纤维素降解细菌的筛选及酶活测定
1 材料与方法
1．1 含菌样品
含菌样品取自校园里的腐烂树叶处的土壤。
1．2 培养基
(1)CMC(羧甲基纤维素) 培养基：CMC-Na15 g， NH4NO 3 1 g，MgSO 4 ·7H 20 0．5 g，KH 2PO 4 0.5 g，琼脂2％ ，H 20 1 000 mL，pH 自然，121 ℃灭菌。
(2)刚果红鉴定培养基：KH 2PO 4 0.2％ ，MgSO 4 0．05％ ， (NH ) 2SO 4 0．1％ ，琼脂2％ ，刚果红0．02％ ，CMC —Na 2％ ，NaC1 0．05％ ，pH 自然。
(3)液体产酶培养基：CMC —Na 15 g，NH 4 NO31 g，KH 2PO 4 1 g，MgSO 4 0．5 g，H 20 1000 mL,初始pH 值霉菌调为5，细菌调为8
1.3 菌株的筛选
初筛采用滤纸条崩解实验及刚果红平板识别 ，复筛采用液态产酶鉴定。
1.4 CMC酶活力的测定
1.4.1 DNS法绘制标准曲线
采用3，5一二硝基水杨酸比色定糖法(DNS) 测 定酶解液中还原糖含量。取9支比色管，分别按表顺
序加入各种试剂，将各管溶液混匀，用空白管溶液调 零，测520 nm处的光密度值，绘制标准曲线
1.4.2 测酶活
将菌株接种于发酵培养基，30℃，l80 rpm培养4 d， 从培养基中取l ml菌液放人试管，加水稀释至5 ml， 4000 rpm离心5 min。移取上清液 0．5 ml于试管中， 加入含 0．5％ CMC—Na 的柠檬酸缓冲液
(0．05 mol／L ，pH 4．4)1．5 ml，50℃水浴锅准确作用 30 min，在每试管内加 1.5 ml DNS试剂，沸水浴 5 min，
立即冷却，520 nm 处测定其OD 值，对比标准曲线，求葡萄糖含量。 酶活力计算公式：酶活力=葡萄糖量×10(10一稀释倍数) 酶活力单位(u)=(1 mg葡萄糖／m1) ·30 min。
2. 流程分析
(1)纤维素降解菌的筛选：将含菌样品富集培养后，取菌液0．1 mL 涂布于羧甲基纤维素平板中，待其长出菌落后，进行平皿划线法分离，分离到一系列纤维素降解菌。然后将分离得到的纤维素降 解菌分别接种在滤纸条培养基中培养10 d ，根据菌株对滤纸条的崩解效果筛选优势菌株，观察其对滤纸条的崩解效果；在刚果红识别平板上培养3 d ，产生红色沉淀和透明圈，证明SY 2：能较好地分解纤维素。将SY 2 接种到液态产酶培养基进行液态产酶实验，于摇床(150 r／min) 培养72 h，测其CMC 酶活。
纤维素降解细菌的筛选及酶活测定
1 材料与方法
1．1 含菌样品
含菌样品取自校园里的腐烂树叶处的土壤。
1．2 培养基
(1)CMC(羧甲基纤维素) 培养基：CMC-Na15 g， NH4NO 3 1 g，MgSO 4 ·7H 20 0．5 g，KH 2PO 4 0.5 g，琼脂2％ ，H 20 1 000 mL，pH 自然，121 ℃灭菌。
(2)刚果红鉴定培养基：KH 2PO 4 0.2％ ，MgSO 4 0．05％ ， (NH ) 2SO 4 0．1％ ，琼脂2％ ，刚果红0．02％ ，CMC —Na 2％ ，NaC1 0．05％ ，pH 自然。
(3)液体产酶培养基：CMC —Na 15 g，NH 4 NO31 g，KH 2PO 4 1 g，MgSO 4 0．5 g，H 20 1000 mL,初始pH 值霉菌调为5，细菌调为8
1.3 菌株的筛选
初筛采用滤纸条崩解实验及刚果红平板识别 ，复筛采用液态产酶鉴定。
1.4 CMC酶活力的测定
1.4.1 DNS法绘制标准曲线
采用3，5一二硝基水杨酸比色定糖法(DNS) 测 定酶解液中还原糖含量。取9支比色管，分别按表顺
序加入各种试剂，将各管溶液混匀，用空白管溶液调 零，测520 nm处的光密度值，绘制标准曲线
1.4.2 测酶活
将菌株接种于发酵培养基，30℃，l80 rpm培养4 d， 从培养基中取l ml菌液放人试管，加水稀释至5 ml， 4000 rpm离心5 min。移取上清液 0．5 ml于试管中， 加入含 0．5％ CMC—Na 的柠檬酸缓冲液
(0．05 mol／L ，pH 4．4)1．5 ml，50℃水浴锅准确作用 30 min，在每试管内加 1.5 ml DNS试剂，沸水浴 5 min，
立即冷却，520 nm 处测定其OD 值，对比标准曲线，求葡萄糖含量。 酶活力计算公式：酶活力=葡萄糖量×10(10一稀释倍数) 酶活力单位(u)=(1 mg葡萄糖／m1) ·30 min。
2. 流程分析
(1)纤维素降解菌的筛选：将含菌样品富集培养后，取菌液0．1 mL 涂布于羧甲基纤维素平板中，待其长出菌落后，进行平皿划线法分离，分离到一系列纤维素降解菌。然后将分离得到的纤维素降 解菌分别接种在滤纸条培养基中培养10 d ，根据菌株对滤纸条的崩解效果筛选优势菌株，观察其对滤纸条的崩解效果；在刚果红识别平板上培养3 d ，产生红色沉淀和透明圈，证明SY 2：能较好地分解纤维素。将SY 2 接种到液态产酶培养基进行液态产酶实验，于摇床(150 r／min) 培养72 h，测其CMC 酶活。