肠道屏障的机理和应用研究进展
Wxj
摘要：正常肠道功能除了消化吸收之外还有强大的抵御肠道有害微生物及其产生的各类毒素的屏障功能[1]，保证动物肠道健康主要依靠肠道的三大屏障，即肠黏膜上皮屏障、肠道免疫细胞及其分泌物所形成的免疫屏障以及肠道正常微生物群所构成的生物屏障。多年来，关于这三大屏障的结构基础和大概的作用机理已经研究的较为清楚，目前相关工作人员除在积极探索完善深层机理之外，还做了很多应用方面的工作。本文就肠道屏障的机理及应用做一综述。
1肠黏膜上皮屏障的组成
1.1紧密连接的分子结构
由完整的肠上皮细胞和相邻肠上皮细胞之间的连接构成的黏膜屏障是肠道最重要的一道屏障。相邻上皮细胞间的连接方式有多种，如紧密连接、缝隙连接、粘附连接以及桥粒等。而紧密连接是细胞间最重要的连接方式，其功能是只允许离子及小分子可溶性物质通过，而不许毒性大分子及微生物通过，这种特殊生理功能在肠道屏障的维护中起着举足轻重的作用。现已证明多种蛋白参与紧密连接的形成，根据不同作用可将这些蛋白分为结构蛋白（occludin ，claudin [2, 3]，JAM 等）和调节蛋白（如E 钙粘素、肌动蛋白、肌球蛋白、Cingulin 等）。诸多紧密连接蛋白中，尤以Occludin 及Claudins 最为重要，Occludin 为一完整的II 型跨膜蛋白，分子质量约为65ku ，含四个跨膜结构，在维持和调节紧密连接屏障功能中具有重要作用，而根据冰冻刻蚀电镜技术显示Claudins 是构成紧密连接线的主要成分。外周膜蛋白ZO1的C 末端则可结合肌动蛋白和应激纤维，从而将Occludin 和肌动蛋白骨架系统连接在一起构成稳定的连接系统。
`1.2紧密连接的作用
作为肠黏膜屏障的关键组成，紧密连接的作用包括选择性屏障和维持栅栏功能。肠道上皮紧密连接作为动态的通透性屏障，作用是双重的：阻止潜在的有害物质或病原体进入机体，同时允许营养物质、离子和水进入体内。临床研究发现，高糖饮食时葡萄糖吸收率并不与葡萄糖转运体的增加成正比。还有研究发现，在病理状态下，紧密连接蛋白可产生收缩现象，并向胞质中移动，细胞孔隙(窗孔) 明显扩大，导致大分子物质及毒素、细菌移位，此时肠黏膜就丧失其选择性屏障作用。已知紧密连接由围绕上皮细胞顶端的跨膜蛋白(Occludin, Claudins 等) 构成，从而限制了以紧密连接为界的上皮细胞顶侧和基侧膜两部分细胞膜上的脂质自由流动(即栅栏功能) 。这两部分的主要区别在于脂质和蛋白质的构成不同，基侧膜的结构和功能与一般的非上皮细胞相似，而顶侧膜富含鞘糖脂和胆固醇，而磷脂相对缺乏，鞘糖脂可通过分子之间的H 键相互连接，维护肠黏膜的硬度和不可通透性，从而保护机体兔受细菌、毒素等有害物质的入侵。
1.3肠上皮细胞紧密连接的调控
肠上皮紧密连接发生变异、减少或缺失时，IEC （肠道上皮细胞）间隙通透性就会增加，细菌、毒素及大分子物质可通过紧密连接进入体循环. 例如某些肠道炎症性疾病如炎症性肠炎（IBS) ，其特征就是IEC 旁路通透性增高。目前关于肠道紧密连接的机制研究在以下通路形成较为清晰的观点。磷脂酶C 依赖性信号通路、Ca 2+-E 钙黏素信号途径、酪氨酸激酶一磷酸酶信号通路和Rho GTP酶途径。
2肠道免疫屏障
2.1肠道免疫屏障的组成
肠道免疫屏障由肠上皮细胞、肠上皮内淋巴细胞、固有层淋巴细胞、派伊氏结(peyer' patch, PP)和肠系膜淋巴结等肠道组织及肠道浆细胞分泌型免疫球蛋白A(sIgA)构成[2, 3][4]。在肠道免疫屏障中有一个特殊的GALT,GALT 是由PP 、肠系膜淋巴结以及分散在黏膜固有层(LP)和肠上
皮中的大量淋巴细胞组成。GALT 既能抵御致病因子入侵，又可耐受肠道非致病菌群。其作
[5]用机制就是在抗原刺激下产生局部的免疫反应，中和抗原物质（主要是产生大量的sIgA ）。
sIgA 是免疫球蛋白A(IgA)单体通过J 链连结而成的二聚体，主要由肠黏膜固有层浆细胞产生。sIgA 进入肠道能选择性地包被革兰氏阴性菌，形成抗原抗体复合物，阻碍细菌与上皮细胞受体相结合，刺激肠道黏液分泌并加速黏液层的流动，有效地阻止细菌对肠黏膜的粘附，并且其在穿胞过程中对于已潜入细胞内的病毒同样具有中和作用[6]。sIgA 阻抑粘附的可能机制是:使病原微生物发生凝集，丧失活动能力而不能粘附于黏膜上皮细胞。与病原微生物结合后，阻断了微生物表面的特异结合点，因而使其丧失了粘附能力[7]。
2.2肠道免疫屏功能障碍的因素及作用机制
在机体大量失血的情况下，肠道供血不是在优先的地位，固有层浆细胞数量和质量下降，导致IgA 双体和组配sIgA 的能力也下降。B 淋巴细胞分泌免疫球蛋白减少，黏膜面sIgA 含量的下降，有利于细菌、毒素侵入体内，同时还可引起氧自由基生成过多[8]。肠内营养障碍，黏膜免疫功能会受到损伤，例如谷氨酰胺可阻抑各种因素引起的肠黏膜分泌IgA 的浆细胞和其它淋巴细胞数量的减少，增强GALT 的功能，改善肠道免疫功能，减少肠道细菌及内毒素的移位[9]。蛋白质营养不良的情况下，会干扰肠黏膜中B 淋巴细胞分化，使sIgA 分泌减少，降低肠黏膜抗感染的免疫功能。
3 肠道微生物屏障
肠内包含一个微生物生态系统，其中微生物的活动对于肠内免疫系统的功能有重要作用，平衡的微生物群对肠黏膜免疫系统健康发展有重要作用[10]。Cukrowska [11] 给刚出生的无菌小猪接种非致病性大肠杆菌在最初几天可观肠粘膜通透性增加、PP 的发生中心形成、细菌一过性移位到肠系膜淋巴结、产生特异性抗菌抗体、多克隆的B 细胞被激活，但到第5-10天时，局部和全身的免疫反应被抑制，呈现一种自限性的、可控的生理性炎症反应并最终达到免疫耐受。定植于上皮细胞的正常细菌，能向肠道免疫系统传递某些信号，诱导免疫下调。Neish [12]发现，iEC 在与非致病性沙门菌直接接触后，再受到前炎症因子刺激时，其炎症效应分子的合成明显减少。其机制是细菌干扰了IKB 的降解，IKB 是结合在核转录因子NF-κB 上并封闭其功能的分子，I κB 的不降解，NF-κB 就无法被激活，而NF-κB 激活又是合成一系列炎症因子的必要步骤。正常情况下肠道菌群与肠道免疫和平共处，互惠互利，通过精密的调控机制，二者处于动态平衡状态，一旦这种机制被破坏，将会导致一系列疾病。
4应用方面的开发试验
对肠道屏障有了相当的理论基础之上，很多科学工作者在试验寻找肠道屏障的调控物质中做了很多探究，有从功能性糖类入手的，如壳聚糖通过上调IGF 一工诱导生长轴、缓解机体氧化应激和提高肠道屏障功能的机制提高早期断奶仔猪生长性能和体液免疫力，并且通过改善肠道结构，促进肠道有益菌的繁殖，抑制有害菌，直接作用于黏膜免疫效应分子，降低肠道炎症反应，提高肠粘膜免疫功能（肖定福，2011）[13]。有从益生菌入手的，如通过口服屎肠球菌EF1，在仔猪肠道里通过阻碍粘附、保护肠上皮细胞代谢活性和膜的完整性、减轻肠上皮细胞促炎反应以及增强巨噬细胞炎症应答来抵抗大肠杆菌K88的感染，其调节先天免疫的分子机理与TLRs 介导的信号传导途径有关（黄怡，2012）[14]。也有从矿物质入手的，如研究氧化锌对肠黏膜紧密连接蛋白表达量的提高作用，和对大肠杆菌的杀伤作用（王超，2013）[15]。
5结语
肠黏膜与腔内大量的细菌及毒素广泛接触，是机体受威胁最大的部位，肠道存在的物理化学和生物屏障在正常机能状态下是能够保持肠道健康的，但是结合养殖实际情况来看，畜禽不总是能够生活在合适的环境中，除了无时无刻存在的应激，还有卫生条件不合格，都会导致机体稳态失衡，引起一系列的消化代谢异常情况，肠道屏障众多环节中只一个出现问题就会给畜禽造成生长抑制，影响生产。我认为在肠道屏障的结构基础和功能机制都较为明晰的情况下，针对生产实际中始终十分棘手的肠道健康问题，生产管理应该规范化，提高生产管理水平，首先卫生要达标，畜舍清洁，饲料无霉变，其次要尽量避免给畜禽造成应激。在此基础上，肠道屏障调控才有意义。多年来肠道屏障研究不断取得进展，目前虽然已经比较清楚单一因素的作用机制，但是综合整个胃肠消化道的复杂互作仍存在很多空白，今后的研究一定会往多因素同时考虑的方向不断深入。或者是将被认为有效的肠道屏障调节剂用于使处于肠道疾病中的畜禽恢复的实验，根据前后相关指标的变化，可进一步探讨畜禽自身肠道屏障的调节规律。
参考文献
[1] 黎介寿. 加强对肠屏障功能障碍的研究[J]. 中国临床营养杂志,2003(04):3-5.
[2] Furuse M F K H T. Claudin-1 and -2:novel integral membrane proteins localizing at tight junctions with no sequence similarity to occludin[J]. J Cell Biochem,1998(149):1539-1550.
[3] Matsuda M K A F M. A peculiar internalization of claudins, tight junction-specific adhesion molecules, during the intercellular movement of epithelial cells[J]. J cell Biochem,2004(117):1247-1257.
[4] 徐凯进，李兰娟. 肠道正常菌群与肠道免疫[J]. 国外医学. 流行病学传染病学分册,2005(03):181-183.
[5] 曹珊，王晶桐，刘玉兰. 胃肠道黏膜屏障与自身免疫性疾病[J]. 胃肠病学和肝病学杂志,2007(02):198-200.
[6] 彭乃宝. 维护肠道屏障功能的重要性及措施[J]. 齐齐哈尔医学院学报,2005(10):68-70.
[7] 何保健，曹义战，倪晓琴，等. 分泌型免疫球蛋白A 在胃肠粘膜免疫中的作用及意义[J]. 陕西医学杂志,2005(11):1381-1383.
[8] 钟世顺. 肠粘膜屏障功能障碍与双歧杆菌[J]. 国外医学(生理、病理科学与临床分册),2003(04):432-435.
[9] 于晓明，金宏，糜漫天. 肠屏障功能的损伤与营养素防护[J]. 解放军预防医学杂志,2006(01):68-70.
[10] Ouwehand A I E S S. The role of the intestinal microflora for the development of the immune system in early childhood[Z]. 2002132-137.
[11] Al C K K K. specific antibody and immunoglobulin respose after intestinal colonization of genm-free piglets with non-pathogenic Escherichia coli 086[Z]. 2001425-433.
[12] As N. The gut microflra and intestinal epithelial cellsa continuing dialogue[Z]. 2002309-317.
[13] 肖定福. 壳聚糖对仔猪生长、肠道屏障和免疫的影响及其机理研究
[Z]. 湖南农业大学:2011.
[14] 黄怡. 屎肠球菌EFl 对仔猪小肠黏膜屏障功能的影响
[Z]. 浙江大学:2012.
[15] 王超. 包膜氧化锌促仔猪生长效果及机理研究
[Z]. 浙江大学:2013.
肠道屏障的机理和应用研究进展
Wxj
摘要：正常肠道功能除了消化吸收之外还有强大的抵御肠道有害微生物及其产生的各类毒素的屏障功能[1]，保证动物肠道健康主要依靠肠道的三大屏障，即肠黏膜上皮屏障、肠道免疫细胞及其分泌物所形成的免疫屏障以及肠道正常微生物群所构成的生物屏障。多年来，关于这三大屏障的结构基础和大概的作用机理已经研究的较为清楚，目前相关工作人员除在积极探索完善深层机理之外，还做了很多应用方面的工作。本文就肠道屏障的机理及应用做一综述。
1肠黏膜上皮屏障的组成
1.1紧密连接的分子结构
由完整的肠上皮细胞和相邻肠上皮细胞之间的连接构成的黏膜屏障是肠道最重要的一道屏障。相邻上皮细胞间的连接方式有多种，如紧密连接、缝隙连接、粘附连接以及桥粒等。而紧密连接是细胞间最重要的连接方式，其功能是只允许离子及小分子可溶性物质通过，而不许毒性大分子及微生物通过，这种特殊生理功能在肠道屏障的维护中起着举足轻重的作用。现已证明多种蛋白参与紧密连接的形成，根据不同作用可将这些蛋白分为结构蛋白（occludin ，claudin [2, 3]，JAM 等）和调节蛋白（如E 钙粘素、肌动蛋白、肌球蛋白、Cingulin 等）。诸多紧密连接蛋白中，尤以Occludin 及Claudins 最为重要，Occludin 为一完整的II 型跨膜蛋白，分子质量约为65ku ，含四个跨膜结构，在维持和调节紧密连接屏障功能中具有重要作用，而根据冰冻刻蚀电镜技术显示Claudins 是构成紧密连接线的主要成分。外周膜蛋白ZO1的C 末端则可结合肌动蛋白和应激纤维，从而将Occludin 和肌动蛋白骨架系统连接在一起构成稳定的连接系统。
`1.2紧密连接的作用
作为肠黏膜屏障的关键组成，紧密连接的作用包括选择性屏障和维持栅栏功能。肠道上皮紧密连接作为动态的通透性屏障，作用是双重的：阻止潜在的有害物质或病原体进入机体，同时允许营养物质、离子和水进入体内。临床研究发现，高糖饮食时葡萄糖吸收率并不与葡萄糖转运体的增加成正比。还有研究发现，在病理状态下，紧密连接蛋白可产生收缩现象，并向胞质中移动，细胞孔隙(窗孔) 明显扩大，导致大分子物质及毒素、细菌移位，此时肠黏膜就丧失其选择性屏障作用。已知紧密连接由围绕上皮细胞顶端的跨膜蛋白(Occludin, Claudins 等) 构成，从而限制了以紧密连接为界的上皮细胞顶侧和基侧膜两部分细胞膜上的脂质自由流动(即栅栏功能) 。这两部分的主要区别在于脂质和蛋白质的构成不同，基侧膜的结构和功能与一般的非上皮细胞相似，而顶侧膜富含鞘糖脂和胆固醇，而磷脂相对缺乏，鞘糖脂可通过分子之间的H 键相互连接，维护肠黏膜的硬度和不可通透性，从而保护机体兔受细菌、毒素等有害物质的入侵。
1.3肠上皮细胞紧密连接的调控
肠上皮紧密连接发生变异、减少或缺失时，IEC （肠道上皮细胞）间隙通透性就会增加，细菌、毒素及大分子物质可通过紧密连接进入体循环. 例如某些肠道炎症性疾病如炎症性肠炎（IBS) ，其特征就是IEC 旁路通透性增高。目前关于肠道紧密连接的机制研究在以下通路形成较为清晰的观点。磷脂酶C 依赖性信号通路、Ca 2+-E 钙黏素信号途径、酪氨酸激酶一磷酸酶信号通路和Rho GTP酶途径。
2肠道免疫屏障
2.1肠道免疫屏障的组成
肠道免疫屏障由肠上皮细胞、肠上皮内淋巴细胞、固有层淋巴细胞、派伊氏结(peyer' patch, PP)和肠系膜淋巴结等肠道组织及肠道浆细胞分泌型免疫球蛋白A(sIgA)构成[2, 3][4]。在肠道免疫屏障中有一个特殊的GALT,GALT 是由PP 、肠系膜淋巴结以及分散在黏膜固有层(LP)和肠上
皮中的大量淋巴细胞组成。GALT 既能抵御致病因子入侵，又可耐受肠道非致病菌群。其作
[5]用机制就是在抗原刺激下产生局部的免疫反应，中和抗原物质（主要是产生大量的sIgA ）。
sIgA 是免疫球蛋白A(IgA)单体通过J 链连结而成的二聚体，主要由肠黏膜固有层浆细胞产生。sIgA 进入肠道能选择性地包被革兰氏阴性菌，形成抗原抗体复合物，阻碍细菌与上皮细胞受体相结合，刺激肠道黏液分泌并加速黏液层的流动，有效地阻止细菌对肠黏膜的粘附，并且其在穿胞过程中对于已潜入细胞内的病毒同样具有中和作用[6]。sIgA 阻抑粘附的可能机制是:使病原微生物发生凝集，丧失活动能力而不能粘附于黏膜上皮细胞。与病原微生物结合后，阻断了微生物表面的特异结合点，因而使其丧失了粘附能力[7]。
2.2肠道免疫屏功能障碍的因素及作用机制
在机体大量失血的情况下，肠道供血不是在优先的地位，固有层浆细胞数量和质量下降，导致IgA 双体和组配sIgA 的能力也下降。B 淋巴细胞分泌免疫球蛋白减少，黏膜面sIgA 含量的下降，有利于细菌、毒素侵入体内，同时还可引起氧自由基生成过多[8]。肠内营养障碍，黏膜免疫功能会受到损伤，例如谷氨酰胺可阻抑各种因素引起的肠黏膜分泌IgA 的浆细胞和其它淋巴细胞数量的减少，增强GALT 的功能，改善肠道免疫功能，减少肠道细菌及内毒素的移位[9]。蛋白质营养不良的情况下，会干扰肠黏膜中B 淋巴细胞分化，使sIgA 分泌减少，降低肠黏膜抗感染的免疫功能。
3 肠道微生物屏障
肠内包含一个微生物生态系统，其中微生物的活动对于肠内免疫系统的功能有重要作用，平衡的微生物群对肠黏膜免疫系统健康发展有重要作用[10]。Cukrowska [11] 给刚出生的无菌小猪接种非致病性大肠杆菌在最初几天可观肠粘膜通透性增加、PP 的发生中心形成、细菌一过性移位到肠系膜淋巴结、产生特异性抗菌抗体、多克隆的B 细胞被激活，但到第5-10天时，局部和全身的免疫反应被抑制，呈现一种自限性的、可控的生理性炎症反应并最终达到免疫耐受。定植于上皮细胞的正常细菌，能向肠道免疫系统传递某些信号，诱导免疫下调。Neish [12]发现，iEC 在与非致病性沙门菌直接接触后，再受到前炎症因子刺激时，其炎症效应分子的合成明显减少。其机制是细菌干扰了IKB 的降解，IKB 是结合在核转录因子NF-κB 上并封闭其功能的分子，I κB 的不降解，NF-κB 就无法被激活，而NF-κB 激活又是合成一系列炎症因子的必要步骤。正常情况下肠道菌群与肠道免疫和平共处，互惠互利，通过精密的调控机制，二者处于动态平衡状态，一旦这种机制被破坏，将会导致一系列疾病。
4应用方面的开发试验
对肠道屏障有了相当的理论基础之上，很多科学工作者在试验寻找肠道屏障的调控物质中做了很多探究，有从功能性糖类入手的，如壳聚糖通过上调IGF 一工诱导生长轴、缓解机体氧化应激和提高肠道屏障功能的机制提高早期断奶仔猪生长性能和体液免疫力，并且通过改善肠道结构，促进肠道有益菌的繁殖，抑制有害菌，直接作用于黏膜免疫效应分子，降低肠道炎症反应，提高肠粘膜免疫功能（肖定福，2011）[13]。有从益生菌入手的，如通过口服屎肠球菌EF1，在仔猪肠道里通过阻碍粘附、保护肠上皮细胞代谢活性和膜的完整性、减轻肠上皮细胞促炎反应以及增强巨噬细胞炎症应答来抵抗大肠杆菌K88的感染，其调节先天免疫的分子机理与TLRs 介导的信号传导途径有关（黄怡，2012）[14]。也有从矿物质入手的，如研究氧化锌对肠黏膜紧密连接蛋白表达量的提高作用，和对大肠杆菌的杀伤作用（王超，2013）[15]。
5结语
肠黏膜与腔内大量的细菌及毒素广泛接触，是机体受威胁最大的部位，肠道存在的物理化学和生物屏障在正常机能状态下是能够保持肠道健康的，但是结合养殖实际情况来看，畜禽不总是能够生活在合适的环境中，除了无时无刻存在的应激，还有卫生条件不合格，都会导致机体稳态失衡，引起一系列的消化代谢异常情况，肠道屏障众多环节中只一个出现问题就会给畜禽造成生长抑制，影响生产。我认为在肠道屏障的结构基础和功能机制都较为明晰的情况下，针对生产实际中始终十分棘手的肠道健康问题，生产管理应该规范化，提高生产管理水平，首先卫生要达标，畜舍清洁，饲料无霉变，其次要尽量避免给畜禽造成应激。在此基础上，肠道屏障调控才有意义。多年来肠道屏障研究不断取得进展，目前虽然已经比较清楚单一因素的作用机制，但是综合整个胃肠消化道的复杂互作仍存在很多空白，今后的研究一定会往多因素同时考虑的方向不断深入。或者是将被认为有效的肠道屏障调节剂用于使处于肠道疾病中的畜禽恢复的实验，根据前后相关指标的变化，可进一步探讨畜禽自身肠道屏障的调节规律。
参考文献
[1] 黎介寿. 加强对肠屏障功能障碍的研究[J]. 中国临床营养杂志,2003(04):3-5.
[2] Furuse M F K H T. Claudin-1 and -2:novel integral membrane proteins localizing at tight junctions with no sequence similarity to occludin[J]. J Cell Biochem,1998(149):1539-1550.
[3] Matsuda M K A F M. A peculiar internalization of claudins, tight junction-specific adhesion molecules, during the intercellular movement of epithelial cells[J]. J cell Biochem,2004(117):1247-1257.
[4] 徐凯进，李兰娟. 肠道正常菌群与肠道免疫[J]. 国外医学. 流行病学传染病学分册,2005(03):181-183.
[5] 曹珊，王晶桐，刘玉兰. 胃肠道黏膜屏障与自身免疫性疾病[J]. 胃肠病学和肝病学杂志,2007(02):198-200.
[6] 彭乃宝. 维护肠道屏障功能的重要性及措施[J]. 齐齐哈尔医学院学报,2005(10):68-70.
[7] 何保健，曹义战，倪晓琴，等. 分泌型免疫球蛋白A 在胃肠粘膜免疫中的作用及意义[J]. 陕西医学杂志,2005(11):1381-1383.
[8] 钟世顺. 肠粘膜屏障功能障碍与双歧杆菌[J]. 国外医学(生理、病理科学与临床分册),2003(04):432-435.
[9] 于晓明，金宏，糜漫天. 肠屏障功能的损伤与营养素防护[J]. 解放军预防医学杂志,2006(01):68-70.
[10] Ouwehand A I E S S. The role of the intestinal microflora for the development of the immune system in early childhood[Z]. 2002132-137.
[11] Al C K K K. specific antibody and immunoglobulin respose after intestinal colonization of genm-free piglets with non-pathogenic Escherichia coli 086[Z]. 2001425-433.
[12] As N. The gut microflra and intestinal epithelial cellsa continuing dialogue[Z]. 2002309-317.
[13] 肖定福. 壳聚糖对仔猪生长、肠道屏障和免疫的影响及其机理研究
[Z]. 湖南农业大学:2011.
[14] 黄怡. 屎肠球菌EFl 对仔猪小肠黏膜屏障功能的影响
[Z]. 浙江大学:2012.
[15] 王超. 包膜氧化锌促仔猪生长效果及机理研究
[Z]. 浙江大学:2013.