中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBulletin 2001Jun;17(3):249～52
·249·
血管内皮细胞超极化因子＊
陈冬梅 汪 海
(军事医学科学院毒物药物研究所,北京 100850)
中国图书分类号 R-05;R322.12;R349.21;R914.3文献标识码 A 文章编号 1001-1978(2001)03-0249-04摘要 内皮细胞释放多种重要的生物活性物质,调节血管张力、血液纤溶与凝血机制、脂蛋白代谢、免疫反应等重要生命过程。内皮细胞释放的超极化因子(EDHF)是一类既不同于一氧化氮(NO),也不同于前列环素(PGI2)的活性成分,可能是花生四烯酸的非前列腺素类代谢物或细胞色素P450,也可能是K+或H2O2。EDHF可激活钙依赖性钾通道,诱导平滑肌膜电位超极化,诱发内皮依赖性舒血管反应。在病理状态下,尤其是NO通路障碍时,EDHF通路发挥重要作用。因此深入研究EDHF的药理学特征已形成心血管学科的又一热点。
关键词 内皮依赖性超极化作用;一氧化氮;钾通道;膜电位;内皮源性舒张因子
内,以血管平滑肌细胞膜电位变化为观察的技术指
标,发现内皮细胞释放的活性因子,有的能引起平滑肌细胞膜超极化,其中包括NO、PG类、cGMP。除此之外,近来还发现一个或一类活性因子,由内皮细胞合成并释放,诱导平滑肌细胞膜电位超极化,其化学本质又不同于NO、PG类,不依赖于cGMP,其内皮依赖性超极化作用不受一氧化氮合酶(NOS)及环氧酶抑制剂的影响,且对格列苯脲(ATP敏感性K通道抑制剂)不敏感。凡满足上述所有条件的内皮细胞活性因子即定义为血管内皮细胞超极化因子(endothelium-derivedhyperpolarizingfactor,ED-HF)。EDHF引起的超极化是平滑肌细胞膜的钙依赖性钾通道开放,致使K+外流而引起平滑肌超极化所致。心血管疾病状态时,EDHF释放减少,其内皮依赖性超极化作用明显减弱。
多种生物活性因子可诱发EDHF的释放,例如:Ach作用于内皮细胞乙酰胆碱激活蛋白,可介导EDHF释放[1～2]。与EDRF/NO相似,EDHF具有内皮细胞依赖性与Ca内流/释放的依赖性;均可被Ach、缓激肽、P物质、组胺、血栓素等激动剂激活而舒张血管;静息时有基础释放,对保持小血管的适当张力与器官灌流有益。与EDRF/NO不同,当Ach引起血管舒张时,虽然在大血管大部分可被NOS抑制剂或美蓝所消除,但并不完全。这部分舒张不依赖于cGMP的升高,但伴有平滑肌细胞膜电位的超极化,故认为是EDHF引起的;EDHF主要舒张小的阻力血管,不同于EDRF/NO,主要舒张大血管。
至今对EDHF本质的认识尚不充分,不同的血管,不同的种属及所用的激动剂不同,所观察到的EDHF的药理学性质也各不相同,众说纷纭,而对EDHF的研究近几年进展很快,其意义重大,本文旨在对EDHF的本质及其机制进行探讨。1 EDHF的化学本质
早期在研究Ach诱导的持续性血管舒张反应过程中,发现有一短暂的超极化现象。Taylor等1988年认为是由于内皮细胞释放EDHF所致,其化学本质依不同的种属和激动剂而不同。
:,+2+
+
血管内皮细胞除具有通透屏障和物质运输功能
外,还参与调节血管张力,调节血小板功能,调节凝血和纤溶系统机制,参与血管壁的修复和重塑等。内皮细胞上有多种受体,是多种药物及内源性配体(如Ach,BK,P-物质,组织胺,5-HT,凝血酶,ADP等)的作用靶点。当内皮细胞功能受损时,会促成动脉粥样硬化、高血压、血栓等心血管疾病的发生和发展。血管内皮细胞释放多种活性物质:如前列环素(PGI2),是强烈的血管平滑肌舒张剂,扩张血管,并抑制血小板聚集;EDRF/NO生成后,扩散到平滑肌,使其舒张,扩散到血管腔,抑制血小板与内皮细胞间的粘附,防止血栓形成;内皮素(ET)的作用则相反,收缩血管,促进血管平滑肌增生与细胞粘附;内皮细胞还分泌蛋白C、蛋白S、组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)及纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)、血栓调节蛋白(TM)等而维持内皮细胞抗栓功能。内皮细胞合成并释放的生物活性因子成为心血管药理学研究的热点之一。
在寻找内皮细胞来源的活性因子的研究领域
2001-01-30收稿,2001-04-02修回
＊
国家重点基础研究发展规划项目(国家973计划:G199805112)
汪 海,男,36岁,研究员,博士生导师
作者简介:陈冬梅,女,29岁,硕士研究生;
·250·
中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBulletin 2001Jun;17(3)
EDHF[3]。早期的离子流动研究表明:用Ach后,可检测到K+标志物86Rb从血管丢失,说明有K+从内皮释出,参与的K通道位于平滑肌上。认为:有两
+
种不同的K通道亚型:一种charybdotoxin敏感型,另一种是apamine敏感型[4]。charybdotoxin和a-pamine敏感性的K+通道在大鼠主动脉内皮细胞上已被确证。
[K+]0的微量增加引起的相关舒张反应有两种可解释的机制:①在某些血管,可能有Na,K-ATP酶激活参与,K+的效应可被ouabain抑制[5]。②在其它血管,当[K+]0升高后,Ba2+敏感性内向整流K通道增加K传导并介导超极化反应。促进K+外流,引起内皮细胞超极化,并促进Ca2+内流,这将促进EDHF的释放。在去内皮肝动脉[K]0增至5mmol·L时仍可产生平滑肌超极化,超极化强度与内皮完整时相同,这一结果支持下列观点:EDHF与血管内皮释出K+的是相同的。当内皮细胞被激动剂,如:Ach激活时,K+也从内皮细胞释放[7]。
在大鼠肝动脉上,Ach引起平滑肌内皮依赖性超极化,该作用可被charybdotoxin+apamine抑制,而iberiotoxin+apamine无效。K+取消Ach和K+诱发的膜电位的增加。这些结果表明:EDHF是在内皮通过经charybdotoxin和apamine敏感性K+通道外流产生,伴随Ach诱发的胞内Ca2+增加。
K+可产生内皮依赖性超极化反应,但K+不是唯一的EDHF。研究表明,除K外,还有EETs等均可能为EDHF。
1.2 AA代谢物 AA经环氧酶、脂氧酶及细胞色素P450代谢为一系列产物。H2O2的衍生物被过氧化物酶代谢为HETEs,HETEs在某些血管组织中诱发舒张。在兔主动脉,AA诱发的舒张被脂氧酶的代谢产物经激活钾通道而调节。离体兔主动脉环以NE收缩,AA诱导浓度依赖性的舒张,Charybotoxin[CTX,卡律蝎毒素,高通量K+Ca通道(BK+Ca)抑制剂]对AA诱导的舒张反应没有影响,而apamin[蜂毒明肽,低通量KCa通道(SKCa)抑制剂]显著减弱AA诱导的舒张。Iberiotoxin(伊比利亚毒素)也显著减弱AA引起的舒张。Iberiotoxin+a-pamin可最大程度抑制AA诱导的舒张。
许多EDRFs家族已被确定。包括NO、PGI2、EETs。在兔主动脉,AA并不引起cAMP和cGMP的增加。调节AA诱发兔主动脉舒张的因子用生物测定法,HPLC化学结构及气固色谱分析等已确-,,,[8]
+
++
+
-1
+
+
[6]+
+
+
15-THETAs。目前尚不清楚哪个异构体是活性代谢物,因此15-族THETAs代表了内皮源性舒张因子家族的新成员,包括PGI2、NO和EETs。
1.3 EETs(环氧化二十碳三烯5,8,11-酸) 4种EETs的异构体(5,6-;8,9-;11,12-及14,15-EET),它们为AA经细胞色素P450单氧酶的代谢物。它们与EDHF的特性有几点共同点:在豚鼠冠脉、大鼠肝动脉、肠系膜动脉上,17-octadecynoicacid(17-硬脂酸,17-ODYA,细胞色素P450单氧酶抑制剂),不抑制EDHF介导的舒张反应,在豚鼠颈动脉和大鼠肠系膜动脉上,也不影响EDHF调节的血管平滑肌的超极化。在猪冠脉上:EETs诱发浓度依赖性舒张反应,17-octadecynoicacid在猪冠脉上抑制ED-HF介导的超极化反应,表明:在猪冠脉上EETs可能就是EDHF。在猪冠脉上,PLA2和PLC参与了EDHF的合成和释放[9]。EETs和EDHF均激活血管平滑肌钾通道,K通道阻滞剂对AA和11,12-EET有相似的效应,证明:AA在内皮转变为EETs。1.4 L-瓜氨酸 在兔主动脉上,内皮依赖性舒张反应主要归因于NO,L-瓜氨酸通过作用于前房促尿钠排泄的肽类受体.导致血管平滑肌超极化。1.5 内皮大麻素 在大鼠肠系膜动脉上:另一种AA相关的脂类,内皮大麻素anandamide,可能是EDHF。已确定有两种大麻素受体亚型(CB1,
[10]CB2),全身应用anandamide可通过CB1受体的
+
激活诱发低血压。
2 内皮依赖性超极化机制
2.1 电传导 内皮细胞和平滑肌细胞间超极化的电传导是一个尚未解决的重要问题。虽然BK能使这两种细胞同时超极化。但不能用电流注入(说明两种细胞间电不绝缘)或注射荧光黄(说明两种细胞间有间隙相通)引起同样反应。提示这是由电传导或极为短暂的介质所致。在兔颈静脉,forskolin激活腺苷酸环化酶,从而通过间隙连接引起EDHF样的舒张反应,cAMP可能通过间隙连接由内皮扩散至平滑肌。胞内cAMP升高与血管舒张和超极化密切相关,cAMP在内皮形成后经间隙连接扩散,经PKA介导的磷酸化,使肌球蛋白轻链磷酸化,平滑肌K+Ca通道开放增加[11]。
2.2 内皮细胞膜电位 内皮细胞的超极化可能由细胞内Ca2+升高,引起膜上钙依赖性钾通道开放而引起。因为内皮细胞缺乏典型的电压依赖性钙通道(VDC),Ca内流,进入超极化细胞,依赖于电化学梯度的增加。内皮细胞也可释放缓激肽、腺嘌呤、核,2+
中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBulletin 2001Jun;17(3)
·251·
调节。
2.3 平滑肌细胞对EDHF的应答 K+传导增加引起内皮介导的平滑肌细胞超极化,因为,超极化时:①平滑肌细胞膜电导增加;②内皮依赖的超极化强度被细胞外K+浓度依赖性地减少;③放射性铷流增加;④在某些情况下,内皮依赖的超极化可被钾通道阻滞剂阻止;⑤EDHF的作用与钾通道开放剂
所致超极化引起的松弛作用平行。钾通道,特别是钙依赖性钾通道的作用所以被重视是因为它能导致比Na+,K+-ATP酶更大的跨膜电流,只要其开放率增加少许即可引起膜非常大的超极化。
钾通道开放剂松弛平滑肌的机制,可能通过抑制PLC,抑制了三磷酸肌醇和二酰基甘油的生成,从而抑制了细胞内的Ca
2+
HF介导的舒张反应。猪冠脉释放的EDHF很可能是细胞色素P450环氧酶合成的EET。11,12-EET和5,6-EET均激活SKCa通道。EDHF激活
2+
Erk1/2部分是Ca依赖性机制,Erk1/2的激活对平滑肌细胞的迁移和增生是必需的,Erk1/2的激活导致c-fos和c-jun的激活和核移位。2.8 细胞色素P4502C(CYP2C8/34)在冠脉为EDHF合成酶[16] β-naphthoiflavone诱导猪冠脉内皮细胞色素P4502C8/34则促进11,12-EET的生成,后者引起与EDHF相同的超极化和舒张反应。CYP诱生剂β-naphthoflavone通过诱生CYP依赖性EDHF促进平滑肌超极化,CYP抑制剂可直接影响K+Ca通道活性[17]。用反转录PCR筛选猪主动脉和人肺静脉,人冠脉及肺微血管内皮细胞培养物。在待测的CYP单氧酶中,只有CYP2C8符合EDHF合成酶的标准。为确定CYP2C8/34与EDHF生成之间的功能上的联系,用离体的内皮完整的猪冠脉在加入naphthoflavone孵育时则内皮细胞上CYP2CmRNA和蛋白的表达增加。去内皮的PCA上检测不到CYP2C信号。
2.9 ATP敏感性K+通道(KATP)不参与EDHF介导的超极化 Ach诱发的超极化不受格列苯脲影响,但可被charybdotoxin+apamine取消,这支持以前的结论:KATP不参与EDHF介导的超极化3 血管性疾病时EDHF的改变
[18]
+
[15]
的释放和蛋白激酶C的
作用,这些作用可能都是由超极化引起的,因为可以用升高细胞外K+浓度或用钾通道阻滞剂阻滞。2.4 Kv通道和SK+Ca通道参与EDHF超极化 在豚鼠颈动脉上,Kv通道和SK+Ca通道一起参与EDHF超极化,4-AP选择性抑制之[12]。血管平滑肌细胞上有两种主要的Kv通道①Ka(快激活型)②Kv(s)(慢激活型),在豚鼠颈动脉上,Ach通过ED-HF诱发内皮依赖性超极化。由于格列苯脲和Ba
+
+
2+
并不抑制EDHF介导的超极化,所以KATP和内向整流K通道并不参与超极化,BKCa通道也不参与超极化,因为孵育可逆转EDHF的效应,但apamine+iberiotoxin却无效。
2.5 钙信号 应用fura-2分析及张力记录证明:EDHF的形成受胞内Ca浓度调节。加入PhE刺激收缩后,NO、EDHF显著释放,加入PhE后,cGMP的生成是基础释放的2～3倍[13]。由于内皮细胞上无αCa2+从平l肾上腺素能受体,所以认为:滑肌移至邻近的内皮细胞并刺激NO释放,此效应可被L-NAME阻断。apamine敏感性K+通道只有在内皮细胞中存在
[14]
2+
。
正常血管,内皮依赖性松弛作用以NO-cGMP
机制占主导地位,心血管疾病时,NO的生成和利用受到干扰,cGMP生成减少,在这种情况下EDHF机制可能很重要。SHR尽管NO释放正常,但内皮依赖性舒张反应明显减弱,这至少应部分归因于ED-HF释放减少。无论高血压的人或动物,内皮依赖性舒张反应减弱,其机制各异,抗高血压治疗后,内皮功能改善,减弱的内皮依赖性超极化反应改善[19]。主动脉细胞膜上单通道K+流测定表明:SHR与WKY相比,KCa通道的功能改变了。抗高血压治疗可改善SHR上Ach引起的内皮依赖性超极化和舒张反应,而对NO调节的舒张反应无影响。表明:EDHF系统在内皮功能失调及应用药物治疗后其功能改善方面起关键作用。动脉粥样硬化时,血管内皮依赖性舒张反应减弱,可能因为NO释放减少[20]。动物实验表明:内皮依赖性舒张反应的异常是心血管疾病的早期改变。在大动脉上,NO和EDHF起同等重要的作用,而在微血管起重要作用的是EDHF,因为:①微血管释放更多的EDHF;+
,但charybdotoxin敏感性K
+
通道既存在于内皮细胞上,也存在于平滑肌细胞上。2.6 L-型电压依赖性Ca2+通道的失活
EDHF
发挥舒张的一个重要机制是抑制l,4,5-IP3生成及后来降低Ca2+从胞内钙库释放,抑制受体操纵性Ca
2+
内流。
2.7 EDHF促进Tyr磷酸化,并激活Erkl/2 ED-HF不仅仅是血管扩张剂.它的持续释放(尤其是生物活性NO水平降低的主动脉)可能在调节细胞信号和基因调控方面起作用。在许多血管中细胞色素
·252·
中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBulletin 2001Jun;17(3)
7 GordonJL,MartinW.Endothelium-dependentrelaxationofthe
pigaorta:relationshiptostimulationof
86
舒血管效应由静息膜电位和激动剂诱发的超极化反应共同决定;微血管中,EDHF更易扩散到平滑肌层,大血管中EDHF扩散到平滑肌层的T1/2太短。
4 未来的研究方向
到目前为止,EDHF的化学结构及性质等尚不清楚,在未来的研究中,内皮依赖性血管松弛机制还存在许多问题有待研究;进一步研究EDHF的主要目的在于鉴定出一种或多种内皮细胞内释放的足量时能引起平滑肌超极化的介质,并同时找出相应的抑制剂。阐明不是通过增加内皮细胞内Ca浓度,从而增加钙依赖性钾通道活性,就是通过细胞自分泌介质引发的内皮细胞超极化和随后内皮依赖性松弛反应之间的关系。内皮细胞和平滑肌细胞间存在的电信号如何传导,以及导致内皮细胞和平滑肌细胞超极化的细胞内信号的传导问题。研究EDHF的化学结构及性质,EDHF和EDRF及PGI2之间的相互作用,细胞膜超极化与疾病的关系将成为重点课题。
参考文献
1
JamesH.Differentialofendothelialfunctiononvasodilatorre-sponseinseries-arrangedarterioles.Microvascularreseach,1992;44:61～72
2 AnnaKM.Hammarstroml.BrJPharmacol,1999;126:421～83 EdwardsG,DoraKA,GardenerMJetal.K
+
Rbeffuxfromisolated
endothelialcells.BrJPharmacol,1983;79:531～41
8 PfisterSL,Campbe1lWB.Arachidonicacidandacetylcholine-in-ducedrelaxationsofrabbitaorta.Hypertension,1992;20:682～9
9 MombouliJV,vanhouttePM.Endothelialdysfunction:Anovel
therapeutictargetEndothelialdysfunctionfromphysiologytother-apy.JMolCellCardio,1999;31:61～74
10 HowlettAC.Pharmacologyofcannabinoidreceptors.AnnuRewPharmacolToxicol,1995;35:607～34
11 GriffithTM,TaylorHJ.Biochemicalandbiophysicalresearch.
Communications,1999;263:52～7
12 FaraciFM,HeistadDD.Regulationofthecerebralcirculation:
Roleofendotheliumandpotassunmchannel.PhysiologicalRe-view,1998;78:54～75
13 HiguchiY,NishimuarJ,KobayashiSetal.CPAinducesasus-tainedincreasein[Ca+]i,ofendothelialcellsinsituandrelaxesporcinecoronary.AmJPhysi,1996;270:H2038～49
14 MistryDK,GarlandCJ.Characteristicsofsingle,large-conductane
calcium-dependentpotassiumchannels(BKCa)fromsmoothmusclecellsisolatedfromtherabbitmesentericaxtery.JMembraneBi-ol,1998;164:125～38
15 GebremedhinD,MaYH,FalckJRetal,Mechanismofactionofcerebralepoxyeicosatrienoicacidsoncerebralarterialsmoothmus-cle.AmJPhysiol,1992;263:H519～25
16 FisslthalerB,PoppR,KissLetal.CytochromeP4502Cisan
EDHFsythaseincoronaryarteries.Nature,1999;401:493～617 AlvarezJ,MoteroM,Garcia-SanchoJ.Highaffinityinhibihonof
Ca2+-dependentK+channelsbycytochromeP450inhibitors.JBiolChem,1992;267:11789～93
18 MichelFeleton.Endothe1ialdysfunction:Anoveltherapeutictar-get.Thealternative.EDHFJMolCellCardiol,1999;31:15～22
19 VerbeurenTJ,JordaensFH,ZonnekeynLLetal.Effectofhy-percholesterolemiaonvascularreactivityintherabbit1Endotheli-um-dependentandendotheliumindependentcontractionsandre-laxationsiniso1atedarteriesofcontro1andhypercholesterolemicrabbits.CircRes,1986;58:552～64
20 TakaseH,MoreauR,KungCFatal.Antihypertensivetherapypreventsendotheialdysfunctioninchronicoxidedeficiency:Effect
ofverapamilandtrandocapril.Hypertension,1996;27:25～31
2+
isanendothelium
derivedhyperpolarizingfactorinratarteries.Nature,1998;396:
269～72
4 TayorSG,WestonAH.Endothelium-derivedhyperpolarizingfac-tor:Anewendogenousinhibitorfromthevascularendothelium.TrendsPharmacolSci,1988;9:272～4
5 HendrickxH,CasteelsR.ElectrogenicsodiumPumpinarterial
smoothmusclecells.PfugersArch,l974;346:299～3066 KnotHJ,ZimmermannPA,Ne1sonMTE.PExtracelluarK-in-ducedhyperPolarizationsanddilationsofratcoronaryandcerebralareriesinvolveinwardrectifierK492:419～30
+
+
channels.JPhysiol,1996;
Endothelium-derivedhyperpolarizingfactor
CHENDong-Mei,WANGHai(InstituteofPharmacologyandToxicology,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Beijing 100850)ABSTRACT Thereisanotherfactorinvolvinginen-dothelium-dependentrelaxationbesidesNO,whichisindependentofcGMP,EDHF.Itshyperpolarizationmechanismmayberelatedtotheopenofcalcium-de-pendentKchannels(KCa).NO,PGI2,H2O2andcytochromeP450-derivedmetaboliteofarachidonicacidareallthecandidatesofEDHF.Inthenormalbloodvessels,theinfluenceofEDHFonendothelium-+
+
dependentrelaxationislittle.Butinsomediseases,
whentheproductionandeffectofNOisdisturbed,themechanismofEDHFmayplayaspeciallyimpor-tantrole.
KEYWORDS endothelium-dependenthyerpolariza-tion;nitricoxide;potassiumchannels;membranepotential;endothelium-derivedrelaxingfactor
中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBulletin 2001Jun;17(3):249～52
·249·
血管内皮细胞超极化因子＊
陈冬梅 汪 海
(军事医学科学院毒物药物研究所,北京 100850)
中国图书分类号 R-05;R322.12;R349.21;R914.3文献标识码 A 文章编号 1001-1978(2001)03-0249-04摘要 内皮细胞释放多种重要的生物活性物质,调节血管张力、血液纤溶与凝血机制、脂蛋白代谢、免疫反应等重要生命过程。内皮细胞释放的超极化因子(EDHF)是一类既不同于一氧化氮(NO),也不同于前列环素(PGI2)的活性成分,可能是花生四烯酸的非前列腺素类代谢物或细胞色素P450,也可能是K+或H2O2。EDHF可激活钙依赖性钾通道,诱导平滑肌膜电位超极化,诱发内皮依赖性舒血管反应。在病理状态下,尤其是NO通路障碍时,EDHF通路发挥重要作用。因此深入研究EDHF的药理学特征已形成心血管学科的又一热点。
关键词 内皮依赖性超极化作用;一氧化氮;钾通道;膜电位;内皮源性舒张因子
内,以血管平滑肌细胞膜电位变化为观察的技术指
标,发现内皮细胞释放的活性因子,有的能引起平滑肌细胞膜超极化,其中包括NO、PG类、cGMP。除此之外,近来还发现一个或一类活性因子,由内皮细胞合成并释放,诱导平滑肌细胞膜电位超极化,其化学本质又不同于NO、PG类,不依赖于cGMP,其内皮依赖性超极化作用不受一氧化氮合酶(NOS)及环氧酶抑制剂的影响,且对格列苯脲(ATP敏感性K通道抑制剂)不敏感。凡满足上述所有条件的内皮细胞活性因子即定义为血管内皮细胞超极化因子(endothelium-derivedhyperpolarizingfactor,ED-HF)。EDHF引起的超极化是平滑肌细胞膜的钙依赖性钾通道开放,致使K+外流而引起平滑肌超极化所致。心血管疾病状态时,EDHF释放减少,其内皮依赖性超极化作用明显减弱。
多种生物活性因子可诱发EDHF的释放,例如:Ach作用于内皮细胞乙酰胆碱激活蛋白,可介导EDHF释放[1～2]。与EDRF/NO相似,EDHF具有内皮细胞依赖性与Ca内流/释放的依赖性;均可被Ach、缓激肽、P物质、组胺、血栓素等激动剂激活而舒张血管;静息时有基础释放,对保持小血管的适当张力与器官灌流有益。与EDRF/NO不同,当Ach引起血管舒张时,虽然在大血管大部分可被NOS抑制剂或美蓝所消除,但并不完全。这部分舒张不依赖于cGMP的升高,但伴有平滑肌细胞膜电位的超极化,故认为是EDHF引起的;EDHF主要舒张小的阻力血管,不同于EDRF/NO,主要舒张大血管。
至今对EDHF本质的认识尚不充分,不同的血管,不同的种属及所用的激动剂不同,所观察到的EDHF的药理学性质也各不相同,众说纷纭,而对EDHF的研究近几年进展很快,其意义重大,本文旨在对EDHF的本质及其机制进行探讨。1 EDHF的化学本质
早期在研究Ach诱导的持续性血管舒张反应过程中,发现有一短暂的超极化现象。Taylor等1988年认为是由于内皮细胞释放EDHF所致,其化学本质依不同的种属和激动剂而不同。
:,+2+
+
血管内皮细胞除具有通透屏障和物质运输功能
外,还参与调节血管张力,调节血小板功能,调节凝血和纤溶系统机制,参与血管壁的修复和重塑等。内皮细胞上有多种受体,是多种药物及内源性配体(如Ach,BK,P-物质,组织胺,5-HT,凝血酶,ADP等)的作用靶点。当内皮细胞功能受损时,会促成动脉粥样硬化、高血压、血栓等心血管疾病的发生和发展。血管内皮细胞释放多种活性物质:如前列环素(PGI2),是强烈的血管平滑肌舒张剂,扩张血管,并抑制血小板聚集;EDRF/NO生成后,扩散到平滑肌,使其舒张,扩散到血管腔,抑制血小板与内皮细胞间的粘附,防止血栓形成;内皮素(ET)的作用则相反,收缩血管,促进血管平滑肌增生与细胞粘附;内皮细胞还分泌蛋白C、蛋白S、组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)及纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)、血栓调节蛋白(TM)等而维持内皮细胞抗栓功能。内皮细胞合成并释放的生物活性因子成为心血管药理学研究的热点之一。
在寻找内皮细胞来源的活性因子的研究领域
2001-01-30收稿,2001-04-02修回
＊
国家重点基础研究发展规划项目(国家973计划:G199805112)
汪 海,男,36岁,研究员,博士生导师
作者简介:陈冬梅,女,29岁,硕士研究生;
·250·
中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBulletin 2001Jun;17(3)
EDHF[3]。早期的离子流动研究表明:用Ach后,可检测到K+标志物86Rb从血管丢失,说明有K+从内皮释出,参与的K通道位于平滑肌上。认为:有两
+
种不同的K通道亚型:一种charybdotoxin敏感型,另一种是apamine敏感型[4]。charybdotoxin和a-pamine敏感性的K+通道在大鼠主动脉内皮细胞上已被确证。
[K+]0的微量增加引起的相关舒张反应有两种可解释的机制:①在某些血管,可能有Na,K-ATP酶激活参与,K+的效应可被ouabain抑制[5]。②在其它血管,当[K+]0升高后,Ba2+敏感性内向整流K通道增加K传导并介导超极化反应。促进K+外流,引起内皮细胞超极化,并促进Ca2+内流,这将促进EDHF的释放。在去内皮肝动脉[K]0增至5mmol·L时仍可产生平滑肌超极化,超极化强度与内皮完整时相同,这一结果支持下列观点:EDHF与血管内皮释出K+的是相同的。当内皮细胞被激动剂,如:Ach激活时,K+也从内皮细胞释放[7]。
在大鼠肝动脉上,Ach引起平滑肌内皮依赖性超极化,该作用可被charybdotoxin+apamine抑制,而iberiotoxin+apamine无效。K+取消Ach和K+诱发的膜电位的增加。这些结果表明:EDHF是在内皮通过经charybdotoxin和apamine敏感性K+通道外流产生,伴随Ach诱发的胞内Ca2+增加。
K+可产生内皮依赖性超极化反应,但K+不是唯一的EDHF。研究表明,除K外,还有EETs等均可能为EDHF。
1.2 AA代谢物 AA经环氧酶、脂氧酶及细胞色素P450代谢为一系列产物。H2O2的衍生物被过氧化物酶代谢为HETEs,HETEs在某些血管组织中诱发舒张。在兔主动脉,AA诱发的舒张被脂氧酶的代谢产物经激活钾通道而调节。离体兔主动脉环以NE收缩,AA诱导浓度依赖性的舒张,Charybotoxin[CTX,卡律蝎毒素,高通量K+Ca通道(BK+Ca)抑制剂]对AA诱导的舒张反应没有影响,而apamin[蜂毒明肽,低通量KCa通道(SKCa)抑制剂]显著减弱AA诱导的舒张。Iberiotoxin(伊比利亚毒素)也显著减弱AA引起的舒张。Iberiotoxin+a-pamin可最大程度抑制AA诱导的舒张。
许多EDRFs家族已被确定。包括NO、PGI2、EETs。在兔主动脉,AA并不引起cAMP和cGMP的增加。调节AA诱发兔主动脉舒张的因子用生物测定法,HPLC化学结构及气固色谱分析等已确-,,,[8]
+
++
+
-1
+
+
[6]+
+
+
15-THETAs。目前尚不清楚哪个异构体是活性代谢物,因此15-族THETAs代表了内皮源性舒张因子家族的新成员,包括PGI2、NO和EETs。
1.3 EETs(环氧化二十碳三烯5,8,11-酸) 4种EETs的异构体(5,6-;8,9-;11,12-及14,15-EET),它们为AA经细胞色素P450单氧酶的代谢物。它们与EDHF的特性有几点共同点:在豚鼠冠脉、大鼠肝动脉、肠系膜动脉上,17-octadecynoicacid(17-硬脂酸,17-ODYA,细胞色素P450单氧酶抑制剂),不抑制EDHF介导的舒张反应,在豚鼠颈动脉和大鼠肠系膜动脉上,也不影响EDHF调节的血管平滑肌的超极化。在猪冠脉上:EETs诱发浓度依赖性舒张反应,17-octadecynoicacid在猪冠脉上抑制ED-HF介导的超极化反应,表明:在猪冠脉上EETs可能就是EDHF。在猪冠脉上,PLA2和PLC参与了EDHF的合成和释放[9]。EETs和EDHF均激活血管平滑肌钾通道,K通道阻滞剂对AA和11,12-EET有相似的效应,证明:AA在内皮转变为EETs。1.4 L-瓜氨酸 在兔主动脉上,内皮依赖性舒张反应主要归因于NO,L-瓜氨酸通过作用于前房促尿钠排泄的肽类受体.导致血管平滑肌超极化。1.5 内皮大麻素 在大鼠肠系膜动脉上:另一种AA相关的脂类,内皮大麻素anandamide,可能是EDHF。已确定有两种大麻素受体亚型(CB1,
[10]CB2),全身应用anandamide可通过CB1受体的
+
激活诱发低血压。
2 内皮依赖性超极化机制
2.1 电传导 内皮细胞和平滑肌细胞间超极化的电传导是一个尚未解决的重要问题。虽然BK能使这两种细胞同时超极化。但不能用电流注入(说明两种细胞间电不绝缘)或注射荧光黄(说明两种细胞间有间隙相通)引起同样反应。提示这是由电传导或极为短暂的介质所致。在兔颈静脉,forskolin激活腺苷酸环化酶,从而通过间隙连接引起EDHF样的舒张反应,cAMP可能通过间隙连接由内皮扩散至平滑肌。胞内cAMP升高与血管舒张和超极化密切相关,cAMP在内皮形成后经间隙连接扩散,经PKA介导的磷酸化,使肌球蛋白轻链磷酸化,平滑肌K+Ca通道开放增加[11]。
2.2 内皮细胞膜电位 内皮细胞的超极化可能由细胞内Ca2+升高,引起膜上钙依赖性钾通道开放而引起。因为内皮细胞缺乏典型的电压依赖性钙通道(VDC),Ca内流,进入超极化细胞,依赖于电化学梯度的增加。内皮细胞也可释放缓激肽、腺嘌呤、核,2+
中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBulletin 2001Jun;17(3)
·251·
调节。
2.3 平滑肌细胞对EDHF的应答 K+传导增加引起内皮介导的平滑肌细胞超极化,因为,超极化时:①平滑肌细胞膜电导增加;②内皮依赖的超极化强度被细胞外K+浓度依赖性地减少;③放射性铷流增加;④在某些情况下,内皮依赖的超极化可被钾通道阻滞剂阻止;⑤EDHF的作用与钾通道开放剂
所致超极化引起的松弛作用平行。钾通道,特别是钙依赖性钾通道的作用所以被重视是因为它能导致比Na+,K+-ATP酶更大的跨膜电流,只要其开放率增加少许即可引起膜非常大的超极化。
钾通道开放剂松弛平滑肌的机制,可能通过抑制PLC,抑制了三磷酸肌醇和二酰基甘油的生成,从而抑制了细胞内的Ca
2+
HF介导的舒张反应。猪冠脉释放的EDHF很可能是细胞色素P450环氧酶合成的EET。11,12-EET和5,6-EET均激活SKCa通道。EDHF激活
2+
Erk1/2部分是Ca依赖性机制,Erk1/2的激活对平滑肌细胞的迁移和增生是必需的,Erk1/2的激活导致c-fos和c-jun的激活和核移位。2.8 细胞色素P4502C(CYP2C8/34)在冠脉为EDHF合成酶[16] β-naphthoiflavone诱导猪冠脉内皮细胞色素P4502C8/34则促进11,12-EET的生成,后者引起与EDHF相同的超极化和舒张反应。CYP诱生剂β-naphthoflavone通过诱生CYP依赖性EDHF促进平滑肌超极化,CYP抑制剂可直接影响K+Ca通道活性[17]。用反转录PCR筛选猪主动脉和人肺静脉,人冠脉及肺微血管内皮细胞培养物。在待测的CYP单氧酶中,只有CYP2C8符合EDHF合成酶的标准。为确定CYP2C8/34与EDHF生成之间的功能上的联系,用离体的内皮完整的猪冠脉在加入naphthoflavone孵育时则内皮细胞上CYP2CmRNA和蛋白的表达增加。去内皮的PCA上检测不到CYP2C信号。
2.9 ATP敏感性K+通道(KATP)不参与EDHF介导的超极化 Ach诱发的超极化不受格列苯脲影响,但可被charybdotoxin+apamine取消,这支持以前的结论:KATP不参与EDHF介导的超极化3 血管性疾病时EDHF的改变
[18]
+
[15]
的释放和蛋白激酶C的
作用,这些作用可能都是由超极化引起的,因为可以用升高细胞外K+浓度或用钾通道阻滞剂阻滞。2.4 Kv通道和SK+Ca通道参与EDHF超极化 在豚鼠颈动脉上,Kv通道和SK+Ca通道一起参与EDHF超极化,4-AP选择性抑制之[12]。血管平滑肌细胞上有两种主要的Kv通道①Ka(快激活型)②Kv(s)(慢激活型),在豚鼠颈动脉上,Ach通过ED-HF诱发内皮依赖性超极化。由于格列苯脲和Ba
+
+
2+
并不抑制EDHF介导的超极化,所以KATP和内向整流K通道并不参与超极化,BKCa通道也不参与超极化,因为孵育可逆转EDHF的效应,但apamine+iberiotoxin却无效。
2.5 钙信号 应用fura-2分析及张力记录证明:EDHF的形成受胞内Ca浓度调节。加入PhE刺激收缩后,NO、EDHF显著释放,加入PhE后,cGMP的生成是基础释放的2～3倍[13]。由于内皮细胞上无αCa2+从平l肾上腺素能受体,所以认为:滑肌移至邻近的内皮细胞并刺激NO释放,此效应可被L-NAME阻断。apamine敏感性K+通道只有在内皮细胞中存在
[14]
2+
。
正常血管,内皮依赖性松弛作用以NO-cGMP
机制占主导地位,心血管疾病时,NO的生成和利用受到干扰,cGMP生成减少,在这种情况下EDHF机制可能很重要。SHR尽管NO释放正常,但内皮依赖性舒张反应明显减弱,这至少应部分归因于ED-HF释放减少。无论高血压的人或动物,内皮依赖性舒张反应减弱,其机制各异,抗高血压治疗后,内皮功能改善,减弱的内皮依赖性超极化反应改善[19]。主动脉细胞膜上单通道K+流测定表明:SHR与WKY相比,KCa通道的功能改变了。抗高血压治疗可改善SHR上Ach引起的内皮依赖性超极化和舒张反应,而对NO调节的舒张反应无影响。表明:EDHF系统在内皮功能失调及应用药物治疗后其功能改善方面起关键作用。动脉粥样硬化时,血管内皮依赖性舒张反应减弱,可能因为NO释放减少[20]。动物实验表明:内皮依赖性舒张反应的异常是心血管疾病的早期改变。在大动脉上,NO和EDHF起同等重要的作用,而在微血管起重要作用的是EDHF,因为:①微血管释放更多的EDHF;+
,但charybdotoxin敏感性K
+
通道既存在于内皮细胞上,也存在于平滑肌细胞上。2.6 L-型电压依赖性Ca2+通道的失活
EDHF
发挥舒张的一个重要机制是抑制l,4,5-IP3生成及后来降低Ca2+从胞内钙库释放,抑制受体操纵性Ca
2+
内流。
2.7 EDHF促进Tyr磷酸化,并激活Erkl/2 ED-HF不仅仅是血管扩张剂.它的持续释放(尤其是生物活性NO水平降低的主动脉)可能在调节细胞信号和基因调控方面起作用。在许多血管中细胞色素
·252·
中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBulletin 2001Jun;17(3)
7 GordonJL,MartinW.Endothelium-dependentrelaxationofthe
pigaorta:relationshiptostimulationof
86
舒血管效应由静息膜电位和激动剂诱发的超极化反应共同决定;微血管中,EDHF更易扩散到平滑肌层,大血管中EDHF扩散到平滑肌层的T1/2太短。
4 未来的研究方向
到目前为止,EDHF的化学结构及性质等尚不清楚,在未来的研究中,内皮依赖性血管松弛机制还存在许多问题有待研究;进一步研究EDHF的主要目的在于鉴定出一种或多种内皮细胞内释放的足量时能引起平滑肌超极化的介质,并同时找出相应的抑制剂。阐明不是通过增加内皮细胞内Ca浓度,从而增加钙依赖性钾通道活性,就是通过细胞自分泌介质引发的内皮细胞超极化和随后内皮依赖性松弛反应之间的关系。内皮细胞和平滑肌细胞间存在的电信号如何传导,以及导致内皮细胞和平滑肌细胞超极化的细胞内信号的传导问题。研究EDHF的化学结构及性质,EDHF和EDRF及PGI2之间的相互作用,细胞膜超极化与疾病的关系将成为重点课题。
参考文献
1
JamesH.Differentialofendothelialfunctiononvasodilatorre-sponseinseries-arrangedarterioles.Microvascularreseach,1992;44:61～72
2 AnnaKM.Hammarstroml.BrJPharmacol,1999;126:421～83 EdwardsG,DoraKA,GardenerMJetal.K
+
Rbeffuxfromisolated
endothelialcells.BrJPharmacol,1983;79:531～41
8 PfisterSL,Campbe1lWB.Arachidonicacidandacetylcholine-in-ducedrelaxationsofrabbitaorta.Hypertension,1992;20:682～9
9 MombouliJV,vanhouttePM.Endothelialdysfunction:Anovel
therapeutictargetEndothelialdysfunctionfromphysiologytother-apy.JMolCellCardio,1999;31:61～74
10 HowlettAC.Pharmacologyofcannabinoidreceptors.AnnuRewPharmacolToxicol,1995;35:607～34
11 GriffithTM,TaylorHJ.Biochemicalandbiophysicalresearch.
Communications,1999;263:52～7
12 FaraciFM,HeistadDD.Regulationofthecerebralcirculation:
Roleofendotheliumandpotassunmchannel.PhysiologicalRe-view,1998;78:54～75
13 HiguchiY,NishimuarJ,KobayashiSetal.CPAinducesasus-tainedincreasein[Ca+]i,ofendothelialcellsinsituandrelaxesporcinecoronary.AmJPhysi,1996;270:H2038～49
14 MistryDK,GarlandCJ.Characteristicsofsingle,large-conductane
calcium-dependentpotassiumchannels(BKCa)fromsmoothmusclecellsisolatedfromtherabbitmesentericaxtery.JMembraneBi-ol,1998;164:125～38
15 GebremedhinD,MaYH,FalckJRetal,Mechanismofactionofcerebralepoxyeicosatrienoicacidsoncerebralarterialsmoothmus-cle.AmJPhysiol,1992;263:H519～25
16 FisslthalerB,PoppR,KissLetal.CytochromeP4502Cisan
EDHFsythaseincoronaryarteries.Nature,1999;401:493～617 AlvarezJ,MoteroM,Garcia-SanchoJ.Highaffinityinhibihonof
Ca2+-dependentK+channelsbycytochromeP450inhibitors.JBiolChem,1992;267:11789～93
18 MichelFeleton.Endothe1ialdysfunction:Anoveltherapeutictar-get.Thealternative.EDHFJMolCellCardiol,1999;31:15～22
19 VerbeurenTJ,JordaensFH,ZonnekeynLLetal.Effectofhy-percholesterolemiaonvascularreactivityintherabbit1Endotheli-um-dependentandendotheliumindependentcontractionsandre-laxationsiniso1atedarteriesofcontro1andhypercholesterolemicrabbits.CircRes,1986;58:552～64
20 TakaseH,MoreauR,KungCFatal.Antihypertensivetherapypreventsendotheialdysfunctioninchronicoxidedeficiency:Effect
ofverapamilandtrandocapril.Hypertension,1996;27:25～31
2+
isanendothelium
derivedhyperpolarizingfactorinratarteries.Nature,1998;396:
269～72
4 TayorSG,WestonAH.Endothelium-derivedhyperpolarizingfac-tor:Anewendogenousinhibitorfromthevascularendothelium.TrendsPharmacolSci,1988;9:272～4
5 HendrickxH,CasteelsR.ElectrogenicsodiumPumpinarterial
smoothmusclecells.PfugersArch,l974;346:299～3066 KnotHJ,ZimmermannPA,Ne1sonMTE.PExtracelluarK-in-ducedhyperPolarizationsanddilationsofratcoronaryandcerebralareriesinvolveinwardrectifierK492:419～30
+
+
channels.JPhysiol,1996;
Endothelium-derivedhyperpolarizingfactor
CHENDong-Mei,WANGHai(InstituteofPharmacologyandToxicology,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Beijing 100850)ABSTRACT Thereisanotherfactorinvolvinginen-dothelium-dependentrelaxationbesidesNO,whichisindependentofcGMP,EDHF.Itshyperpolarizationmechanismmayberelatedtotheopenofcalcium-de-pendentKchannels(KCa).NO,PGI2,H2O2andcytochromeP450-derivedmetaboliteofarachidonicacidareallthecandidatesofEDHF.Inthenormalbloodvessels,theinfluenceofEDHFonendothelium-+
+
dependentrelaxationislittle.Butinsomediseases,
whentheproductionandeffectofNOisdisturbed,themechanismofEDHFmayplayaspeciallyimpor-tantrole.
KEYWORDS endothelium-dependenthyerpolariza-tion;nitricoxide;potassiumchannels;membranepotential;endothelium-derivedrelaxingfactor