. 代谢物测定的方法
代谢产物的测定是药物代谢研究中最经典、同时也是十分有效的方法之一。 由于药物最终会通过与母核相关的一种或多种代谢物排出体外，因此，分离鉴定测定代谢产物可在一定程度上了解药物的代谢途径。近年来，HPLC,GC-MS,LC-MS 及GC-MS-MS,LC-MS-MS,LC-NMR 及LC-MS-NMR 等高速、高效、高灵敏度的分析方法已用于代谢产物的分析和测定。
5.1.HPLC 的方法
由于体液中药物及代谢产物含量极微， 又与大量内源性成分相混杂， 因此， 只有分析方法可靠才能保证分析结果准确。气相色谱- 质谱法（GC-MS ）是分析微量乃至超微量化合物的有力工具，在这一领域中应用颇多。但是许多药物和代谢产物缺乏挥发性和热稳定性， 限制了它的应用。近年来，高效液相色谱法(HPLC)以适用范围广、分离效率高、组分易回收及快速简便为特点，伴以灵敏度高、选择性强的检测器的开发和应用，在诸多的分析方法中后来居上，成为分析体内药物代谢产物的不可缺少的手段之一。
因为体内药物及代谢产物含量甚微，很难收集到足够的样品量测定四大光谱
即红外、紫外、核磁共振和质谱。因此，以HPLC 为工具定未知物就成为需要解决的难题之一。LC-MS 虽然有效，却因仪器价格昂贵不能广泛应用。目前仍常用以经验推断的化合物为对为了去除内源性成分的干扰，保证色谱柱的柱效和寿命， 进行生物样品的前处理是极其重要的。
5.1.1分离
对于选用的不同的生物样品类型进行不同的预处理。如血样（包括血清、血浆）可直接上样进行固相萃取，但若药物与蛋白结合，则会降低萃取回收率，故要去除代谢物中蛋白质，使结合型药物释放出来，以测定总浓度。得到较“干净”的提取液，减少乳化，消除对测定的干扰。而唾液样品则主要采用离心沉淀除去粘蛋白，取上清液测定药物浓度。要测定尿液中的缀合物常需采用酸水解法或酶水解法使缀合物水解。
常用去蛋白质方法：
蛋白质沉淀法——生成不溶性盐或盐析和脱水作用。常用的蛋白质沉淀剂包括有机溶剂（乙腈、甲醇、乙醇及丙酮等）、碳酸铵盐、无机酸（三氯乙酸、高氯酸等）和重金属盐（汞盐、钨酸盐及铜盐等）。由于经有机溶剂或酸处理后的生物样品与反相HPLC 分析相匹配，因此应用最为广泛。
组织酶消化法——蛋白水解酶，如胰蛋白酶、胃蛋白酶等。
近年来，用微孔膜滤除蛋白质的方法已见报道，具有简便快速的优点，但只能测定游离状态的化合物。用酸碱性离子交换树脂去除与碱酸性化合物共存的蛋白质，可同时完成纯化和富集过程, 因此也常被应用。
5.1.2 提取
从生物样品中提取待测物通常有液相提取和固相提取两种，分析超微量化合物时尤为必要。
液相提取亦即溶剂提取，常用的有机溶剂有：正醇、二氯甲烷、氯仿、 乙酸乙酯、乙醚、苯及正己烷等等以及它们的混合溶液。有时为了减少乳化可加入少量的甲醇或乙醇。为了有效地提取酸、碱性药物，通常需要调节样品的p H， 碱药物一般调至高于其pKa 12个单位，酸性药物则调至低于其pKa12个单位， 使药物处于非解离状态而易被提取。 提取高度电离的化合物（如季铵盐或磺酸盐） 以及两性化合物（如氨基酸）时，则须加入离子对试制。酸性化合物一般选用季
铵盐或叔铵盐，碱性化合物则选用烷基或芳基磺酸盐类以形成离子对，提高有机溶剂由于有机溶剂一般有毒易燃， 蒸发去除溶剂可能引起待测物损失以及有时出现乳化现象等，因此，更为简便有效的提取方法成为寻求的目标。
其中固相提取法显示出广阔的前景。经典的固相提取剂有氧化铝、活性炭及硅藻土等。由于氧化铝能选择地吸附邻酚羟基化合物，因此至今仍常使用，通常在弱碱性介质ph8左右）中进行吸附，水洗去杂质后用酸洗脱待测物。 影响液-液提取的因素：有水相pH 值、提取溶剂和离子强度等
1) 水相pH
碱性药物：PH 高于药物的pKa 2～3单位；酸性物质：＜pKa 2～3单位
2) 提取溶剂
提取溶剂的选择既要考虑提取的选择性，同时也要考虑操作是否方便，在满足提取效率的同时选取极性尽可能小的溶剂，使既有合适的回收率，又可将干扰物质降到最低。
一般可根据相似相溶原则进行选择，选择沸点低的溶剂。
当样品中药物性质未知时，可用乙醚、氯仿分别作为酸性和碱性药物的提取溶剂。
3) 离子强度
在水相中加中性盐，如NaCl ，可增加离子强度，使溶液中水分子与无机离子强烈缔合，导致与药物缔合的水分子减少，使药物在水相中溶解度变小，有利于有机溶剂提取。
4）有机相和水相体积 1:1或2:1
影响液-固提取的因素：
分离度和回收率是反映提取效率的重要指标，影响提取率的主要因素是：
1）洗脱液流速——流速太快，分离度下降，样品流失，回收率低，重现性差。
2）样品装载量——有效装载量取决于被测物的容量因子、固定相量和样品浓度。过载，导致样品流失。
根据药物的pKa 值、亲脂性、溶解度、分配系数等选择其预处理及检测方法
A）具有亲脂性的药物在适当的pH 值下用溶剂萃取
B）具有强极性或亲水性的药物选择沉淀蛋白、固相萃取、离子对萃取或衍
生化后萃取的方法等
C）具有挥发性的药物选择GC 测定法
D）具有光谱或电化学特性选择分析检测方法
E ）要根据药物的稳定性选择萃取浓缩技术：对酸碱不稳定避免使用强酸或强碱性溶剂，对热不稳定的药物避免高温蒸发溶剂， 对光不稳定的药物避免见光。
样品处理步骤与分析方法的选择如下图所示
5.2其他测定代谢物的方法
由于药物最终会通过与母核相关的一种或多种代谢物排出体外，因此，分离鉴定代谢产物可在一定程度上了解药物的代谢途径。这时也可用特殊的分析手段如GC-MS ，HPLC-MS ，GC-MS-MS,LC-MS-MS,LC-NMR 及LC-MS-NMR 分析方法，它们具有高速、高效、高灵敏度的特点，并且有着绝对的专一性。并且可在检测出极微量代谢产物的同时鉴定代谢产物的结构。
吸收度比，光电二极管矩阵检测，蒸发光散射检测，或双检测器(紫外、荧
光) 的应用也是一些特殊的方法。在缺乏上述技术时，应仔细比较各色谱峰的峰型和保留时间。
PS: 测定代谢物具体方法分析的文献见队友的文档。