生物技术通报
综述与专论
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
2003年第6期
阿维菌素的生物合成与途径工程
苏建亚 沈晋良
(南京农业大学农业部病虫监测与治理重点开放实验室, 南京210095)
摘 要: 阿维菌素是一种高效安全的大环内酯杀虫杀螨剂。本文介绍了阿维菌素生物合成的步骤及参与合成步骤的有关酶系统和基因簇。对阿维菌素8个组分合成的遗传控制基因, 特别是对其中B 1a 组分合成的遗传控制位点进行讨论分析, 并介绍了利用途径工程改造阿维链霉菌生产合成单一高效组分B 1a 和提高活性组分产量的研究进展。
关键词: 阿维菌素 途径工程 杀虫剂 基因工程 生物合成
Biosynthesis and Pathway Engineering of Abamectin
Su Jianya Shen Jinliang
(K e y L aboratory o f M onitoring and M anagement of Plant Disease and Insects M inistry of
Agr icultu re Nanj ing Agricultur al Univer sity, Na nj ing 210095)
Abstract: Abamectin is a highly effective and safety macrolide insecticide. T his paper reviewed the pathw ay of abamectin biosynthesi s, and the enzyme system and gene cluster involved in the biosynthesis. T he genes that gov ern the synt hesis of 8abamectin components were analyzed, and especially genet ic co ntrolling sites o f the component B 1a synthesis w ere discussed. T he research progr esses achiev ed in the production of single highly effectiv e component B 1a and y ield in -crease of active components w ith the aid of pat hw ay engineer ing to modify Streptomyces av ermitilis were rev iewed.
Key words : A bamectin Pathway eng ineering Insecticide Gene engineer ing Biosynthesis
途径工程(Pathw ay Engineering) 是一门利用分子生物学原理系统分析细胞代谢网络, 并通过DNA 重组技术合理设计细胞代谢途径及进行遗传修饰, 进而完成细胞特性改造的应用性学科。20多年来, 随着DNA 重组技术的日趋成熟, 途径工程的理论和应用也得到了迅速发展, 该领域在工业、生物制药、环境保护、农业等各方面均表现出广阔的应用前景[1]。
在农作物病虫害防治中, 许多农药是由微生物发酵产生, 杀虫剂如阿维菌素、多杀菌素、米拜菌素、南昌霉素, 杀菌剂如井冈霉素等。在弄清这些化合物在微生物体内的生物合成途径与遗传控制机制的基础上, 通过定向改变细胞内代谢途径的分布与代谢流重构代谢网络, 可提高目标代谢物的产量, 提高工业化生产的得率, 降低生产成本。
基金项目:国家自然科学基金项目(39900093)
阿维菌素是由阿维链霉菌(Strep tomyces aver -mitilis ) 产生的大环内酯抗生素类杀虫剂, 是一组由十六元环内酯与一个齐墩果糖生成的苷(图1, 表1) , 在十六元环内酯周围还有一个含有2个六元环的螺缩酮及六氢苯并呋喃环。发酵产物中含有8个结构十分相似的化合物。商业化产品阿维菌素1. 8%乳油中的有效成份80%为阿维菌素B 1a , 20%为阿维菌素B 1b 。将阿维菌素的B1组分选择性还原22与23位不饱和双键而合成的伊维菌素(iver -mectin) , 较原来的阿维菌素对高等动物的毒性大大降低, 伊维菌素商业化产品的有效成份为:伊维菌素B 1a >80%, 伊维菌素B 1b
1 阿维菌素的合成途径
阿维菌素的生物合成可分为3个阶段[2, 3, 4, 5]
(图2) 。
通讯作者:苏建亚, Tel:86-25-4395339; Fax:86-25-4395246; Email:sjy@njau. edu. cn
2003年第6期
苏建亚等:阿维菌素的生物合成与途径工程
19
第一阶段:聚酮链的延伸
大环内酯类抗生素大都属于聚酮类物质, 如红霉
素、雷帕霉素、利福霉素、米拜菌素、泰乐菌素、梅岭霉菌等,
这类聚酮结构的生物合成过程均呈现相似的规
表1 阿维菌素的组分与结构
组分阿维菌素
A 1a A 1b A 2a A 2b B 1a B 1b B 2a B 2b
伊维菌素
B 1a B 1b
R1CH 3CH 3CH 3CH 3H H H H H H
R2C 2H 5CH 3C 2H 5CH 3C 2H 5CH 3C 2H 5CH 3C 2H 5CH 3
X -Y CH =CH CH =CH CH -2CH(OH) CH 2-CH(OH) CH =CH CH =CH CH -2CH(OH) CH -2CH(OH) CH 2-CH 2CH 2-CH
2
图1 阿维菌素的组分与结构
图2 阿维菌素的生物合成途径
律[1, 6]。阿维菌素的聚酮是通过在起始单位(2-甲基-A -A -P -A(P -丙
酰, A -乙酰) 的顺序添加12个酰基缩合而成的。每个,
20 生物技术通报Biote chnology Bulletin
伸循环的初始产物均为 -酮酯, 后者再经历酮基的还原化修饰。这一系列连续的反应系统中, 其催化活性结构域都组织成模件形式, 每个链延伸循环构成一个独立的模件(图3) 。在每个模件中, 有3个必需的结构域用于C -C 键的形成:
(1) -酮脂酰基ACP 合成酶(KS) 缩合2分子的起始单位或缩合1分子的起始单位和1分子的酰基链;
(2) 酰基转移酶(AT ) 将链延伸单位(丙二酸或甲基丙二酸) 转到第三核心结构域的巯基上;
(3) 酰基载体蛋白(ACP)
2003年第6期
上述核心结构域催化形成的酮酯化合物再由一个还原性的结构域进行后续加工, 而该还原性结构域又由烯酰还原酶(ER) 、酮基还原酶(KR) 或脱水酶(DH) 等模件构成。酮基化合物被还原的程度取决于它所选择的还原性结构域的组合模件数目, 例如, KR +DH+ER 型组合导致酮基完全还原到亚甲基; KR +DH 型组合使还原过程停止在双键阶段; 仅含KR 的还原结构域产生的是相应的羟基化合物; 而在还原性结构域不存在的情况下, 酮基将不发生任何转化反应。阿维菌素PKS 结构域的全顺序及其在链延伸模件中的可能次序见图2
。
图3 模件型PKS 的结构域作用和链延伸反应的顺序
第二阶段:起始糖苷配基的修饰产生阿维菌素糖苷配基
聚酮长链合成后的下一步是螺缩酮及呋喃环的闭合, 形成阿维菌素糖苷配基。C2~7位环已环的形成涉及到C2烯酰基和C7羰基间的缩合。C17及C25位螺缩酮的缩合是通过C21位的羰基酮基化形成的。C6和C8a 间呋喃环是在C8a 的烯丙基甲基上引入氧原子后形成的, 该过程由细胞色素P450羟化酶催化。
:利用脱氧胸苷二磷酸(dTDP)-齐墩果糖在C13和C4 上进行O -糖基化, 将齐墩果糖转移到阿维菌素糖苷配基上, 最后形成阿维菌素。齐墩果糖合成的途径类似于鼠李糖的生物合成, 由一系列酶所催化, 齐墩果糖C3位上的甲基则来源于甲硫氨酸。
2 阿维菌素生物合成的基因簇及有关酶
阿维菌素完整的生物合成基因簇是用含ave D 基因的DNA 片段作为探针杂交一个粘粒基因组文库而得到的, 连同旁侧序列共克隆和测序了82kb 的
2003年第6期
苏建亚等:阿维菌素的生物合成与途径工程
21
4所示, 共含有18个开放阅读框[5, 7, 8]。
中心区为聚酮合成酶基因, 有4个阅读框, 该区因转录方向不同分为2组:aveA1-aveA2和aveA3-aveA4, 它们负责合成阿维菌素的聚酮部分。阿维菌(AVES1,AVES2, AVES3, AVES4) 组成, 共含有12个模件, 每个模件都催化新一轮聚酮链的延伸(图2) 。AVES1的分子量为414kDa, 含有聚酮链延伸的最初2个模件, AVES2(666kDa) 含有接下去的4个模件, 将链延伸到C13结构, AVES3(575kDa) 含有3个模件, 将链延伸到C17结构, AVES4(510kDa) 含有3个模件, 负责完成聚酮链的最终形成(图2) 。所有的12个模件均含有 -酮脂酰基ACP 合成酶(KS) 、
酰基转移酶(AT) 和酰基载体蛋白(ACP) 结构域。第一和最后一个模件还编码了独特的结构域, 聚酮链的起始反应需要起始酰基转移酶和酰基载体蛋白结构
域将酰基基团装载到PKS 上, 这些结构域已在基ACP 合成酶结构域, 其聚酮链终止反应要求一个硫酯酶结构域来释放完成的聚酮并形成内酯, 这个硫酯酶结构域存在于AVES4的C 端, 靠近模件12的酰基载体蛋白结构域。在阿维菌素聚酮合成酶中, 模件1、4、5和10中还有一个 -酮脂酰基ACP 还原酶结构域(KR) , 在模件3和11中则没有KR, 模件2、6、7、8、9和12中还有KR 和脱氢酶(DH)
。
素聚酮合成酶(PKS) 很复杂, 由4个多功能蛋白AVES1的N 端得到了鉴定, 靠近模件1的 -酮脂酰
图4 阿维菌素生物合成基因簇图谱
两组PKS 之间还有aveC 和aveE 两个开放阅读I , aveBIII , av eBI V , aveB V, aveBVI , aveB VII 和
框(图4) , 分别临近于av eA 2和aveA 3, aveC 在翻译aveBII I ) 负责脱氧糖的合成, 第8个基因ave BI 编码上是与aveA 2偶联的, 但其功能还不清楚, 可能与聚酮的后修饰有关。aveE 可能是与aveA 3和aveA 4在同一转录单元上, aveE 的C 端氨基酸序列类似于细胞色素P450脱氢酶, 可能与C6与C8a 间呋喃环的形成有关。
在PKS 基因右边还检测到了9个开放阅读框, 这些基因的序列与dTDP -脱氧糖合成酶及转糖基酶有明显的类似性。靠近AveA 4的第一个开放阅读框orf 1类似于还原酶, 但该基因产物在阿维菌素生物合成中可能是起作用的。齐墩果糖合成和转糖基作(-糖基转移酶, 将齐墩果糖转移到来源于聚酮的糖苷配基上。
在PKS 基因左侧的3个开放阅读框主要负责最初合成的糖基的修饰, 其中2个在ave A1的上游, 涉及到起始糖苷配基的修饰。A ve D 紧靠在av e A1的上游, 编码O -甲基转移酶, 催化将S -腺苷甲硫氨酸的甲基转移到阿维菌素B 组分的C5位上, 形成阿维菌素的A 组分。在ave D 的下游位点是ave F 基因, 编码C5-酮还原酶。最后一个开放阅读框ave R 位于ave F 的左边, 该基因的转录方向与ave D -ave F 相
22 生物技术通报Biote chnology Bulletin
合成的有关基因及推定功能见表2。
2003年第6期
阿维链霉菌发酵产生8个组分(见图1) , 其中只有B 1a 和B 1b 两个组分有较高杀虫活性, 特别是B 1a 的活性最高。这8个组分在结构上的差异集中在3个
3 阿维菌素生产的途径控制
3. 1 通过途径工程构建生产单一组分的菌株
表2 阿维菌素生物合成基因簇中开放阅读框的推定功能
多肽AVES1
装载结构域 模件1 模件2AVES2 模件3 模件4 模件5 模件6AVERS 3 模件7 模件8 模件9AVES4 模件10 模件11 模件12ORF1A v eBI A v eBII A v eBIII A v eBI V A v eBV A v eBVI A v eBVII A v eBVIII A v eC A v eD A v eE A v e F A v eR
氨基酸数目
3952
推定功能或序列类似性
PKS KS KS PKS KS KS KS KS PKS KS KS KS PKS KS KS KS 还原酶?
AT(M B) AT(P) AT(A) AT(A) AT(A) AT(A) AT(P) AT(P) AT(A) AT(P) AT(A) AT(P) AT(A)
KR KR
ACP ACP ACP ACP ACP ACP ACP ACP ACP ACP ACP ACP ACP
DH
6239
DH DH *DH DH
KR KR KR KR KR KR KR
5532
4881
DH KR T E
[***********][***********]302949
糖基转移酶
dTDP -葡萄糖4, 6-脱氢酶 -D -葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶dTDP -4-酮基-6-脱氧-L -已糖4-还原酶dTDP -4-酮基-6-脱氧已糖3, 5-差向异构酶dTDP -4-酮基-6-脱氧-L -已糖2, 3-脱氢酶dTDP -6-脱氧-L -已糖3-O -甲基转移酶dTDP -4-酮基-6-脱氧-L -已糖2, 3-还原酶?
C5位上O -甲基转移酶细胞色素P450羟化酶C5位上酮还原酶正向调控
位置上, 在生物合成途径中, 这3个位点有关的酶及合成控制见表3。
日本的Ikeda 和 mura [3, 4, 9, 10]分离到2个突变株K2021和K2034。在K2021菌株中, 作为聚酮链
表3 阿维菌素的组分及合成控制位点
C5位上的R 1
C25位上的R 2 C22-23键型
CH 3H C 2H 5CH 3
CH 2=CH 2CH -CH(OH) 2
组分
A B a b 12
生物合成控制位点ave D 编码的O -甲基转移酶失活将甲基转移到 B 组分的C5位上形成 A 组分起始单位为2-甲基丁酸起始单位为异丁酸模件2中有KR 和DH 模件2中有KR
生物合成控制方法使aveD 编码的O -甲基转移酶失活可阻止 B 组分转变为 A 组分
抑制异丁酸的前体缬氨酸的掺入可阻止 b 组分的产生尚不明确
a
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K2034仅产生 B 组分, 则是由于该株系ave D 基因发生点突变, C5位O -甲基转移酶失活, 该酶催化将 B 组分转变为 A 组分。通过将K2021和K2034株进行杂交得到了仅产生阿维菌素B 1a 和B 2a 而不产生其它组分的菌株。进一步, 在仅产生
B 1a 和B 2a 的重组株K2038中通过PCR 的方法在aveC 区域引入点突变, 这样得到了仅产生单一组分B 2a 的菌株, B 2a 组分可通过化学加氢的方法再转变为毒性较低的伊维菌素B 1a 。3. 2 C5-氧-阿维菌素B 的生产
从阿维菌素基本结构出发, 对某些基团进行适当修饰, 合成阿维菌素的新衍生物, 是农药创新的重要途径之一。在这些衍生物中, C5-氧-阿维菌素B 衍生物就可增加其活性
[11, 12]
Stutzman -Engw all 等[16]克隆了两个基因aveR 1和aveR 2, 这两个基因负责调控聚酮合成酶基因的表达与阿维菌素合成酶基因的表达, 他们发现使这两个基因中的任何一个基因或同时两个基因失活将会使
阿维菌素产量有大幅度的提高。他们构建这两个基因替换质粒载体pSE210、pSE214, 与宿主染色体发生重组后分别得到了aveR 1、aveR 2基因缺失的和aveR2基因失活的突变株, 突变株的产量比原菌株提高了3. 1~3. 4倍。
参考文献
1 张惠民. 途径工程 第三代基因工程. 北京:中国轻工业出版
社, 2002, 151~201.
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9514.
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9 Ikeda H, mura S. J Antibiot (Tokyo) , 1995, 48(7) :549~562. 10 Ik eda H, Pang CH, Endo H, et al. J Antibiot (Tokyo) , 1995, 48
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11 Pang CH, M atsuzaki K, Ikeda H, et al. J Antibiot (T okyo) , 1995,
48(1) :92~94.
12 Pang CH, M atsuzaki K, Ikeda H, et al. J Antibiot (T okyo) , 1995,
48(1) :59~66.
13 陈芝, 宋渊, 文莹, 等. 微生物学报, 2001, 41(4) :440~445. 14 Cropp A, Ch en S , Liu H, et al. J Ind M icrobiol Biotechnol, 2001,
27(6) :368~377.
15 Stutzman -Engwall KJ, US Patent, 6248579, 2001. 16 Stutxman -Engwall KJ, US Patent, 6197591, 2001.
。Ikeda 等
[12]
在研究aveD
和aveF 基因的功能时, 曾在aveF 内部引入移码突
变, 导致客观存在编码的5-酮基还原酶失活, 不能将C5位的酮基还原成OH, 因此即便由aveD 编码的C5-氧-甲基转移酶存在, 也不能将C5位酮基甲基化, 该突变株只能产生C5-氧-阿维菌素B 。中国农业大学的陈芝等
[1]
采用破坏aveD 基因的策略, 将7. 0kb
的pCZ2质粒通过同源重组到染色体的aveD 基因中, 因质粒内部可能有终止子序列, 导致了下游aveF 的不能表达, 因而合成的产物也是C5-氧-阿维菌素B, 该产物经肟基化后, 其杀虫活性更高3. 3 提高阿维菌素中B1 B2的比例
野生型阿维链霉菌合成的B1 B2一般为1 2, 如果能提高此比例将会减少工业化提取程序[14]。Stutzman -Engw all 等人[15]构建了一系列含有aveC 基因野生和突变阅读框的重组表达质粒, 找到了可提高此比例的重组表达质粒, 引入宿主后与染色体发生重组, 最后得到了一系列比例提高的突变株, 有的达2. 5 1左右。
3. 4 aveR 基因失活提高阿维菌素产量
[13]
。
(上接第17页)
18 燕义唐. 植物学报, 1992, 34(12) :899~906.
19 张新春, 庄炳昌, 等. 吉林农业科学, 2002, 27(2) :17~21. 20 杜娟. 吉林农业科学, 2000, 25(2) :38~40. 21 任春梅. 生物学杂志, 2001-8, 18(4) :29~32. .
22 谭振波. 生物技术通报, 2000, 6:9~13.
23 高丽丽. Journal of T ropical M edici n e, 2001-8, 1(1) :76~79. 24 叶健明. 生命科学, 1999-4, 11(2) :58~60.
25 柳展基. 沈阳农业大学学报, 2001-12, 32(6) :465~468.
生物技术通报
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摘 要: 阿维菌素是一种高效安全的大环内酯杀虫杀螨剂。本文介绍了阿维菌素生物合成的步骤及参与合成步骤的有关酶系统和基因簇。对阿维菌素8个组分合成的遗传控制基因, 特别是对其中B 1a 组分合成的遗传控制位点进行讨论分析, 并介绍了利用途径工程改造阿维链霉菌生产合成单一高效组分B 1a 和提高活性组分产量的研究进展。
关键词: 阿维菌素 途径工程 杀虫剂 基因工程 生物合成
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Su Jianya Shen Jinliang
(K e y L aboratory o f M onitoring and M anagement of Plant Disease and Insects M inistry of
Agr icultu re Nanj ing Agricultur al Univer sity, Na nj ing 210095)
Abstract: Abamectin is a highly effective and safety macrolide insecticide. T his paper reviewed the pathw ay of abamectin biosynthesi s, and the enzyme system and gene cluster involved in the biosynthesis. T he genes that gov ern the synt hesis of 8abamectin components were analyzed, and especially genet ic co ntrolling sites o f the component B 1a synthesis w ere discussed. T he research progr esses achiev ed in the production of single highly effectiv e component B 1a and y ield in -crease of active components w ith the aid of pat hw ay engineer ing to modify Streptomyces av ermitilis were rev iewed.
Key words : A bamectin Pathway eng ineering Insecticide Gene engineer ing Biosynthesis
途径工程(Pathw ay Engineering) 是一门利用分子生物学原理系统分析细胞代谢网络, 并通过DNA 重组技术合理设计细胞代谢途径及进行遗传修饰, 进而完成细胞特性改造的应用性学科。20多年来, 随着DNA 重组技术的日趋成熟, 途径工程的理论和应用也得到了迅速发展, 该领域在工业、生物制药、环境保护、农业等各方面均表现出广阔的应用前景[1]。
在农作物病虫害防治中, 许多农药是由微生物发酵产生, 杀虫剂如阿维菌素、多杀菌素、米拜菌素、南昌霉素, 杀菌剂如井冈霉素等。在弄清这些化合物在微生物体内的生物合成途径与遗传控制机制的基础上, 通过定向改变细胞内代谢途径的分布与代谢流重构代谢网络, 可提高目标代谢物的产量, 提高工业化生产的得率, 降低生产成本。
基金项目:国家自然科学基金项目(39900093)
阿维菌素是由阿维链霉菌(Strep tomyces aver -mitilis ) 产生的大环内酯抗生素类杀虫剂, 是一组由十六元环内酯与一个齐墩果糖生成的苷(图1, 表1) , 在十六元环内酯周围还有一个含有2个六元环的螺缩酮及六氢苯并呋喃环。发酵产物中含有8个结构十分相似的化合物。商业化产品阿维菌素1. 8%乳油中的有效成份80%为阿维菌素B 1a , 20%为阿维菌素B 1b 。将阿维菌素的B1组分选择性还原22与23位不饱和双键而合成的伊维菌素(iver -mectin) , 较原来的阿维菌素对高等动物的毒性大大降低, 伊维菌素商业化产品的有效成份为:伊维菌素B 1a >80%, 伊维菌素B 1b
1 阿维菌素的合成途径
阿维菌素的生物合成可分为3个阶段[2, 3, 4, 5]
(图2) 。
通讯作者:苏建亚, Tel:86-25-4395339; Fax:86-25-4395246; Email:sjy@njau. edu. cn
2003年第6期
苏建亚等:阿维菌素的生物合成与途径工程
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第一阶段:聚酮链的延伸
大环内酯类抗生素大都属于聚酮类物质, 如红霉
素、雷帕霉素、利福霉素、米拜菌素、泰乐菌素、梅岭霉菌等,
这类聚酮结构的生物合成过程均呈现相似的规
表1 阿维菌素的组分与结构
组分阿维菌素
A 1a A 1b A 2a A 2b B 1a B 1b B 2a B 2b
伊维菌素
B 1a B 1b
R1CH 3CH 3CH 3CH 3H H H H H H
R2C 2H 5CH 3C 2H 5CH 3C 2H 5CH 3C 2H 5CH 3C 2H 5CH 3
X -Y CH =CH CH =CH CH -2CH(OH) CH 2-CH(OH) CH =CH CH =CH CH -2CH(OH) CH -2CH(OH) CH 2-CH 2CH 2-CH
2
图1 阿维菌素的组分与结构
图2 阿维菌素的生物合成途径
律[1, 6]。阿维菌素的聚酮是通过在起始单位(2-甲基-A -A -P -A(P -丙
酰, A -乙酰) 的顺序添加12个酰基缩合而成的。每个,
20 生物技术通报Biote chnology Bulletin
伸循环的初始产物均为 -酮酯, 后者再经历酮基的还原化修饰。这一系列连续的反应系统中, 其催化活性结构域都组织成模件形式, 每个链延伸循环构成一个独立的模件(图3) 。在每个模件中, 有3个必需的结构域用于C -C 键的形成:
(1) -酮脂酰基ACP 合成酶(KS) 缩合2分子的起始单位或缩合1分子的起始单位和1分子的酰基链;
(2) 酰基转移酶(AT ) 将链延伸单位(丙二酸或甲基丙二酸) 转到第三核心结构域的巯基上;
(3) 酰基载体蛋白(ACP)
2003年第6期
上述核心结构域催化形成的酮酯化合物再由一个还原性的结构域进行后续加工, 而该还原性结构域又由烯酰还原酶(ER) 、酮基还原酶(KR) 或脱水酶(DH) 等模件构成。酮基化合物被还原的程度取决于它所选择的还原性结构域的组合模件数目, 例如, KR +DH+ER 型组合导致酮基完全还原到亚甲基; KR +DH 型组合使还原过程停止在双键阶段; 仅含KR 的还原结构域产生的是相应的羟基化合物; 而在还原性结构域不存在的情况下, 酮基将不发生任何转化反应。阿维菌素PKS 结构域的全顺序及其在链延伸模件中的可能次序见图2
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图3 模件型PKS 的结构域作用和链延伸反应的顺序
第二阶段:起始糖苷配基的修饰产生阿维菌素糖苷配基
聚酮长链合成后的下一步是螺缩酮及呋喃环的闭合, 形成阿维菌素糖苷配基。C2~7位环已环的形成涉及到C2烯酰基和C7羰基间的缩合。C17及C25位螺缩酮的缩合是通过C21位的羰基酮基化形成的。C6和C8a 间呋喃环是在C8a 的烯丙基甲基上引入氧原子后形成的, 该过程由细胞色素P450羟化酶催化。
:利用脱氧胸苷二磷酸(dTDP)-齐墩果糖在C13和C4 上进行O -糖基化, 将齐墩果糖转移到阿维菌素糖苷配基上, 最后形成阿维菌素。齐墩果糖合成的途径类似于鼠李糖的生物合成, 由一系列酶所催化, 齐墩果糖C3位上的甲基则来源于甲硫氨酸。
2 阿维菌素生物合成的基因簇及有关酶
阿维菌素完整的生物合成基因簇是用含ave D 基因的DNA 片段作为探针杂交一个粘粒基因组文库而得到的, 连同旁侧序列共克隆和测序了82kb 的
2003年第6期
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4所示, 共含有18个开放阅读框[5, 7, 8]。
中心区为聚酮合成酶基因, 有4个阅读框, 该区因转录方向不同分为2组:aveA1-aveA2和aveA3-aveA4, 它们负责合成阿维菌素的聚酮部分。阿维菌(AVES1,AVES2, AVES3, AVES4) 组成, 共含有12个模件, 每个模件都催化新一轮聚酮链的延伸(图2) 。AVES1的分子量为414kDa, 含有聚酮链延伸的最初2个模件, AVES2(666kDa) 含有接下去的4个模件, 将链延伸到C13结构, AVES3(575kDa) 含有3个模件, 将链延伸到C17结构, AVES4(510kDa) 含有3个模件, 负责完成聚酮链的最终形成(图2) 。所有的12个模件均含有 -酮脂酰基ACP 合成酶(KS) 、
酰基转移酶(AT) 和酰基载体蛋白(ACP) 结构域。第一和最后一个模件还编码了独特的结构域, 聚酮链的起始反应需要起始酰基转移酶和酰基载体蛋白结构
域将酰基基团装载到PKS 上, 这些结构域已在基ACP 合成酶结构域, 其聚酮链终止反应要求一个硫酯酶结构域来释放完成的聚酮并形成内酯, 这个硫酯酶结构域存在于AVES4的C 端, 靠近模件12的酰基载体蛋白结构域。在阿维菌素聚酮合成酶中, 模件1、4、5和10中还有一个 -酮脂酰基ACP 还原酶结构域(KR) , 在模件3和11中则没有KR, 模件2、6、7、8、9和12中还有KR 和脱氢酶(DH)
。
素聚酮合成酶(PKS) 很复杂, 由4个多功能蛋白AVES1的N 端得到了鉴定, 靠近模件1的 -酮脂酰
图4 阿维菌素生物合成基因簇图谱
两组PKS 之间还有aveC 和aveE 两个开放阅读I , aveBIII , av eBI V , aveB V, aveBVI , aveB VII 和
框(图4) , 分别临近于av eA 2和aveA 3, aveC 在翻译aveBII I ) 负责脱氧糖的合成, 第8个基因ave BI 编码上是与aveA 2偶联的, 但其功能还不清楚, 可能与聚酮的后修饰有关。aveE 可能是与aveA 3和aveA 4在同一转录单元上, aveE 的C 端氨基酸序列类似于细胞色素P450脱氢酶, 可能与C6与C8a 间呋喃环的形成有关。
在PKS 基因右边还检测到了9个开放阅读框, 这些基因的序列与dTDP -脱氧糖合成酶及转糖基酶有明显的类似性。靠近AveA 4的第一个开放阅读框orf 1类似于还原酶, 但该基因产物在阿维菌素生物合成中可能是起作用的。齐墩果糖合成和转糖基作(-糖基转移酶, 将齐墩果糖转移到来源于聚酮的糖苷配基上。
在PKS 基因左侧的3个开放阅读框主要负责最初合成的糖基的修饰, 其中2个在ave A1的上游, 涉及到起始糖苷配基的修饰。A ve D 紧靠在av e A1的上游, 编码O -甲基转移酶, 催化将S -腺苷甲硫氨酸的甲基转移到阿维菌素B 组分的C5位上, 形成阿维菌素的A 组分。在ave D 的下游位点是ave F 基因, 编码C5-酮还原酶。最后一个开放阅读框ave R 位于ave F 的左边, 该基因的转录方向与ave D -ave F 相
22 生物技术通报Biote chnology Bulletin
合成的有关基因及推定功能见表2。
2003年第6期
阿维链霉菌发酵产生8个组分(见图1) , 其中只有B 1a 和B 1b 两个组分有较高杀虫活性, 特别是B 1a 的活性最高。这8个组分在结构上的差异集中在3个
3 阿维菌素生产的途径控制
3. 1 通过途径工程构建生产单一组分的菌株
表2 阿维菌素生物合成基因簇中开放阅读框的推定功能
多肽AVES1
装载结构域 模件1 模件2AVES2 模件3 模件4 模件5 模件6AVERS 3 模件7 模件8 模件9AVES4 模件10 模件11 模件12ORF1A v eBI A v eBII A v eBIII A v eBI V A v eBV A v eBVI A v eBVII A v eBVIII A v eC A v eD A v eE A v e F A v eR
氨基酸数目
3952
推定功能或序列类似性
PKS KS KS PKS KS KS KS KS PKS KS KS KS PKS KS KS KS 还原酶?
AT(M B) AT(P) AT(A) AT(A) AT(A) AT(A) AT(P) AT(P) AT(A) AT(P) AT(A) AT(P) AT(A)
KR KR
ACP ACP ACP ACP ACP ACP ACP ACP ACP ACP ACP ACP ACP
DH
6239
DH DH *DH DH
KR KR KR KR KR KR KR
5532
4881
DH KR T E
[***********][***********]302949
糖基转移酶
dTDP -葡萄糖4, 6-脱氢酶 -D -葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶dTDP -4-酮基-6-脱氧-L -已糖4-还原酶dTDP -4-酮基-6-脱氧已糖3, 5-差向异构酶dTDP -4-酮基-6-脱氧-L -已糖2, 3-脱氢酶dTDP -6-脱氧-L -已糖3-O -甲基转移酶dTDP -4-酮基-6-脱氧-L -已糖2, 3-还原酶?
C5位上O -甲基转移酶细胞色素P450羟化酶C5位上酮还原酶正向调控
位置上, 在生物合成途径中, 这3个位点有关的酶及合成控制见表3。
日本的Ikeda 和 mura [3, 4, 9, 10]分离到2个突变株K2021和K2034。在K2021菌株中, 作为聚酮链
表3 阿维菌素的组分及合成控制位点
C5位上的R 1
C25位上的R 2 C22-23键型
CH 3H C 2H 5CH 3
CH 2=CH 2CH -CH(OH) 2
组分
A B a b 12
生物合成控制位点ave D 编码的O -甲基转移酶失活将甲基转移到 B 组分的C5位上形成 A 组分起始单位为2-甲基丁酸起始单位为异丁酸模件2中有KR 和DH 模件2中有KR
生物合成控制方法使aveD 编码的O -甲基转移酶失活可阻止 B 组分转变为 A 组分
抑制异丁酸的前体缬氨酸的掺入可阻止 b 组分的产生尚不明确
a
2003年第6期
苏建亚等:阿维菌素的生物合成与途径工程
23
K2034仅产生 B 组分, 则是由于该株系ave D 基因发生点突变, C5位O -甲基转移酶失活, 该酶催化将 B 组分转变为 A 组分。通过将K2021和K2034株进行杂交得到了仅产生阿维菌素B 1a 和B 2a 而不产生其它组分的菌株。进一步, 在仅产生
B 1a 和B 2a 的重组株K2038中通过PCR 的方法在aveC 区域引入点突变, 这样得到了仅产生单一组分B 2a 的菌株, B 2a 组分可通过化学加氢的方法再转变为毒性较低的伊维菌素B 1a 。3. 2 C5-氧-阿维菌素B 的生产
从阿维菌素基本结构出发, 对某些基团进行适当修饰, 合成阿维菌素的新衍生物, 是农药创新的重要途径之一。在这些衍生物中, C5-氧-阿维菌素B 衍生物就可增加其活性
[11, 12]
Stutzman -Engw all 等[16]克隆了两个基因aveR 1和aveR 2, 这两个基因负责调控聚酮合成酶基因的表达与阿维菌素合成酶基因的表达, 他们发现使这两个基因中的任何一个基因或同时两个基因失活将会使
阿维菌素产量有大幅度的提高。他们构建这两个基因替换质粒载体pSE210、pSE214, 与宿主染色体发生重组后分别得到了aveR 1、aveR 2基因缺失的和aveR2基因失活的突变株, 突变株的产量比原菌株提高了3. 1~3. 4倍。
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11 Pang CH, M atsuzaki K, Ikeda H, et al. J Antibiot (T okyo) , 1995,
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12 Pang CH, M atsuzaki K, Ikeda H, et al. J Antibiot (T okyo) , 1995,
48(1) :59~66.
13 陈芝, 宋渊, 文莹, 等. 微生物学报, 2001, 41(4) :440~445. 14 Cropp A, Ch en S , Liu H, et al. J Ind M icrobiol Biotechnol, 2001,
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15 Stutzman -Engwall KJ, US Patent, 6248579, 2001. 16 Stutxman -Engwall KJ, US Patent, 6197591, 2001.
。Ikeda 等
[12]
在研究aveD
和aveF 基因的功能时, 曾在aveF 内部引入移码突
变, 导致客观存在编码的5-酮基还原酶失活, 不能将C5位的酮基还原成OH, 因此即便由aveD 编码的C5-氧-甲基转移酶存在, 也不能将C5位酮基甲基化, 该突变株只能产生C5-氧-阿维菌素B 。中国农业大学的陈芝等
[1]
采用破坏aveD 基因的策略, 将7. 0kb
的pCZ2质粒通过同源重组到染色体的aveD 基因中, 因质粒内部可能有终止子序列, 导致了下游aveF 的不能表达, 因而合成的产物也是C5-氧-阿维菌素B, 该产物经肟基化后, 其杀虫活性更高3. 3 提高阿维菌素中B1 B2的比例
野生型阿维链霉菌合成的B1 B2一般为1 2, 如果能提高此比例将会减少工业化提取程序[14]。Stutzman -Engw all 等人[15]构建了一系列含有aveC 基因野生和突变阅读框的重组表达质粒, 找到了可提高此比例的重组表达质粒, 引入宿主后与染色体发生重组, 最后得到了一系列比例提高的突变株, 有的达2. 5 1左右。
3. 4 aveR 基因失活提高阿维菌素产量
[13]
。
(上接第17页)
18 燕义唐. 植物学报, 1992, 34(12) :899~906.
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