实验一 絮凝技术预处理发酵液及其滤饼的质量比阻测定（见教材）
实验三 PEG/（NH4）2SO4 两水相系统的相图（见教材）
实验二 利用盐析和等电点沉淀法从牛奶中制备酪蛋白
1 实验目的
掌握盐析和等电点沉淀法的原理和基本操作。
2 实验原理
乳蛋白广泛存在于乳制品中，牛奶中主要含有酪蛋白，酪蛋白在pH 4.8是沉淀，乳蛋白素则在pH=3左右才会沉淀。利用这一性质可以先将降至4.8，或者是在加热至40℃的牛奶中加人硫酸钠，将酪蛋白沉淀出来。酪蛋白不溶于乙醇，利用乙醇可以除去杂质。将除掉酪蛋白的溶液pH调至3左右，使乳蛋白素沉淀析出。可以得到乳蛋白素。
3 实验器材
烧杯；玻璃试管；离心管；磁力搅拌器；pH计；离心机等。
4 试剂和材料
⑴ 试剂与材料
脱脂牛乳；无水硫酸钠；HCL；氢氧化钠；滤纸；pH试纸；浓盐酸；乙醇； 0.2mol/L pH 4.8醋酸-醋酸钠缓冲液。
⑵ 缓冲溶液的配制
0.2mol/L pH 4.8醋酸-醋酸钠缓冲液（先配A液与B液）：
A液：0.2mol/L醋酸钠溶液 称NaAC·3H2O 54.44g，定容至2000mL。
B液：0.2mol/L醋酸溶液，取醋酸（含量大于99.8%）12 mL定容至1000mL。 取A液1770mL，B液1230mL混合即得pH4.8的醋酸—醋酸钠缓冲液3000mL。 5 操作步骤
1）盐析法制备酪蛋白
① 将50mL牛乳倒至烧杯中，40℃搅拌；
② 方法一：在烧杯中缓缓加入10g无水硫酸钠，之后再继续搅拌10min；
方法二：在搅拌下慢慢加入预热至40℃、pH 4.8的醋酸缓冲液100mL.用精密
pH试纸或酸度计调pH至4.8。
③ 用细布过滤分别收集沉淀和滤液。将沉淀放于30mL乙醇中倾倒于布氏漏斗
中过滤除去乙醇溶液，抽干。将沉淀从布氏漏斗中移出，在表面皿中展开除去乙醇，干燥后得到酪蛋白。准确称量。
2）等电点沉淀法制备乳蛋白素
将操作1）所得到的滤液置于烧杯中，一边搅拌，一边利用pH计测量酸度，并用盐酸调整pH至3。然后倒至离心管中6000r/min离心15min，倒掉上清液。在离心管中加入10mL去离子水，震荡，使管内下层物重新悬浮，并以0.1mol/L氢氧化钠溶液调pH至8.5-9.0，此时大部分蛋白质均会溶解。
将上述溶液6000r/min离心10min后将上层液倒入50mL烧杯中，将烧杯置于磁力搅拌器中搅拌并调整pH至3.0。
将上述溶液以6000r/min离心10min，倒掉上层液。沉淀取出干燥称量。 6 结果与讨论
⑴ 计算每100mL牛乳中制备出的酪蛋白数量，并与理论产量3.5％相比较； ⑵ 求出实际获得百分数；
⑶ 计算出每100mL牛乳所制备的乳蛋白素数量；
⑷ 讨论影响得率的因素。
实验四 离子交换层析分离氨基酸
一、目的要求
1．熟悉离子交换层析技术的基本原理和方法
2．熟悉离子交换层析分离氨基酸的基本原理和操作
二、实验原理
本实验采用磺酸型阳子交换树脂（732型）分离酸性氨基酸（天冬氨酸Asp pI=2.97）和硷性氨基酸(赖氨酸Lys pI=9.74)的混合液。在pH5.3条件下，因为低于Lys的pI值，Lys可解离成阳离子挂在树脂上；高于Asp的pI值，则Asp可解离为阴离子，不能被树脂吸附而直接流出色谱柱，在pH 12条件下，因高于Lys的pI值，Lys又解离为阴离子从树脂上被交换下来，这样通过改变洗脱液的pH值可使它们被分别洗脱而达到分离的目的。
三、试剂和器材
1．试剂
①树脂：磺酸型阳离子交换树脂（732型）
②洗脱液：0.45mol/L、pH5.3柠檬酸缓冲液，取285克柠檬酸（C6O7H8·H2O）；186克97％NaOH；105ml浓盐酸溶于水稀释至10升。（配2升）
0.01mol/L pH12NaOH缓冲液，取4克NaOH溶于10升蒸馏水。（配2升）
③样品液：0.005mol/L Asp和Lys的0.02mol/L HCl混合溶液。（Asp MW:133.1） ④显色剂：0.5%茚三酮无水丙酮溶液。
2．器材
①玻璃色谱柱： (2.5cm×18cm)。
②以收度试管手工操作（试管，滴管或刻度吸管，量筒，烧杯，漏斗，铁架台） ③721型分光光度计、天平。
④水浴锅。
四、实验步骤
1、树脂的处理
新树脂的处理见注1，本实验采用处理好的树脂。
2、装柱：将色谱柱垂直装好，关闭柱底出口，在柱内注入约
缓冲液。
将浮选后已转成钠型的树脂置于烧杯中，加进1～2倍体积的柠檬酸缓冲液，经抽气处理后，搅成悬浮状沿柱内壁细心地把柱灌满，倒时不要太快，以免产生泡沫。待树脂在柱底部逐渐沉积2～3cm高时，用吸管吸去柱内上层所出现的清液，慢慢打开柱底出口，继续加
注树脂悬液，直至柱体装到
在装柱时要避免使柱内液体流干而使装柱失败，另外树脂悬液的温度要相对恒定（特别是对于采用高温法）。装好的柱体应该没有纹路，没有裂痕，没有气泡和柱顶表面平整而均匀，这样方可投入使用，否则要重装。
3、平衡：柱装好后接上预先调好的恒流泵，用柠檬酸缓冲液以24ml/hr的流速平衡，
pH5.3），这大约需要2～3倍床体积。
4、加样与洗脱：移去柱上的液器塞，打开柱底出口，小心使柱内液体流至柱表面时即要过快，以免冲坏树脂表面，加样后慢慢打开柱底阀，使液面再与树脂面相齐时关闭，然后再用吸管吸取适量洗脱液如此清洗柱内壁四周1～2次。洗涤后，用缓冲液在柱内加到约2cm
高的液层，然后接上恒流泵，调流速0.5ml/分即开始洗脱。
5、收集：
6、改换高pH洗脱收集：关闭恒流泵及柱底阀，将恒流泵管内的柠檬洗脱液更换成
7、测定：（注2）将收集的各管编号后，分别取0.5ml收集液于一洁净的干试管中，加入1ml pH5.3柠檬酸洗脱缓冲液，0.5ml茚三酮试剂
然后水冷却5～10分钟，加3m1 60％乙醇衡稀释，摇匀后用721型分光光度计在570nm处比色。测定后，以光密度为纵坐标，收集的管数或毫升数为横坐标绘制洗脱曲线。
8、再生，对于装好的柱使用几次后需要0.2mol/L NaOH溶液洗脱，再用蒸馏水洗至中性后重复使用。（省略）
注：1、对于市售的干树脂其处理方法为：先经水充分溶胀后，倾去上面的泥状细粒，反复洗几次直到水澄清为止，然后经浮选得到颗粒大小合适的树脂，浮选后用4倍量的2mol/LHCl和2mol/L NaOH依次浸洗，每次半小时，换酸或碱时用水先将树脂洗至中性，最后树脂应处理至溶液无黄色。这时再用1mol/L NaOH使树脂转成钠型（对于其它的转型要视实验和树脂的情况而定），在蒸馏水洗至中性备用。
2、氨基酸的测定一般要求在pH5左右，这样在本实验中，改变pH后和洗脱液就不能直接进行测定。所以在第7步测定时要加入1ml pH5.3的柠檬酸缓冲液。
实验五 纸电泳分离鉴定氨基酸
一. 实验目的
了解纸电泳法分离带电颗粒的原理
掌握氨基酸纸电泳分离和鉴别方法
二. 实验原理
氨基酸是两性物质，其带电荷的情况与溶液的pH值有关，当溶液的pH值低于其等电点时，带正电荷，反之，带负电荷。谷氨酸等电点pH为3.22，甘氨酸为5.97，赖氨酸为9.47，在pH=5.97的缓冲溶液中，谷氨酸带负电荷，赖氨酸带正电荷，甘氨酸基本不带电荷。在电场的作用下，谷氨酸向正极移动，赖氨酸向负极移动，而甘氨酸则停留不动，从而使三种氨基酸的混合物得到分离。将标准物质与样品在同一张滤纸上按同样操作条件进行电泳，显色后根据组分的运动距离和方向与标准物对照可进行定性，根据组分斑点大小和颜色的深浅可进行初步定量。
三、仪器与试剂
1.仪器 Dy-1型电泳仪、10μl 微量注射器、喷雾器、吹风筒等
2.试剂
(1)电泳缓冲溶液pH=6.0：称取5.5g邻苯二甲酸氢钾，0.8g氢氧化钠分别溶解，混合后定容至1000mL。
电泳显色缓冲液：在上述缓冲液中含0.5%茚三酮
(2)样品溶液
①赖氨酸溶液（6g/L）：称取120mg组氨酸，加水溶解后定容20mL， ②甘氨酸溶液（8g/L）：配法同上，
③谷氨酸溶液（6g/L）：配法同上，
④试样混合液：上述三种氨基酸溶液等体积混合。
(3)0.5%茚三酮丙酮溶液：称取500mg茚三酮，用少量丙酮溶解后，再用丙酮稀释至100mL。
3．新华1号滤纸条或层析滤纸条(60mm×80mm)。
四、实验步骤
1．点样
点样的方法有干点法和湿点法两种。干点法是将样品溶液点在滤纸上，用电吹风吹干，它的优点是可以反复点样，在点样的过程中起到浓缩的作用，湿点法是先将滤纸浸透缓冲溶液后再点样，它的优点是能保持样品的天然状态，而且样品溶液不易扩散，斑点的直径较小，本实验采用湿法点样。
（1）取层析滤纸条，用铅笔按下图画出中线及原点标记，注明正负极方向及名称。
(2)把滤纸条用木夹固定在支架上，用滴管吸取缓冲溶液从滤纸顶部往下淋洗2-3次，使滤纸湿透，然后用电吹风吹去多余的缓冲溶液。
(3)取下滤纸条，分别用不同的微量注射器吸取单种氨基酸溶液1uL，混合氨基酸溶液2uL点在滤纸的原点上。
2．电泳
(1)加缓冲溶液1000mL于电泳槽中，并使槽内液面平衡。
(2)接上整流器交流电源，使整流器预热1-2分钟。
(3)用镊子小心夹着纸条的一端将纸条放在电泳槽的支架上，两端紧贴架框，边缘浸入缓冲溶液中，用滴管滴加缓冲溶液到滤纸上，使原点以外的其他位置更为湿润(注意不要滴在原点上)然后盖上电泳槽盖。
(4)关闭整流器电源，把电泳槽与整流器连接好。
(5)打开整流电源开关，调节电压旋钮使电压达到260伏，
(6)电泳40分钟。关闭电源，用镊子迅速取出纸条，用木夹夹在木支架上，用电吹风吹干。
3．显色
用喷雾器把茚三酮丙酮溶液喷在纸条上，然后用电吹风的热风档吹干，即见样品的紫色斑点，显色反应如下：
五、定性分析
以单种氨基酸在纸上显示出的位置与混合氨基酸各组分斑点的位置比较进行定性。
思 考 题
1．试根据三种氨基酸的化学性质解释它们在电泳后的斑点位置。
2．进行定性分析时，单种氨基酸标准溶液与混合氨基酸的试样能否分别点在不同的滤纸上进行电泳？为什么？
实验一 絮凝技术预处理发酵液及其滤饼的质量比阻测定（见教材）
实验三 PEG/（NH4）2SO4 两水相系统的相图（见教材）
实验二 利用盐析和等电点沉淀法从牛奶中制备酪蛋白
1 实验目的
掌握盐析和等电点沉淀法的原理和基本操作。
2 实验原理
乳蛋白广泛存在于乳制品中，牛奶中主要含有酪蛋白，酪蛋白在pH 4.8是沉淀，乳蛋白素则在pH=3左右才会沉淀。利用这一性质可以先将降至4.8，或者是在加热至40℃的牛奶中加人硫酸钠，将酪蛋白沉淀出来。酪蛋白不溶于乙醇，利用乙醇可以除去杂质。将除掉酪蛋白的溶液pH调至3左右，使乳蛋白素沉淀析出。可以得到乳蛋白素。
3 实验器材
烧杯；玻璃试管；离心管；磁力搅拌器；pH计；离心机等。
4 试剂和材料
⑴ 试剂与材料
脱脂牛乳；无水硫酸钠；HCL；氢氧化钠；滤纸；pH试纸；浓盐酸；乙醇； 0.2mol/L pH 4.8醋酸-醋酸钠缓冲液。
⑵ 缓冲溶液的配制
0.2mol/L pH 4.8醋酸-醋酸钠缓冲液（先配A液与B液）：
A液：0.2mol/L醋酸钠溶液 称NaAC·3H2O 54.44g，定容至2000mL。
B液：0.2mol/L醋酸溶液，取醋酸（含量大于99.8%）12 mL定容至1000mL。 取A液1770mL，B液1230mL混合即得pH4.8的醋酸—醋酸钠缓冲液3000mL。 5 操作步骤
1）盐析法制备酪蛋白
① 将50mL牛乳倒至烧杯中，40℃搅拌；
② 方法一：在烧杯中缓缓加入10g无水硫酸钠，之后再继续搅拌10min；
方法二：在搅拌下慢慢加入预热至40℃、pH 4.8的醋酸缓冲液100mL.用精密
pH试纸或酸度计调pH至4.8。
③ 用细布过滤分别收集沉淀和滤液。将沉淀放于30mL乙醇中倾倒于布氏漏斗
中过滤除去乙醇溶液，抽干。将沉淀从布氏漏斗中移出，在表面皿中展开除去乙醇，干燥后得到酪蛋白。准确称量。
2）等电点沉淀法制备乳蛋白素
将操作1）所得到的滤液置于烧杯中，一边搅拌，一边利用pH计测量酸度，并用盐酸调整pH至3。然后倒至离心管中6000r/min离心15min，倒掉上清液。在离心管中加入10mL去离子水，震荡，使管内下层物重新悬浮，并以0.1mol/L氢氧化钠溶液调pH至8.5-9.0，此时大部分蛋白质均会溶解。
将上述溶液6000r/min离心10min后将上层液倒入50mL烧杯中，将烧杯置于磁力搅拌器中搅拌并调整pH至3.0。
将上述溶液以6000r/min离心10min，倒掉上层液。沉淀取出干燥称量。 6 结果与讨论
⑴ 计算每100mL牛乳中制备出的酪蛋白数量，并与理论产量3.5％相比较； ⑵ 求出实际获得百分数；
⑶ 计算出每100mL牛乳所制备的乳蛋白素数量；
⑷ 讨论影响得率的因素。
实验四 离子交换层析分离氨基酸
一、目的要求
1．熟悉离子交换层析技术的基本原理和方法
2．熟悉离子交换层析分离氨基酸的基本原理和操作
二、实验原理
本实验采用磺酸型阳子交换树脂（732型）分离酸性氨基酸（天冬氨酸Asp pI=2.97）和硷性氨基酸(赖氨酸Lys pI=9.74)的混合液。在pH5.3条件下，因为低于Lys的pI值，Lys可解离成阳离子挂在树脂上；高于Asp的pI值，则Asp可解离为阴离子，不能被树脂吸附而直接流出色谱柱，在pH 12条件下，因高于Lys的pI值，Lys又解离为阴离子从树脂上被交换下来，这样通过改变洗脱液的pH值可使它们被分别洗脱而达到分离的目的。
三、试剂和器材
1．试剂
①树脂：磺酸型阳离子交换树脂（732型）
②洗脱液：0.45mol/L、pH5.3柠檬酸缓冲液，取285克柠檬酸（C6O7H8·H2O）；186克97％NaOH；105ml浓盐酸溶于水稀释至10升。（配2升）
0.01mol/L pH12NaOH缓冲液，取4克NaOH溶于10升蒸馏水。（配2升）
③样品液：0.005mol/L Asp和Lys的0.02mol/L HCl混合溶液。（Asp MW:133.1） ④显色剂：0.5%茚三酮无水丙酮溶液。
2．器材
①玻璃色谱柱： (2.5cm×18cm)。
②以收度试管手工操作（试管，滴管或刻度吸管，量筒，烧杯，漏斗，铁架台） ③721型分光光度计、天平。
④水浴锅。
四、实验步骤
1、树脂的处理
新树脂的处理见注1，本实验采用处理好的树脂。
2、装柱：将色谱柱垂直装好，关闭柱底出口，在柱内注入约
缓冲液。
将浮选后已转成钠型的树脂置于烧杯中，加进1～2倍体积的柠檬酸缓冲液，经抽气处理后，搅成悬浮状沿柱内壁细心地把柱灌满，倒时不要太快，以免产生泡沫。待树脂在柱底部逐渐沉积2～3cm高时，用吸管吸去柱内上层所出现的清液，慢慢打开柱底出口，继续加
注树脂悬液，直至柱体装到
在装柱时要避免使柱内液体流干而使装柱失败，另外树脂悬液的温度要相对恒定（特别是对于采用高温法）。装好的柱体应该没有纹路，没有裂痕，没有气泡和柱顶表面平整而均匀，这样方可投入使用，否则要重装。
3、平衡：柱装好后接上预先调好的恒流泵，用柠檬酸缓冲液以24ml/hr的流速平衡，
pH5.3），这大约需要2～3倍床体积。
4、加样与洗脱：移去柱上的液器塞，打开柱底出口，小心使柱内液体流至柱表面时即要过快，以免冲坏树脂表面，加样后慢慢打开柱底阀，使液面再与树脂面相齐时关闭，然后再用吸管吸取适量洗脱液如此清洗柱内壁四周1～2次。洗涤后，用缓冲液在柱内加到约2cm
高的液层，然后接上恒流泵，调流速0.5ml/分即开始洗脱。
5、收集：
6、改换高pH洗脱收集：关闭恒流泵及柱底阀，将恒流泵管内的柠檬洗脱液更换成
7、测定：（注2）将收集的各管编号后，分别取0.5ml收集液于一洁净的干试管中，加入1ml pH5.3柠檬酸洗脱缓冲液，0.5ml茚三酮试剂
然后水冷却5～10分钟，加3m1 60％乙醇衡稀释，摇匀后用721型分光光度计在570nm处比色。测定后，以光密度为纵坐标，收集的管数或毫升数为横坐标绘制洗脱曲线。
8、再生，对于装好的柱使用几次后需要0.2mol/L NaOH溶液洗脱，再用蒸馏水洗至中性后重复使用。（省略）
注：1、对于市售的干树脂其处理方法为：先经水充分溶胀后，倾去上面的泥状细粒，反复洗几次直到水澄清为止，然后经浮选得到颗粒大小合适的树脂，浮选后用4倍量的2mol/LHCl和2mol/L NaOH依次浸洗，每次半小时，换酸或碱时用水先将树脂洗至中性，最后树脂应处理至溶液无黄色。这时再用1mol/L NaOH使树脂转成钠型（对于其它的转型要视实验和树脂的情况而定），在蒸馏水洗至中性备用。
2、氨基酸的测定一般要求在pH5左右，这样在本实验中，改变pH后和洗脱液就不能直接进行测定。所以在第7步测定时要加入1ml pH5.3的柠檬酸缓冲液。
实验五 纸电泳分离鉴定氨基酸
一. 实验目的
了解纸电泳法分离带电颗粒的原理
掌握氨基酸纸电泳分离和鉴别方法
二. 实验原理
氨基酸是两性物质，其带电荷的情况与溶液的pH值有关，当溶液的pH值低于其等电点时，带正电荷，反之，带负电荷。谷氨酸等电点pH为3.22，甘氨酸为5.97，赖氨酸为9.47，在pH=5.97的缓冲溶液中，谷氨酸带负电荷，赖氨酸带正电荷，甘氨酸基本不带电荷。在电场的作用下，谷氨酸向正极移动，赖氨酸向负极移动，而甘氨酸则停留不动，从而使三种氨基酸的混合物得到分离。将标准物质与样品在同一张滤纸上按同样操作条件进行电泳，显色后根据组分的运动距离和方向与标准物对照可进行定性，根据组分斑点大小和颜色的深浅可进行初步定量。
三、仪器与试剂
1.仪器 Dy-1型电泳仪、10μl 微量注射器、喷雾器、吹风筒等
2.试剂
(1)电泳缓冲溶液pH=6.0：称取5.5g邻苯二甲酸氢钾，0.8g氢氧化钠分别溶解，混合后定容至1000mL。
电泳显色缓冲液：在上述缓冲液中含0.5%茚三酮
(2)样品溶液
①赖氨酸溶液（6g/L）：称取120mg组氨酸，加水溶解后定容20mL， ②甘氨酸溶液（8g/L）：配法同上，
③谷氨酸溶液（6g/L）：配法同上，
④试样混合液：上述三种氨基酸溶液等体积混合。
(3)0.5%茚三酮丙酮溶液：称取500mg茚三酮，用少量丙酮溶解后，再用丙酮稀释至100mL。
3．新华1号滤纸条或层析滤纸条(60mm×80mm)。
四、实验步骤
1．点样
点样的方法有干点法和湿点法两种。干点法是将样品溶液点在滤纸上，用电吹风吹干，它的优点是可以反复点样，在点样的过程中起到浓缩的作用，湿点法是先将滤纸浸透缓冲溶液后再点样，它的优点是能保持样品的天然状态，而且样品溶液不易扩散，斑点的直径较小，本实验采用湿法点样。
（1）取层析滤纸条，用铅笔按下图画出中线及原点标记，注明正负极方向及名称。
(2)把滤纸条用木夹固定在支架上，用滴管吸取缓冲溶液从滤纸顶部往下淋洗2-3次，使滤纸湿透，然后用电吹风吹去多余的缓冲溶液。
(3)取下滤纸条，分别用不同的微量注射器吸取单种氨基酸溶液1uL，混合氨基酸溶液2uL点在滤纸的原点上。
2．电泳
(1)加缓冲溶液1000mL于电泳槽中，并使槽内液面平衡。
(2)接上整流器交流电源，使整流器预热1-2分钟。
(3)用镊子小心夹着纸条的一端将纸条放在电泳槽的支架上，两端紧贴架框，边缘浸入缓冲溶液中，用滴管滴加缓冲溶液到滤纸上，使原点以外的其他位置更为湿润(注意不要滴在原点上)然后盖上电泳槽盖。
(4)关闭整流器电源，把电泳槽与整流器连接好。
(5)打开整流电源开关，调节电压旋钮使电压达到260伏，
(6)电泳40分钟。关闭电源，用镊子迅速取出纸条，用木夹夹在木支架上，用电吹风吹干。
3．显色
用喷雾器把茚三酮丙酮溶液喷在纸条上，然后用电吹风的热风档吹干，即见样品的紫色斑点，显色反应如下：
五、定性分析
以单种氨基酸在纸上显示出的位置与混合氨基酸各组分斑点的位置比较进行定性。
思 考 题
1．试根据三种氨基酸的化学性质解释它们在电泳后的斑点位置。
2．进行定性分析时，单种氨基酸标准溶液与混合氨基酸的试样能否分别点在不同的滤纸上进行电泳？为什么？