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热应激蛋白对畜禽抗应激机理的研究进展
肖定福, 张彬, 胡雄贵
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(1. 湖南农业大学动物科学技术学院, 长沙 410128; 2. 湖南省畜牧兽医研究所, 长沙 410131)
摘要:热应激蛋白(hea t shock pro teins , HSP s ) 是机体在应激条件下所产生的一组特异性蛋白质, 能使机体迅速适应环境变化。作者简要介绍了HSP s 的来源及分类, 阐述了HSP 70的基因结构和调控机制, 综述了HSP s 抗应激功能及在畜禽应激反应中的表达, 以期为从分子水平探索HSP s 抗应激机理提供参考。
关键词:热应激蛋白; 热应激因子; 抗应激; 热应激; 表达
中图分类号:Q 958. 12 文献标识码:A 文章编号:1671-7236(2009) 04-0058-04
目前很多学者对动物应激的研究一般以生理生
化指标和激素浓度的变化作为应激指标, 但畜禽生理生化指标、酶和矿物质指标受气候、年龄、品种、营养等客观因素影响很大, 内分泌指标的变化往往是瞬间的, 目前还不能证明是可靠的应激指标。热应激蛋白的变化是衡量动物机体受到应激的一个非常有效的指标, H SPs (heat sho ck pro teins ) 作为应激调控蛋白对阐明动物的应激机理有着非常重要的作用。因此, 要了解抗应激作用本质, 需要从分子水平搞清楚HSP 基因调控机制, 且可从分子水平认识机体在应激环境中的各种变化, 有针对性地保护机体, 为动物生产中的抗应激研究提供更准确的科学依据。1 HSPs 简介
Ritosas (1962) 把25℃培育的果蝇幼虫置于32℃热环境中, 30min 后发现果蝇唾液腺染色体上出现很大的“膨突”, 提示该区域的基因转录增强, 表现为“热激反应”。热应激蛋白又称为热休克蛋白(H SPs ) , 是一切生物细胞在受到热、病原体、理化有害因素等刺激后发生热休克反应, 产生的一类生物进化上高度保守的(Buchmeier 等, 1990) , 由热休克基因编码的蛋白质, 其一级结构在不同种属之间具有很高的同源性(H atayama 等, 1997) 。HSPs 是生物热休克反应的主要标志, 它能使动物迅速适应环境的变化, 保护机体不受或少受损害(李卫晖等,
收稿日期:2008-10-28
作者简介:肖定福(1978-) , 女, 湖南人, 博士生, 主要从事动物
营养生理学研究。
通信作者:张彬(1955-) , 男, 教授, 博士生导师, 主要从事动物
代谢调控与营养生态学研究。T el . 0731-4618088; E -mail :z hb8236@126. com
基金项目:国家自然科学基金(30671516) 和湖南省教育厅一般
。
2002) 。近几年人们对热休克蛋白的编码序列、基因
结构进行了阐明, 并且又发现热激启动因子及转录因子。
一般来说, 根据H SPs 的分子质量、同源性和功能, 可分成6个家族:大分子质量H SPs 家族, H SP90家族, H SP70家族(分子质量在66～78ku ) 、H SP60家族、HSP40家族和小分子质量H SPs 家族。HSP70家族是H SPs 中最保守最重要的一族, 在大多数生物中含量、细胞应激后生成量、家族成员等都是最多的, 该家族中共有20多种蛋白质(Linquist , 1998) 。根据H SPs 的作用和调控方式可把H SPs 分为2大类, 一类称为构成型H SPs , 它们在细胞的正常代谢和生理条件下表达和发挥作用。另一类称为诱导型H SPs , 它们在机体或细胞受到刺激时表达, 使细胞产生耐受性。2 HSP70的基因结构与调控
2. 1 HSP70的基因结构 H SP70家族成员属于诱导型热休克蛋白, 是细胞产生热休克反应必需的内源性启动蛋白。H SP70蛋白家族是一个多基因、多结构、多功能的家族, 有HSC70、HSP70、PBP74、GRP784种主要成员(Hendrick 等, 1993) 。HSP70的结构可分为3部分:N 端(约44ku ) 序列高度保守, 由4个A 螺旋形成一个裂缝, 具有结合和水解ATP 的A TPase 活性, 因此称为A TPase 结构域; C 端18ku 部分, 由4个反相平行的B 折叠和一个A 螺旋构成, 是多肽的结合部位; C 端(约10ku ) , 主要由A 螺旋构成, 是活性调节区域。
2. 2 HSP70的调控机制2. 2. 1 HSP70调控功能区 热休克元件(heat sho ck element , HSE ) 是位于H S P 基因“TA TA ”盒上游区域约含20个核苷酸序列的构件, 是热应激应,
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动子。它由HS Ps 基因5′-转录起始点上游44～46位核苷酸序列上的一段-CTnnGAAnnT TCNAG -序列组成。不同种属生物细胞中均有共同的H RE 碱基序列, 具有高度的保守性, 且均可被热应激诱导产生。HSF 的DNA 结合域决定其与H SE 的结合。2. 2. 2 HSF -H SP 的反式调控 HSP 的调节是诱导启动子基因调节的过程。热休克因子(heat shock facto r , H SF ) 是基本结构蛋白, 应激时通过可逆的过程形成三聚体, 与H SE 结合启动HS P 70基
因的转录(Benjamin 等, 1998) 。HSF 在各种伤害性刺激下, 其主要生物学功能是通过调控H SP 的表达
来实现的。HSF 各种形式虽然大小各有不同, 但其结构都共同具有一个保守的DNA 结合区域(DNA binding do main , DBD ) 和一个三聚区域(trimeriza -tion do main , TD ), 以及存在于N -端和C -端的非保守转录激活功能域(transcription activ ato r domain , AD ) 及调控区域(reg ulatory region , RR ) , 见图1(王凤阳等, 2008)
。
图1 HSF 全长结构图
在正常情况下, H SF 以单体形式与H SP70结合存在, 这3个序列在HSF 内部形成稳定的卷曲螺旋结构, 以维持HSF 无活性的单体状态, DBD 和
TD 具有抑制转录激活功能域发挥作用, 从而抑制H SF 活性的功能; 当细胞受到刺激时, HSF 单体通过三聚体结构域结合形成具有活性的三聚体。在应激条件下, H SF 通过下列途径发挥调控H SP 的作用, 应激时, 增加的变性蛋白竞争性地结合H SP70, 导致HSF 从H SF -H SP70复合体中解离; 解离的H SF 被蛋白激酶C 或其他丝氨酸/苏氨酸激酶磷酸化形成同源三聚体, 暴露出DNA 结合区和N LS (核定位序列) ; 在NLS 介导下, 经一主动转运过程, H SF 三聚体进入细胞核, 通过DNA 结合区结合HS P 基因启动子内的特定区域开启H SP 的转录。HS P 70基因没有内含子存在, 一旦启动转录就可产生出成熟的m RNA , 以适应HSP70大量快速表达的需要, 防止热应激对其m RNA 前体的影响。随着热应激消失, 细胞内出现大量游离的H SP70, 高水平的H SPs 和HSF 结合并抑制HSF 的活性, 从而减少H SF 和HSE 的特异性结合, 控制热休克基因的转录(Welch , 1992) 。
Guettouche 等(2005) 对热激活的HSF1分子磷酸化并聚合形成三聚体过程进行分析时发现, 热应激条件下, H SF1分子的12个丝氨酸(而非苏氨酸、酪氨酸) 发生磷酸化, 其中326位的丝氨酸在其发挥转录活性的过程中扮演着重要的角色。Nobu -hiko 等(2004) 通过对虹鳟鱼H SF1的克隆及功能分析, 结果发现, H SF1a 和H SF1b 会通过形成异源二聚体的方式发挥其对下游靶基因的转录调控功能, DBD 和TD 发挥重要功能的同时, 存在着各自特异的激活功能域和调控区域参与, 通过调控H SP70等下游热应激相关的靶基因的表达, 来发挥其抵抗热应激作用的分子机制。
2. 2. 3 H SP70的翻译调控 热应激时尽管细胞其它蛋白质的m RN A 并未受到破坏, 可以从细胞中分离出来, 并在体外翻译系统中得到表达。但此时除H SP m RNA 以外其它蛋白质的m RNA 均处于非翻译状态下。这主要是因为H SP70m RNA 中有一个较长的富含A 的5′非翻译区, 在热应激条件下由于此段序列富含A 而较难形成二级结构, 因此能够有机会与核糖体结合, 从而保证了H SP m RNA 的选择性翻译。
3 HSPs 的抗应激功能3. 1 分子伴侣作用 H SP70作为主要的分子伴侣蛋白, 其作用是与新生、未折叠、错折叠或变性聚集的蛋白质相结合, 减少产生不溶性聚集物的危险性, 并帮助需要折叠的蛋白质正确折叠, 维持某些肽链的伸展状态, 以利于其跨膜转运; 同时还能促进某些变性蛋白质的降解和清除, 维持酶的动力学特征, 以维护细胞功能(Welch , 1992) 。当蛋白质受损或变性时, HSP70通过促进变性蛋白质的修复性和水解来维持蛋白质的结构, 促进新的蛋白质取代老化蛋白质(Baler 等, 1993) 。H SP90可与甾体激素受体结合作用于核DN A , 避免细胞早熟和无意义反应, 还可激活蛋白激酶C (PKC ) 和蛋白酶活性, 水解A TP , 生成超氧化物歧化酶(SOD ) 等, 从而抵抗理化因素及过氧化物的损伤, 以保持细胞的生物学活性。H SP70可识别非天然和未折叠的前体蛋白, 防,
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过程, 也可防止已松弛的前体蛋白聚集, 但它们对折叠状态的蛋白质却几乎无识别能力。当细胞受到应激原刺激时, 某些蛋白质肽链伸展, 失去原有的盘旋及折叠状态, 空间构型改变, 以致丧失原有功能。3. 2 细胞内保护性 H SPs 在应激条件下参与细胞的抗损伤、修复和热耐受过程, 保护细胞生命活动, 增强对应激的抵抗力并加快细胞或生物体从各种应激中恢复的速度。应激作用前后, 细胞内H SPs 的分布和表达发生显著变化, 这是HS Ps 行使细胞保护作用的体现。多数应激, 由于暴露了蛋白质的隐蔽性而使蛋白质的结构受到损伤, HSP70可结合这些被损伤的蛋白质, 预防它们发生聚集。H SP70不仅可以预防胞浆内蛋白质发生聚集, 而且还可以迁徙到核仁中, 与部分组装的核糖体建立联系, 从而保护细胞核蛋白。Heads (1994) 研究结果表明, 转染HS P 70基因的细胞对热应激有更强的抵抗力。Johnston (1988) 研究结果表明, 抑制H SP70的表达导致细胞对损伤高度敏感。Riabow o l (1988) 研究结果证实, 显微注射抗H SP70的抗体也会增加细胞对应激的敏感性。H SP70能通过调节细胞内某些酶的活性而引起细胞功能的变化。热应激反应产生的HSP70可激活在应激反应中活性受到抑制的Ca -A TPase , 减轻钙越膜损伤, 缓解应激对心肌特别是其线粒体的影响(M estril 等, 1995) 。Gabrief 等(1996) 在对肉鸡热应激的研究中还发现H SP70m RNA 含量受热诱导的增加还具有时间依赖性, 随热诱导时间的延长(1～5h ) 而增加。王枫等(2000) 研究结果发现, H SP70水平高的细胞其热耐力明显高于H SP70水平低的细胞, HSP70水平与细胞的热耐力呈正相关, 还发现当细胞在45℃热暴露达到6h 以上时, 不管是HSP70表达高的细胞还是H SP70表达低的细胞, 其细胞活力均降低。但是H SP70对细胞的保护作用并不是无限的, 不能无限夸大H SP70对细胞的保护作用, 它只能在一定范围内起作用, 主要是因为应激时间过长, 使维持细胞正常生长的蛋白质合成受阻, 威胁细胞的生存; 同时变性蛋白过多的产生超过了H SP70的保护能力, 所以影响了细胞的功能, 引起细胞死亡。
HSP70还参与细胞骨架的形成与修复, 在热应激前注射纯H SP70则可加快中心体的复原。人为2+
复及减少各种创伤所致的组织损伤。因此, 通过测定血液中的H SPs 来判断受损细胞的渗漏程度, 可作为细胞损伤的一个客观指标。
3. 3 减轻过氧化损伤 H SPs 在细胞内具有抗氧化的生物活性, 可抑制产生氧自由基的关键酶即NADPH 氧化酶, 同时增加超氧化物歧化酶活性, 通过反馈作用减少氧自由基的产生, 从而保护细胞免受伤害。H SP70可促使机体内源性抗氧化剂的合成和释放增加, 从而对应激产生较强的抵抗力。Gaubin 等(2000) 研究结果表明, 增加H SP70的表达可以使A549细胞抵抗氧化应激的损伤, 但增加H SP70的表达并没有改变细胞内SOD 、CAT 、GSH -PS 抗氧化酶的mRNA 水平。在缓解热应激中起作用的是诱导型H SP70, 而不是抗氧化酶。Lu 等(1993) 研究牛血管内皮细胞对过氧化应激分子适应, 结果发现HSP70表达的增加能减轻过氧化应激损伤。当机体皮肤表面温度超过35℃时, 动物开始储存热并快速增加蒸发散热机制, 基因表达变化包括激活H SF1; 增加H SP 表达, 并降低其他蛋白的表达和合成; 增加葡萄糖和氨基酸氧化反应, 降低脂肪酸代谢; 内分泌系统激活这些应激反应; 通过HSP 胞外分泌表达激活免疫系统(Collier 等, 2008) 。4 HSPs 在畜禽应激反应中的表达
应激是机体受到刺激所做出的全身性非特异性反应, 机体往往动员其内在力量来克服或消除各种应激对机体所产生的不利影响。鲍恩东等(2001) 在检测长途运输6h 应激猪的骨骼肌HSPs 的表达发现, H SP70和HSP72在肌肉组织中的表达虽然有一定增加, 但统计学分析差异不显著, HSP86和H SP90在骨骼肌中的表达明显下降, 可作为判断应激损伤的指标。杨圣等(2007) 选择H SP70作为评价猪成肌细胞热休克效应的主要标准之一, 通过Western blot 和流式细胞仪来定量检测猪成肌细胞中H SP 的表达证实了热休克预处理能诱发猪成肌细胞内H SP70的过度表达, 并改善细胞自体正常骨骼肌移植后的生存。肉鸡在孵出不久暴露到高温下一段时间, 42日龄再将其暴露到高温下, 结果发现H SP70在肺、心肌出现的量比对照组少, 把42日龄的鸡置于35. 7℃时, 比较体温变化与H SP70在肺组织中表达量变化的关系, 结果显示, 随着体温升高, H SP70的含量也升高(Yahav 等, 1997) 。孙培,
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的H SP70m RNA 水平随持续性高温应激时间的延长逐渐升高。李玉保等(2008) 建立荧光定量RT -PCR 检测猪H SP70和HSP90, 结果发现运输应激猪组织中H SP70m RNA 的转录水平随着运输应激时间(10h 内) 的延长一直呈现出上升的趋势, H SP90m RNA 的转录水平则随着运输应激时间的延长呈下降趋势。A gnew 等(2008) 研究结果表明, 对牛羊用流式细胞术评定白细胞HSP70的表达评估细胞应激反应是一项稳定且可重复的方法, 该方法的应用将作为一个有价值的工具来评估家畜体内细胞应激反应。Wang 等(2008) 在体外培养牛主动脉内皮细胞上研究热应激后H SP70动力学, 结果显示, 热应激后3和12h 出现HSP70表达高峰, 6～16h 观测到H SP70从细胞质渐进移位到细胞核。
参
考
文
献
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氯甲基蛋氨酸对冷冻-束缚应激大鼠消化器官
组织学结构的影响
罗敏意, 程艳芬, 宁章勇, 于博, 潘俊斌
(华南农业大学兽医学院, 广州 510642)
摘要:为探讨氯甲基蛋氨酸对应激性胃溃疡的预防效果, 制备了大鼠急性冷冻-束缚应激模型, 通过观察冷冻-束缚应激所致大鼠消化系统器官的损伤性变化及氯甲基蛋氨酸对应激状态下大鼠消化器官组织结构的影响, 判定氯甲基蛋氨酸对应激性胃溃疡的作用。结果表明, 氯甲基蛋氨酸对大鼠冷冻-束缚应激性胃溃疡的消化系统器官具有明显的保护作用。
关键词:氯甲基蛋氨酸; 冷冻-束缚应激; 大鼠; 组织学
中图分类号:S852. 16+5 文献标识码:A 文章编号:1671-7236(2009) 04-0062-03
应激性溃疡是当前集约化畜牧业中常见的动物应激性疾病, 特别是在饲料成分、环境因素、快速生长等应激原的作用下, 应激性溃疡已经成为危害动
物健康生长的最重要因素之一(董宏伟等, 2007; Dupjan 等, 2008) 。资料表明在集约化养殖环境中的家禽和猪, 应激性溃疡的发生率可高达20%(Si -laniko ve , 2000) 。本研究通过制备稳定成熟的冷冻-束缚应激模型, 观察冷冻-束缚应激所致大鼠消化器官的损伤变化及氯甲基蛋氨酸对应激状态下大鼠消化器官组织结构的影响, 为兽医临床研制新型对抗应激性溃疡的药物提供基础数据。1 材料与方法
1. 1 试验动物和试剂 健康Wistar 大鼠60只, 体重200～220g , 由中山大学实验动物中心提供。氯甲
收稿日期:2008-09-25
作者简介:罗敏意(1983-) , 女, 广东人, 硕士生, 研究方向:兽医
病理学。
通信作者:宁章勇(1978-) , 男, 博士, 副教授, 硕士研究生导师。
E -mail :ningzhyong @scau . edu . cn
基蛋氨酸购自美国Promega 公司。
1. 2 试验动物分组及模型制备 将试验鼠随机分成3组:正常对照组、冷冻-束缚应激组(简称应激
组) 和冷冻-束缚应激给药组(简称给药组) , 每组20只。参照Wong 等(2002) 和Chi 等(2003) 的方法制备冷冻-束缚应激模型, 大鼠禁食24h 、禁水1h 后, 将应激组和给药组的大鼠束缚于自制鼠板上以限制其活动。给药组按照设定的剂量灌胃给予氯甲基蛋氨酸, 应激组给予相同体积的生理盐水, 而后放入4℃冷冻箱内应激4h , 取出置室温1h , 反复放置3次后立即将动物处死。正常对照组不进行任何处理。1. 3 病理组织学检查 大鼠处死后, 迅速采集胃、十二指肠、肝脏、胰腺、心脏、肺脏、肾脏等脏器, 以10%中性缓冲甲醛溶液固定, 4μm 切片, HE 染色, 光镜下观察各脏器的组织学结构。2 结果
2. 1 剖检变化 应激组大鼠的胃腔内见少量血性积液, 腺胃部弥漫性点线状出血、黏膜糜烂; 给药组大鼠胃黏膜损伤轻微, 胃腔内无血性积液, 腺胃部未
Research Progress on Anti -stress Mechanism of HSPs to Livestock and Poultry
XIAO Ding -fu , ZH ANG Bin , H U Xiong -gui
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(1. Colleg e o f A nimal Science and T echnolog y , Hunan A g ricultur al Univ ersity , Chang sha 410128, China ;
2. H unan Institute o f A nimal and V eterina ry Science , Chang sha 410131, China )
A bstract :H eat sho ck pro teins (HS Ps ) is a g roup of specific pro teins that produce under str essing , w hich can let org anism quickly adapt to enviro nmental cha ng es . I n or der to pro vide reference fo r explo ring anti -stress mechanism of HSP s fr om molec -ula r lev el , this paper introduced briefly o rig in and classificatio n of HSP s , discussed g ene structure and regula tion mechanism o f HSP70, reviewed anti -stress effects and e xpression of HSP s w hen livestock and poultry a ppearing stress respo nse .
:pro (HSP s sho anti -; t stress ; n
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热应激蛋白对畜禽抗应激机理的研究进展
肖定福, 张彬, 胡雄贵
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(1. 湖南农业大学动物科学技术学院, 长沙 410128; 2. 湖南省畜牧兽医研究所, 长沙 410131)
摘要:热应激蛋白(hea t shock pro teins , HSP s ) 是机体在应激条件下所产生的一组特异性蛋白质, 能使机体迅速适应环境变化。作者简要介绍了HSP s 的来源及分类, 阐述了HSP 70的基因结构和调控机制, 综述了HSP s 抗应激功能及在畜禽应激反应中的表达, 以期为从分子水平探索HSP s 抗应激机理提供参考。
关键词:热应激蛋白; 热应激因子; 抗应激; 热应激; 表达
中图分类号:Q 958. 12 文献标识码:A 文章编号:1671-7236(2009) 04-0058-04
目前很多学者对动物应激的研究一般以生理生
化指标和激素浓度的变化作为应激指标, 但畜禽生理生化指标、酶和矿物质指标受气候、年龄、品种、营养等客观因素影响很大, 内分泌指标的变化往往是瞬间的, 目前还不能证明是可靠的应激指标。热应激蛋白的变化是衡量动物机体受到应激的一个非常有效的指标, H SPs (heat sho ck pro teins ) 作为应激调控蛋白对阐明动物的应激机理有着非常重要的作用。因此, 要了解抗应激作用本质, 需要从分子水平搞清楚HSP 基因调控机制, 且可从分子水平认识机体在应激环境中的各种变化, 有针对性地保护机体, 为动物生产中的抗应激研究提供更准确的科学依据。1 HSPs 简介
Ritosas (1962) 把25℃培育的果蝇幼虫置于32℃热环境中, 30min 后发现果蝇唾液腺染色体上出现很大的“膨突”, 提示该区域的基因转录增强, 表现为“热激反应”。热应激蛋白又称为热休克蛋白(H SPs ) , 是一切生物细胞在受到热、病原体、理化有害因素等刺激后发生热休克反应, 产生的一类生物进化上高度保守的(Buchmeier 等, 1990) , 由热休克基因编码的蛋白质, 其一级结构在不同种属之间具有很高的同源性(H atayama 等, 1997) 。HSPs 是生物热休克反应的主要标志, 它能使动物迅速适应环境的变化, 保护机体不受或少受损害(李卫晖等,
收稿日期:2008-10-28
作者简介:肖定福(1978-) , 女, 湖南人, 博士生, 主要从事动物
营养生理学研究。
通信作者:张彬(1955-) , 男, 教授, 博士生导师, 主要从事动物
代谢调控与营养生态学研究。T el . 0731-4618088; E -mail :z hb8236@126. com
基金项目:国家自然科学基金(30671516) 和湖南省教育厅一般
。
2002) 。近几年人们对热休克蛋白的编码序列、基因
结构进行了阐明, 并且又发现热激启动因子及转录因子。
一般来说, 根据H SPs 的分子质量、同源性和功能, 可分成6个家族:大分子质量H SPs 家族, H SP90家族, H SP70家族(分子质量在66～78ku ) 、H SP60家族、HSP40家族和小分子质量H SPs 家族。HSP70家族是H SPs 中最保守最重要的一族, 在大多数生物中含量、细胞应激后生成量、家族成员等都是最多的, 该家族中共有20多种蛋白质(Linquist , 1998) 。根据H SPs 的作用和调控方式可把H SPs 分为2大类, 一类称为构成型H SPs , 它们在细胞的正常代谢和生理条件下表达和发挥作用。另一类称为诱导型H SPs , 它们在机体或细胞受到刺激时表达, 使细胞产生耐受性。2 HSP70的基因结构与调控
2. 1 HSP70的基因结构 H SP70家族成员属于诱导型热休克蛋白, 是细胞产生热休克反应必需的内源性启动蛋白。H SP70蛋白家族是一个多基因、多结构、多功能的家族, 有HSC70、HSP70、PBP74、GRP784种主要成员(Hendrick 等, 1993) 。HSP70的结构可分为3部分:N 端(约44ku ) 序列高度保守, 由4个A 螺旋形成一个裂缝, 具有结合和水解ATP 的A TPase 活性, 因此称为A TPase 结构域; C 端18ku 部分, 由4个反相平行的B 折叠和一个A 螺旋构成, 是多肽的结合部位; C 端(约10ku ) , 主要由A 螺旋构成, 是活性调节区域。
2. 2 HSP70的调控机制2. 2. 1 HSP70调控功能区 热休克元件(heat sho ck element , HSE ) 是位于H S P 基因“TA TA ”盒上游区域约含20个核苷酸序列的构件, 是热应激应,
中国畜牧兽医 2009年第36卷第4期生理生化·59·
动子。它由HS Ps 基因5′-转录起始点上游44～46位核苷酸序列上的一段-CTnnGAAnnT TCNAG -序列组成。不同种属生物细胞中均有共同的H RE 碱基序列, 具有高度的保守性, 且均可被热应激诱导产生。HSF 的DNA 结合域决定其与H SE 的结合。2. 2. 2 HSF -H SP 的反式调控 HSP 的调节是诱导启动子基因调节的过程。热休克因子(heat shock facto r , H SF ) 是基本结构蛋白, 应激时通过可逆的过程形成三聚体, 与H SE 结合启动HS P 70基
因的转录(Benjamin 等, 1998) 。HSF 在各种伤害性刺激下, 其主要生物学功能是通过调控H SP 的表达
来实现的。HSF 各种形式虽然大小各有不同, 但其结构都共同具有一个保守的DNA 结合区域(DNA binding do main , DBD ) 和一个三聚区域(trimeriza -tion do main , TD ), 以及存在于N -端和C -端的非保守转录激活功能域(transcription activ ato r domain , AD ) 及调控区域(reg ulatory region , RR ) , 见图1(王凤阳等, 2008)
。
图1 HSF 全长结构图
在正常情况下, H SF 以单体形式与H SP70结合存在, 这3个序列在HSF 内部形成稳定的卷曲螺旋结构, 以维持HSF 无活性的单体状态, DBD 和
TD 具有抑制转录激活功能域发挥作用, 从而抑制H SF 活性的功能; 当细胞受到刺激时, HSF 单体通过三聚体结构域结合形成具有活性的三聚体。在应激条件下, H SF 通过下列途径发挥调控H SP 的作用, 应激时, 增加的变性蛋白竞争性地结合H SP70, 导致HSF 从H SF -H SP70复合体中解离; 解离的H SF 被蛋白激酶C 或其他丝氨酸/苏氨酸激酶磷酸化形成同源三聚体, 暴露出DNA 结合区和N LS (核定位序列) ; 在NLS 介导下, 经一主动转运过程, H SF 三聚体进入细胞核, 通过DNA 结合区结合HS P 基因启动子内的特定区域开启H SP 的转录。HS P 70基因没有内含子存在, 一旦启动转录就可产生出成熟的m RNA , 以适应HSP70大量快速表达的需要, 防止热应激对其m RNA 前体的影响。随着热应激消失, 细胞内出现大量游离的H SP70, 高水平的H SPs 和HSF 结合并抑制HSF 的活性, 从而减少H SF 和HSE 的特异性结合, 控制热休克基因的转录(Welch , 1992) 。
Guettouche 等(2005) 对热激活的HSF1分子磷酸化并聚合形成三聚体过程进行分析时发现, 热应激条件下, H SF1分子的12个丝氨酸(而非苏氨酸、酪氨酸) 发生磷酸化, 其中326位的丝氨酸在其发挥转录活性的过程中扮演着重要的角色。Nobu -hiko 等(2004) 通过对虹鳟鱼H SF1的克隆及功能分析, 结果发现, H SF1a 和H SF1b 会通过形成异源二聚体的方式发挥其对下游靶基因的转录调控功能, DBD 和TD 发挥重要功能的同时, 存在着各自特异的激活功能域和调控区域参与, 通过调控H SP70等下游热应激相关的靶基因的表达, 来发挥其抵抗热应激作用的分子机制。
2. 2. 3 H SP70的翻译调控 热应激时尽管细胞其它蛋白质的m RN A 并未受到破坏, 可以从细胞中分离出来, 并在体外翻译系统中得到表达。但此时除H SP m RNA 以外其它蛋白质的m RNA 均处于非翻译状态下。这主要是因为H SP70m RNA 中有一个较长的富含A 的5′非翻译区, 在热应激条件下由于此段序列富含A 而较难形成二级结构, 因此能够有机会与核糖体结合, 从而保证了H SP m RNA 的选择性翻译。
3 HSPs 的抗应激功能3. 1 分子伴侣作用 H SP70作为主要的分子伴侣蛋白, 其作用是与新生、未折叠、错折叠或变性聚集的蛋白质相结合, 减少产生不溶性聚集物的危险性, 并帮助需要折叠的蛋白质正确折叠, 维持某些肽链的伸展状态, 以利于其跨膜转运; 同时还能促进某些变性蛋白质的降解和清除, 维持酶的动力学特征, 以维护细胞功能(Welch , 1992) 。当蛋白质受损或变性时, HSP70通过促进变性蛋白质的修复性和水解来维持蛋白质的结构, 促进新的蛋白质取代老化蛋白质(Baler 等, 1993) 。H SP90可与甾体激素受体结合作用于核DN A , 避免细胞早熟和无意义反应, 还可激活蛋白激酶C (PKC ) 和蛋白酶活性, 水解A TP , 生成超氧化物歧化酶(SOD ) 等, 从而抵抗理化因素及过氧化物的损伤, 以保持细胞的生物学活性。H SP70可识别非天然和未折叠的前体蛋白, 防,
·60·生理生化中国畜牧兽医 2009年第36卷第4期
过程, 也可防止已松弛的前体蛋白聚集, 但它们对折叠状态的蛋白质却几乎无识别能力。当细胞受到应激原刺激时, 某些蛋白质肽链伸展, 失去原有的盘旋及折叠状态, 空间构型改变, 以致丧失原有功能。3. 2 细胞内保护性 H SPs 在应激条件下参与细胞的抗损伤、修复和热耐受过程, 保护细胞生命活动, 增强对应激的抵抗力并加快细胞或生物体从各种应激中恢复的速度。应激作用前后, 细胞内H SPs 的分布和表达发生显著变化, 这是HS Ps 行使细胞保护作用的体现。多数应激, 由于暴露了蛋白质的隐蔽性而使蛋白质的结构受到损伤, HSP70可结合这些被损伤的蛋白质, 预防它们发生聚集。H SP70不仅可以预防胞浆内蛋白质发生聚集, 而且还可以迁徙到核仁中, 与部分组装的核糖体建立联系, 从而保护细胞核蛋白。Heads (1994) 研究结果表明, 转染HS P 70基因的细胞对热应激有更强的抵抗力。Johnston (1988) 研究结果表明, 抑制H SP70的表达导致细胞对损伤高度敏感。Riabow o l (1988) 研究结果证实, 显微注射抗H SP70的抗体也会增加细胞对应激的敏感性。H SP70能通过调节细胞内某些酶的活性而引起细胞功能的变化。热应激反应产生的HSP70可激活在应激反应中活性受到抑制的Ca -A TPase , 减轻钙越膜损伤, 缓解应激对心肌特别是其线粒体的影响(M estril 等, 1995) 。Gabrief 等(1996) 在对肉鸡热应激的研究中还发现H SP70m RNA 含量受热诱导的增加还具有时间依赖性, 随热诱导时间的延长(1～5h ) 而增加。王枫等(2000) 研究结果发现, H SP70水平高的细胞其热耐力明显高于H SP70水平低的细胞, HSP70水平与细胞的热耐力呈正相关, 还发现当细胞在45℃热暴露达到6h 以上时, 不管是HSP70表达高的细胞还是H SP70表达低的细胞, 其细胞活力均降低。但是H SP70对细胞的保护作用并不是无限的, 不能无限夸大H SP70对细胞的保护作用, 它只能在一定范围内起作用, 主要是因为应激时间过长, 使维持细胞正常生长的蛋白质合成受阻, 威胁细胞的生存; 同时变性蛋白过多的产生超过了H SP70的保护能力, 所以影响了细胞的功能, 引起细胞死亡。
HSP70还参与细胞骨架的形成与修复, 在热应激前注射纯H SP70则可加快中心体的复原。人为2+
复及减少各种创伤所致的组织损伤。因此, 通过测定血液中的H SPs 来判断受损细胞的渗漏程度, 可作为细胞损伤的一个客观指标。
3. 3 减轻过氧化损伤 H SPs 在细胞内具有抗氧化的生物活性, 可抑制产生氧自由基的关键酶即NADPH 氧化酶, 同时增加超氧化物歧化酶活性, 通过反馈作用减少氧自由基的产生, 从而保护细胞免受伤害。H SP70可促使机体内源性抗氧化剂的合成和释放增加, 从而对应激产生较强的抵抗力。Gaubin 等(2000) 研究结果表明, 增加H SP70的表达可以使A549细胞抵抗氧化应激的损伤, 但增加H SP70的表达并没有改变细胞内SOD 、CAT 、GSH -PS 抗氧化酶的mRNA 水平。在缓解热应激中起作用的是诱导型H SP70, 而不是抗氧化酶。Lu 等(1993) 研究牛血管内皮细胞对过氧化应激分子适应, 结果发现HSP70表达的增加能减轻过氧化应激损伤。当机体皮肤表面温度超过35℃时, 动物开始储存热并快速增加蒸发散热机制, 基因表达变化包括激活H SF1; 增加H SP 表达, 并降低其他蛋白的表达和合成; 增加葡萄糖和氨基酸氧化反应, 降低脂肪酸代谢; 内分泌系统激活这些应激反应; 通过HSP 胞外分泌表达激活免疫系统(Collier 等, 2008) 。4 HSPs 在畜禽应激反应中的表达
应激是机体受到刺激所做出的全身性非特异性反应, 机体往往动员其内在力量来克服或消除各种应激对机体所产生的不利影响。鲍恩东等(2001) 在检测长途运输6h 应激猪的骨骼肌HSPs 的表达发现, H SP70和HSP72在肌肉组织中的表达虽然有一定增加, 但统计学分析差异不显著, HSP86和H SP90在骨骼肌中的表达明显下降, 可作为判断应激损伤的指标。杨圣等(2007) 选择H SP70作为评价猪成肌细胞热休克效应的主要标准之一, 通过Western blot 和流式细胞仪来定量检测猪成肌细胞中H SP 的表达证实了热休克预处理能诱发猪成肌细胞内H SP70的过度表达, 并改善细胞自体正常骨骼肌移植后的生存。肉鸡在孵出不久暴露到高温下一段时间, 42日龄再将其暴露到高温下, 结果发现H SP70在肺、心肌出现的量比对照组少, 把42日龄的鸡置于35. 7℃时, 比较体温变化与H SP70在肺组织中表达量变化的关系, 结果显示, 随着体温升高, H SP70的含量也升高(Yahav 等, 1997) 。孙培,
中国畜牧兽医 2009年第36卷第4期生理生化·61·
的H SP70m RNA 水平随持续性高温应激时间的延长逐渐升高。李玉保等(2008) 建立荧光定量RT -PCR 检测猪H SP70和HSP90, 结果发现运输应激猪组织中H SP70m RNA 的转录水平随着运输应激时间(10h 内) 的延长一直呈现出上升的趋势, H SP90m RNA 的转录水平则随着运输应激时间的延长呈下降趋势。A gnew 等(2008) 研究结果表明, 对牛羊用流式细胞术评定白细胞HSP70的表达评估细胞应激反应是一项稳定且可重复的方法, 该方法的应用将作为一个有价值的工具来评估家畜体内细胞应激反应。Wang 等(2008) 在体外培养牛主动脉内皮细胞上研究热应激后H SP70动力学, 结果显示, 热应激后3和12h 出现HSP70表达高峰, 6～16h 观测到H SP70从细胞质渐进移位到细胞核。
参
考
文
献
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·62·生理生化中国畜牧兽医 2009年第36卷第4期
氯甲基蛋氨酸对冷冻-束缚应激大鼠消化器官
组织学结构的影响
罗敏意, 程艳芬, 宁章勇, 于博, 潘俊斌
(华南农业大学兽医学院, 广州 510642)
摘要:为探讨氯甲基蛋氨酸对应激性胃溃疡的预防效果, 制备了大鼠急性冷冻-束缚应激模型, 通过观察冷冻-束缚应激所致大鼠消化系统器官的损伤性变化及氯甲基蛋氨酸对应激状态下大鼠消化器官组织结构的影响, 判定氯甲基蛋氨酸对应激性胃溃疡的作用。结果表明, 氯甲基蛋氨酸对大鼠冷冻-束缚应激性胃溃疡的消化系统器官具有明显的保护作用。
关键词:氯甲基蛋氨酸; 冷冻-束缚应激; 大鼠; 组织学
中图分类号:S852. 16+5 文献标识码:A 文章编号:1671-7236(2009) 04-0062-03
应激性溃疡是当前集约化畜牧业中常见的动物应激性疾病, 特别是在饲料成分、环境因素、快速生长等应激原的作用下, 应激性溃疡已经成为危害动
物健康生长的最重要因素之一(董宏伟等, 2007; Dupjan 等, 2008) 。资料表明在集约化养殖环境中的家禽和猪, 应激性溃疡的发生率可高达20%(Si -laniko ve , 2000) 。本研究通过制备稳定成熟的冷冻-束缚应激模型, 观察冷冻-束缚应激所致大鼠消化器官的损伤变化及氯甲基蛋氨酸对应激状态下大鼠消化器官组织结构的影响, 为兽医临床研制新型对抗应激性溃疡的药物提供基础数据。1 材料与方法
1. 1 试验动物和试剂 健康Wistar 大鼠60只, 体重200～220g , 由中山大学实验动物中心提供。氯甲
收稿日期:2008-09-25
作者简介:罗敏意(1983-) , 女, 广东人, 硕士生, 研究方向:兽医
病理学。
通信作者:宁章勇(1978-) , 男, 博士, 副教授, 硕士研究生导师。
E -mail :ningzhyong @scau . edu . cn
基蛋氨酸购自美国Promega 公司。
1. 2 试验动物分组及模型制备 将试验鼠随机分成3组:正常对照组、冷冻-束缚应激组(简称应激
组) 和冷冻-束缚应激给药组(简称给药组) , 每组20只。参照Wong 等(2002) 和Chi 等(2003) 的方法制备冷冻-束缚应激模型, 大鼠禁食24h 、禁水1h 后, 将应激组和给药组的大鼠束缚于自制鼠板上以限制其活动。给药组按照设定的剂量灌胃给予氯甲基蛋氨酸, 应激组给予相同体积的生理盐水, 而后放入4℃冷冻箱内应激4h , 取出置室温1h , 反复放置3次后立即将动物处死。正常对照组不进行任何处理。1. 3 病理组织学检查 大鼠处死后, 迅速采集胃、十二指肠、肝脏、胰腺、心脏、肺脏、肾脏等脏器, 以10%中性缓冲甲醛溶液固定, 4μm 切片, HE 染色, 光镜下观察各脏器的组织学结构。2 结果
2. 1 剖检变化 应激组大鼠的胃腔内见少量血性积液, 腺胃部弥漫性点线状出血、黏膜糜烂; 给药组大鼠胃黏膜损伤轻微, 胃腔内无血性积液, 腺胃部未
Research Progress on Anti -stress Mechanism of HSPs to Livestock and Poultry
XIAO Ding -fu , ZH ANG Bin , H U Xiong -gui
1
1
2
(1. Colleg e o f A nimal Science and T echnolog y , Hunan A g ricultur al Univ ersity , Chang sha 410128, China ;
2. H unan Institute o f A nimal and V eterina ry Science , Chang sha 410131, China )
A bstract :H eat sho ck pro teins (HS Ps ) is a g roup of specific pro teins that produce under str essing , w hich can let org anism quickly adapt to enviro nmental cha ng es . I n or der to pro vide reference fo r explo ring anti -stress mechanism of HSP s fr om molec -ula r lev el , this paper introduced briefly o rig in and classificatio n of HSP s , discussed g ene structure and regula tion mechanism o f HSP70, reviewed anti -stress effects and e xpression of HSP s w hen livestock and poultry a ppearing stress respo nse .
:pro (HSP s sho anti -; t stress ; n