实验一：EV71病毒非结构基因（2b）的克隆
一．实验目的
通过本实验使学生掌握外源基因克隆的原理和方法
二．实验原理
基因克隆技术包括把来自不同生物的基因与具有自主复制能力的载体DNA在体外进行人工连接，构建成新的含目的基因的重组载体，然后将其导入受体生物中去进行表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。
三．实验用品
１. 材料：EV71病毒基因组序列 载体pMAL-c2x （Amp抗性）大肠杆菌DH5a
２. 器材：离心机、DNA电泳仪、微波炉、试管、摇床、酒精灯、高压蒸汽灭菌锅、培养皿等、三角瓶、天平
３. 试剂与药品：氨苄青霉素、碱性裂解液、电泳缓冲液、Rnase A、Taq DNA聚合酶、T4DNA 连接酶、1kb 分子量DNA Marker 、内切酶BamHI和SalI、DNA 片段胶回收试剂盒、X-gal 贮液、 IPTG 贮液、Tris 碱、Na2EDTA、NaCl、CaCl2 、甘油、葡萄糖、酵母提取物、胰蛋白胨、分析纯无水乙醇、95%医用酒精、琼脂糖
四．方法与步骤
（一）缓冲液及培养基配制
1.质粒提取试剂：
溶液I：葡萄糖 50m mol/L,Tris-HCl(pH 8.0) 25m mol/L,EDTA(pH8.0) 10mmol/L于
6.895×10Pa灭菌15 min，4℃保存。
溶液II：NaOH 0.2 mol/L，SDS 1%。
SDS（10%，200ml）：20 g SDS，慢慢转移到约150ml水的烧杯中，磁力搅拌至溶解，用水定容至200 ml。
溶液III:（0.5M，pH5.2，KAC）,用冰醋酸调pH
TE缓冲液：1ml Tris-HCl(1M pH8.0),0.2ml EDTA(0.5M pH8.0),加灭菌水至100ml。 2. LB液体培养基（perliter）: 4
胰蛋白胨 10g
酵母膏 5g pH 7.0
NaCl 5g
(二).步骤
1．碱裂解法抽提质粒
实验原理： 在 pH 12.0～12.6 碱性环境中，细菌的染色体 DNA 变性分开，而共价闭环的质粒 DNA 虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将 pH 调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体 DNA 、大分子量的 RNA 和蛋白质在去污剂 SDS 的作用下形成沉淀，而质粒 DNA 仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体 DNA 、 RNA 及蛋白质，质粒 DNA 尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒 DNA 。
步骤：
1）接种一单菌落于5ml液体培养基中，加适量抗菌素，37℃摇床培养过夜；
2）取1.5ml(制备低拷贝质粒取5ml),12000r/min,离心1min（菌较多时可富集）；
3) 吸尽上清液，悬浮菌体于200ul预冷的溶液I中；
4）加入溶液II，400 uL,用手颠倒7-8次，至菌液完全清亮，并有拉丝现象比较粘稠；
5) 加入溶液III，300 uL，用手颠倒7-8次；
6）离心（12000/min）10min；将上清转入新的EP管中；
7) 离心（12000/min）10min，将上清转入新的EP管中，弃去沉淀；
9) 加入异丙醇（1倍体积）750 uL，颠倒几次混匀； 放置5min；
10) 离心（12000/min）10min，弃去上清；
11)加入70%乙醇500 uL，放置2min；
12) 离心（12000/min）2min；弃尽上清；
13) 37℃放置10min（培养箱）干燥；
14）加入50 uL TE或者灭菌的超纯水融解DNA。
15）质粒检测完毕后，置于-20℃保存
附注： 质粒检测
电泳检测：质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型 吸光值检测：采用分光光度计检测 260nm 、 280nm 波长吸光值，若吸光值 260nm/280nm 的比值
介于 1.7 － 1.9 之间，说明质粒质量较好， 1.8 为最佳，低于 1.8 说明有蛋白质污染，大于 1.8
说明有 RNA 污染。
2．EV71非结构基因2b引物设计：
F1 5‘cgggatccagcgcttcctgg3’ BamHI（上游）
F2 5‘gcgtcgacttattggaatagag’ SalI（下游）
3.目的片段EV71 2B基因 PCR扩增和纯化；
实验原理： PCR 是在模板 DNA、引物和dNTPs的存在下依赖于DNA聚合酶的酶促反应。 PCR 技术的特异性取决于引物和模板结合的特异性。反应分为变性、退火、延伸三步，经过一定的循环，介于两个引物之间的特异 DNA 片段得到大量扩增。
实验步骤：
1.按下列体系配制反应混合液：
Template DNA 0.5 μl （ 20 ng ）
10 × buffer 2μl
Primer F (50μM) 0.5μl
Primer R (50μM) 0.5μl
dNTPs （ 10mM ） 0.5 μl
Taq （ 5U/μl ） 0.5μl
Add ddH2O to 19.5μl
2.反应程序设置:
预变性 94℃ 3min
变性 94℃ 退火 62℃共33循环
延伸 72℃ 30s
延伸 72 ℃ 10min
3.PCR产物纯化
根据天北京鼎国科技有限公司提供的小量DNA胶回收试剂盒纯化PCR产物，（按照试剂盒说明书）操作过程如下：
1）在DNA凝胶成像系统下切下所需的DNA条带装入已知重量的Eppendorf管中，并称重计算胶条的重量（W毫克）；
2）加入2倍于W体积的S1液，置50℃水浴10min,使琼脂糖完全融化，不时颠倒混匀；
3）转移到柱子上如果总体积大于750uL, 过柱时要分批上柱，每一次离心30s,倒掉收集管中的液体；
4） 加入500uL的含乙醇的W1液，12000转，离心15s,弃去收集管中的液体；
5）加入500uL的W1液，静置1min,离心15s，弃去收集管中的液体；
6）再离心1min；
7）将吸附柱放入一干净的1.5ml的离心管中，在吸附膜中央加入30uL T1（2mM Tris）液或水，静置5min，离心1min；
8）将1.5ml离心管存于-20℃。
5.目的基因PCR产物和载体的酶切及产物纯化回收：
1）按照下面酶切体系，分别依次加入纯化好的2b DNA，ddH2O，Buffer，BSA，酶。
I.PCR产物酶切体系：
DNA 20ul
10 × buffer ℃，保温5-6h.
SalI 2ul
ddH2O
II.载体pMAL-c2x酶切体系：
载体DNA 10ul
10 × buffer 5ul
℃，保温5-6h.
SalI 2ul
ddH2O 31ul
2) 酶切产物检测：分别取 3μl 外源片段酶切产物和 3μl载体pMAL-c2x酶切产物于 1.0% 琼脂糖凝胶检测酶切是否完全.
3）酶切产物回收：（按照北京鼎国DNA胶回收试剂盒的操作方法）
①将PCR酶切产物和载体酶切产物按照1：3加入溶液A
②转移到柱上，静置3min，10000g离心1min。
③将滤过的溶液，再次吸入柱内，重复步骤2.
④弃掉滤液，向柱内加500ul溶液C，12000g离心1min。
⑤重复操作④后，12000g再次离心3min。
⑥将吸附柱放入一干净的1.5ml的离心管中，在吸附膜中央加入30uL T1（2mM Tris）液或水，静置5min，离心1min。（加水前保证乙醇完全除净）
⑦回收酶切产物放存于-20℃。
4）酶切回收产物检测：取2ul于1.0% 琼脂糖凝胶检测.
6. DNA体外连接反应
1）按照下列体系完成连接体系：
2b酶切回收产物 13uL
载体 4uL
T4DNA 连接酶 1 uL 20ul
10×T4DNA ligase Buffer 2.0 uL
ddH2O 0uL
2）混合均匀后，于16℃或者4℃连接过夜。
4.大肠杆菌CaCl2法制备感受态细胞
1） 挑取保存的感受态细胞在平板上划单菌落；
2） 挑取长好的单菌落接入到装有5ml LB的三角瓶中，摇床过夜培养；
3） 从universal中取1ml过夜培养物，转接于装有20ml LB（用SOC或SOB可提高感受态效率）的250ml三角瓶中，培养2.5~3小时至OD600＝0.6；
4） 将培养物倒入50ml已预冷的大离心管中，置于冰上待冷却；
5） 离心，4℃.5000rpm.3分钟；
6） 倒去上清液，先加少量0.1M CaCl2 ，打散沉淀，再加10ml，混匀，于冰上放置至少30分或过夜；
7） 离心，4℃.5000rpm，3分钟；
8） 弃上清，加1ml 0.1M CaCl2，在冰上轻轻打散沉淀，即可使用。
以上步骤均需注意无菌和低温操作。
附注：
影响感受态细胞转化效率的因素及实际操作过程中应注意的事项：
1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。DH5α菌株 OD600为 0.5 时细胞密度是 5 × 107/ml ）；
2．所有操作均应在无菌条件和冰上进行；
3．经 CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加， 24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；
4．化合物及无机离子的影响：在 Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如 Mn2+或 Co2+）、 DMSO 或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（ 100-1000 倍）；
5．所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；
6．质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的 DNA ；
7．一定范围内，转化效率与外源 DNA 的浓度呈正比；
8..DNA转化
实验原理：
热激法：大肠杆菌在 0 ℃ CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的 DNA 形成抗 DNase 的羟基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42 ℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收 DNA 复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子 实验步骤：
1) 取100μl感受态细胞和5ul的酶连产物或1-2ul质粒混合；
2) 冰上静置30分钟；
3) 42℃热激90秒，然后在冰上放置5min；
4) 加0.75ml LB培养基，在37度摇床上培养45分钟。然后3600转离心2分钟，去掉大部分上清（此步不作为快转，作为慢转，慢转可提高效率，有些抗生素如Kan筛选时用慢转较好）；
5) 涂布于有抗生素的筛选平板，一般12小时可有转化子出现。
9.重组质粒pMAL-c2X-2b鉴定
1）用消毒的牙签仔无菌工作台上挑取白斑，放于含5ml的LB培养基（加入Amp）过夜培养。
2）按以上步骤1提取质粒
3）按以上步骤3做 PCR扩增，用琼脂糖凝胶电泳检测片段的大小。
4）对提取的质粒步骤4酶切，然后用琼脂糖凝胶电泳检测片段的大小，是否为目的带。
5）对提取的质粒进行测序进一步检测克隆片段完全正确。
实验二：融合蛋白MBP -2b的诱导表达
一.实验目的：
通过本实验了解蛋白质的原核表达
二.实验原理；
将外源基因克隆在pMAL-c2x表达载体中，让其在E．coli如中表达。先让宿主菌生长， IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖)诱导的tac启动子紧邻多克隆位点和rrnb终止子，连接区跨越B—半乳糖苷酶a-互补片段氨基末端，可以通过蓝白斑筛选质粒中有外源片段插入的克隆。由于质粒中同时含有lacI基因的cIq等位基因，因此在大多数的大肠杆菌中都可以利用IPTG诱导MBP融合蛋白的表达。表达的融合蛋白（MBP -2b）可经SDS-PAGE检测或做Western-blotting，用抗体识别之。
三. 实验内容
1. 融合蛋白（MBP -2b）小规模诱导表达
2.SDS－PAGE电泳 技术；
3.western Blot 技术
4.银染对SDS－PAGE胶显色
四．实验用品
１. 材料：重组质粒pMAL-c2x-2b （Amp抗性）大肠杆菌DH5a
２. 器材：离心机、电泳仪、试管、摇床、酒精灯等
３. 试剂与药品：PBS、氨苄青霉素、碱性裂解液、电泳缓冲液、低分子量标准蛋白Marker 、X-gal 贮液、 IPTG 贮液、Amylose纯化柱、Western Blotting 使用的一抗和二抗等：
五. 实验方法与步骤
（一）培养基配制：
1.培养基
LB液体培养基（per liter）:
胰蛋白胨酵母膏（二）. SDS-PAGE及WB所用试剂：
1.配制母液：
30%丙稀酰胺(Acr母液)：29g丙烯酰胺和1g N,N‘ –亚甲双丙烯酰胺加入温热的去离子水中，确保溶液的pH值不超过7.0,置暗色瓶中室温保存。
10％的SDS溶液: 10g SDS加蒸馏水至100ml，50℃水浴下溶解，室温保存
10％的过硫酸铵溶液: 0.1g过硫酸胺加入1.0ml超纯水中，溶解后，4℃保存，保存时间为1周。 四甲基乙二胺（TEMED）
分离胶缓冲液（1.5mol/L Tris·HCl） ：45.43g Tris (MW121.14) 加入200ml 超纯水中溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。
浓缩胶缓冲液（1.0M Tris·HCl）：30.28g Tris (MW121.14) 加入200ml超纯水中，溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。 50%（v/v）甘油：取50ml甘油加入50ml去离子水
1%（w/v）溴酚蓝：100mg溴酚蓝加去离子水至10ml，搅拌直到完全溶解，过滤除去聚合的染料。
20％Tween20： 20ml Tween20 加蒸馏水至 100ml，混匀后4℃保存。
使用液
表一 10％分离胶、12％分离胶和5%浓缩胶
Table.1. 10％ separation gel, 12％ separation gel, and 5% concentrated plastic
10％分离胶（15ml） 12％分离胶（15ml） 5%浓缩胶（5ml）
超纯水 5.9ml 4.9ml 3.4ml
30％丙烯酰胺 5.0ml 6.0ml 830μl
1.5 mol/L Tris·HCl 3.8ml 3.8ml －
（pH8.8）
1.0mol/L Tris·HCl － － 630μl
（pH6.8）
10％SDS 150μl 150μl 50μl
10%AP（过硫酸胺） 150μl 150 μl 50μl
TEMED 6μl 6 μl 5μl
加TEMED后，立即混匀即可灌胶。（为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，一般加至原来的2倍，根据实验当时的温度适当调整）
5 X SDS 上样缓冲液 10ml
1.0mol/L Tris·HCl（pH6.8） 0.6ml
2-巯基乙醇 0.5ml
10%SDS 2.0ml
1%溴酚蓝 1.0ml
50%甘油 5.0ml
去离子水 0.9ml
混匀后，分装于1.5ml离心管中，4℃保存。
电泳液缓冲液 1000ml
Tris（MW121.14） 3.03g
甘氨酸（MW75.07） 18.77g
SDS 1g
蒸馏水至 1000ml
溶解后室温保存，可重复使用3～5次。
（电泳液可以回收重复利用，一般将回收的电泳液加入垂直电泳槽的下半部分，上半部分最好使用新鲜的电泳缓冲液,可以配制成10×电泳液缓冲液进行保存，稀释10倍使用）
转移缓冲液 1000ml
甘氨酸（MW75.07） 2.9g
Tris（MW121.14） 5.8g
SDS 0.37g
甲醇 200ml
蒸馏水至 1000ml
溶解后室温保存，可重复使用3～5次（先用蒸馏水溶解甘氨酸、Tris和SDS，然后再加入甲醇，最后补足水。如果先加入甲醇，溶解甘氨酸、Tris和SDS等比较困难。可以配制成2×转移缓冲液进行保存，稀释后使用）
TBS缓冲液 1000ml
Tris·HCl 1.21g
NaCl 8.8g
去离子水至 1000ml
用浓盐酸调pH至7.5
（可以配制成10×TBS缓冲液进行保存，稀释10倍使用）
TBST缓冲液
20％ Tween 20 1.65ml
TBS 700ml
混匀后即可使用，最好现用现配。
封闭液
1%BSA（牛血清蛋白）-TBS：称量1.0gBSA溶解于100mlTBS溶液中
或者5%脱脂奶粉-TBS：称量5g脱脂奶粉溶解于100mlTBS溶液中
最好现用现配。
抗体缓冲液：1%BSA-TBST或者5%脱脂奶粉-TBST
一抗溶液：用抗体缓冲液按1:1000-1:2000稀释
二抗溶液：用抗体缓冲液按1:2000-1:5000稀释
显色液：将10mg AEC 溶于0.5 ml DMF，再加入 9.5ml Aectate buffer，再加10ul 过
氧化氢，立即使用。
2.电泳缓冲液
TAE: 50×TAE缓冲液配制（1L溶液各成分的用量）:
2mol/L Tris碱+1mol/L 乙酸+100 mmol/L EDTA+水
首先称 242g Tris碱，加57.1 ml的冰乙酸和 200ml的0.5 mol/L EDTA， 加水至850ml，调pH到 8.0， 然后定容至1L。
3. 抗生素
试验中用到的抗生素及各抗生素使用浓度如下：
氨苄青霉素（Amp） 100mg/ml,无菌水配制
卡那霉素（kana） 50mg/ml,无菌水配制
IPTG（200mg/ml）:将1g IPTG溶于4ml超纯水，定容至5ml,于0.2um细菌过滤除菌，分装成1ml每份，存于-20℃。
X-gal试剂(20mg/ml)：将20mg X-gal溶于1ml 二甲基甲酰胺中，-20℃避光保。
（三）融合蛋白（MBP -2b）小规模诱导表达;
1. 将上述在大肠杆菌DH5a鉴定得到的重组菌落（pMAL-c2x-2b）诱导表达，取100微升接种于5毫升含氨苄青霉素LB液体培养基中，37 ℃，220 rpm/min振摇培养过夜。
2. 次日将培养过夜的菌液50μl再接种于5 ml（1:50）LB液体培养基中，37℃，220 rpm/min振摇培养至光密度（OD600=0.6）时，取1 ml样本作为诱导前标本，12000g离心1 min收集菌体沉淀，－20℃冻存备用。
3. 加入IPTG（设置不同的浓度，温度，时间梯度）于菌液中， 220 rpm/min取1 ml
样本作为诱导后标本，同上法收集菌体沉淀，－20℃冻存备用。
4. 将诱导前后菌体离心沉淀加入等体积的2×SDS上样缓冲液，煮沸加热5 min。
（四）SDS聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分离。具体步骤如下：
1． 清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用去离子水冲洗干净后立在盘里晾干。
2． 灌胶与上样
(1) 玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
(2)按前面方法配10％或者12%的分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用1ml枪沿玻璃放出胶，待胶面升到离玻璃板口2cm-3cm时即可。然后胶上加一层水赶走气泡，且水封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要慢，否则胶会被冲变型。）
(3)当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了，再等几分钟使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
(4)按前面方法配5％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。插梳子时要使梳子保持水平，由于胶凝固时体积会收缩减小，使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
(5)将其放入电泳槽中。
(6) 加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板）用微量进样器或者枪头贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头或者枪头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤一下，以免交叉污染）
(7)电泳：电泳时间一般2～3 h，电压为浓缩胶时用80V-100V，到分离胶以后用120V-150V。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜（做转膜的SDS-Page胶蛋白marker要预染的）或者考染。
(五)western blot 具体步骤如下；
1.SDS-PAGE 电泳完成后，用适量的半干转移液浸泡胶大约 15 min。
2.根据胶的大小，剪一张同样大小的硝酸纤维素膜转至半干转移液中大约 10 min。
3.用适量干转移液湿润海绵垫和比胶略小的24层滤纸2张。
4.戴手套按照以下顺序组装电转夹：电转夹阳极面、24层滤纸、硝酸纤维素膜
（Nitrocellulose Blotting Membranes，NC、胶、24层滤纸、电转夹
阴极面，用吸量管在滤纸表面慢慢滚动，以排出胶和膜之间的气泡。
5.在伯乐半干转印槽（Biorad Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell）， 15V 电转 30 min；
6.拆卸伯乐半干转印槽，可用预染 marker 直接观察转移的效率（看原来的SDS-PAGE胶上条带颜色的深浅）。
7.用TBS-T洗脱NC膜三次每次5 min用 5％脱脂牛奶封闭膜，放在水平摇床上震摇，室温2小时，之后再用TBS-T洗脱NC膜三次每次10 min，封闭液稀释一抗，工作浓度大约在 一抗与封闭比值为1：2000，放在水平摇床上震摇，室温至少 12小时直至过夜。
8.TBS-T 洗NC膜三次每次10 min，按照操作说明用封闭液稀释MBP标记的二抗，（初次使用建议按照 1：3000 稀释，以后可根据实验情况调整稀释比例），膜在二抗中室温于摇
床 2小时。
9.TBS-T 洗膜三次，每次大约10 min；之后TBS 洗膜三次，每次于摇床洗5min,洗去残留的 Tween-20。
10.将膜置于底物溶液（如：用0.01克的AEC加入500微升的DMF中，再加入9.5毫升的
Acetate Buffer最后加入15微升的30％ H2O2 显色缓冲液混匀）中，在水平摇床避光显色，观察变化。与预染蛋白Marker对比（融合蛋白MBP -2b分子量约56KDa）
实验三：融合蛋白MBP -2b纯化
一.实验目的；
通过本实验了解融合蛋白MBP -2b纯化
二.实验原理；
亲和层析法几乎可以将麦芽糖结合蛋白纯化成单组分，麦芽糖结合蛋白（MBP）是一个有大肠杆菌malE基因编码的周质蛋白，是细菌麦芽糖转运系统的成员之一。MBP能结合微摩水平的麦芽糖和麦芽糊精，因此可以交联了的麦芽糖的琼脂糖进行纯化。然后用含有Amylose的纯化柱对融合蛋白亲和层析以得到较为单一的蛋白。
三. 实验内容
1. 融合蛋白（MBP -2b）大规模诱导表达
2. 融合蛋白（MBP -2b）纯化；
四．实验用品
１.材料：重组质粒pMAL-c2x-2b（Amp抗性）大肠杆菌DH5a
２.器材：离心机、锥形瓶、试管、摇床、酒精灯等
３.试剂与药品：column Bufffer、氨苄青霉素、IPTG 贮液、Amylose纯化柱等
五. 实验方法与步骤
（一）培养基配制、
1.培养基
含葡萄糖的LB液体培养基（per liter）:
胰蛋白胨 10g
酵母膏 5g
NaCl 5g
葡萄糖 2g
pH 7.0
2.column Bufffer（per liter）
:
3.洗脱液：
. Water: 3 column volumes
0 .1% SDS: 3 column volumes Water
1 column volumes Column Buffer: 3 column volumes
（二）.方法与步骤（参见NEB公司，英文版）
用含10 mM麦芽糖（maltose）Column Buffer 过柱
稀释融合蛋白（MBP -2b） . 收集约两倍柱体积的液体，
保存-80℃备用.
具体步骤如下:
(1）将过夜活化的含pMAL-c2X-2b重组质粒的大肠杆菌，
以1%加入400ml含葡萄糖的LB培养基37℃培养。
(2）生长至OD600 为0.5，在冰中降温至零度，再加入IPTG
至终浓度为0.8mM，继续37℃培养4h。
(3）以4000g，4℃离心20min收集细菌，以每克细菌（湿
重）加入10ml Column Buffer,将细菌悬浮。
（4）将悬浮的细菌置于-20℃过夜。
（5）将过夜冻存的细菌放在冰水浴中使其融解，加入
cocktail混合蛋白抑制剂或者PMSF。
（6）以15sec的短促脉冲超声波（0.3，40%）破碎细菌，
并每次停顿15sec降温，每间隔1min取蛋白粗提物，用紫
外分光光度计测量蛋白浓度，以检测蛋白的最大释放量的
时间。
（7）9000g离心，保留上清。将此粗提物以1：5用Column
Buffer稀释。
（8）将填充料直链淀粉琼脂（Amylose Resin）加入纯化柱上，以8柱体积（column volume）的Column Buffer洗柱 。
(9）粗提物以1ml/min的速度过柱 。
(10）以12柱体积（column volume）的Column Buffer洗柱，以洗去杂蛋白。
(11）用含有10mM的麦芽糖的column volume洗脱目的蛋白，收集洗脱液，每管1ml左右，大约收集7管。
(12）分别用3倍柱体积的水，3倍柱体积0.1%SDS，1柱体积水，3柱体积Column Buffer 依次清洗柱子以回收利用。
（13）跑SDS-PAGE或者western blot检测，样品纯化情况。
实验一：EV71病毒非结构基因（2b）的克隆
一．实验目的
通过本实验使学生掌握外源基因克隆的原理和方法
二．实验原理
基因克隆技术包括把来自不同生物的基因与具有自主复制能力的载体DNA在体外进行人工连接，构建成新的含目的基因的重组载体，然后将其导入受体生物中去进行表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。
三．实验用品
１. 材料：EV71病毒基因组序列 载体pMAL-c2x （Amp抗性）大肠杆菌DH5a
２. 器材：离心机、DNA电泳仪、微波炉、试管、摇床、酒精灯、高压蒸汽灭菌锅、培养皿等、三角瓶、天平
３. 试剂与药品：氨苄青霉素、碱性裂解液、电泳缓冲液、Rnase A、Taq DNA聚合酶、T4DNA 连接酶、1kb 分子量DNA Marker 、内切酶BamHI和SalI、DNA 片段胶回收试剂盒、X-gal 贮液、 IPTG 贮液、Tris 碱、Na2EDTA、NaCl、CaCl2 、甘油、葡萄糖、酵母提取物、胰蛋白胨、分析纯无水乙醇、95%医用酒精、琼脂糖
四．方法与步骤
（一）缓冲液及培养基配制
1.质粒提取试剂：
溶液I：葡萄糖 50m mol/L,Tris-HCl(pH 8.0) 25m mol/L,EDTA(pH8.0) 10mmol/L于
6.895×10Pa灭菌15 min，4℃保存。
溶液II：NaOH 0.2 mol/L，SDS 1%。
SDS（10%，200ml）：20 g SDS，慢慢转移到约150ml水的烧杯中，磁力搅拌至溶解，用水定容至200 ml。
溶液III:（0.5M，pH5.2，KAC）,用冰醋酸调pH
TE缓冲液：1ml Tris-HCl(1M pH8.0),0.2ml EDTA(0.5M pH8.0),加灭菌水至100ml。 2. LB液体培养基（perliter）: 4
胰蛋白胨 10g
酵母膏 5g pH 7.0
NaCl 5g
(二).步骤
1．碱裂解法抽提质粒
实验原理： 在 pH 12.0～12.6 碱性环境中，细菌的染色体 DNA 变性分开，而共价闭环的质粒 DNA 虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将 pH 调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体 DNA 、大分子量的 RNA 和蛋白质在去污剂 SDS 的作用下形成沉淀，而质粒 DNA 仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体 DNA 、 RNA 及蛋白质，质粒 DNA 尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒 DNA 。
步骤：
1）接种一单菌落于5ml液体培养基中，加适量抗菌素，37℃摇床培养过夜；
2）取1.5ml(制备低拷贝质粒取5ml),12000r/min,离心1min（菌较多时可富集）；
3) 吸尽上清液，悬浮菌体于200ul预冷的溶液I中；
4）加入溶液II，400 uL,用手颠倒7-8次，至菌液完全清亮，并有拉丝现象比较粘稠；
5) 加入溶液III，300 uL，用手颠倒7-8次；
6）离心（12000/min）10min；将上清转入新的EP管中；
7) 离心（12000/min）10min，将上清转入新的EP管中，弃去沉淀；
9) 加入异丙醇（1倍体积）750 uL，颠倒几次混匀； 放置5min；
10) 离心（12000/min）10min，弃去上清；
11)加入70%乙醇500 uL，放置2min；
12) 离心（12000/min）2min；弃尽上清；
13) 37℃放置10min（培养箱）干燥；
14）加入50 uL TE或者灭菌的超纯水融解DNA。
15）质粒检测完毕后，置于-20℃保存
附注： 质粒检测
电泳检测：质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型 吸光值检测：采用分光光度计检测 260nm 、 280nm 波长吸光值，若吸光值 260nm/280nm 的比值
介于 1.7 － 1.9 之间，说明质粒质量较好， 1.8 为最佳，低于 1.8 说明有蛋白质污染，大于 1.8
说明有 RNA 污染。
2．EV71非结构基因2b引物设计：
F1 5‘cgggatccagcgcttcctgg3’ BamHI（上游）
F2 5‘gcgtcgacttattggaatagag’ SalI（下游）
3.目的片段EV71 2B基因 PCR扩增和纯化；
实验原理： PCR 是在模板 DNA、引物和dNTPs的存在下依赖于DNA聚合酶的酶促反应。 PCR 技术的特异性取决于引物和模板结合的特异性。反应分为变性、退火、延伸三步，经过一定的循环，介于两个引物之间的特异 DNA 片段得到大量扩增。
实验步骤：
1.按下列体系配制反应混合液：
Template DNA 0.5 μl （ 20 ng ）
10 × buffer 2μl
Primer F (50μM) 0.5μl
Primer R (50μM) 0.5μl
dNTPs （ 10mM ） 0.5 μl
Taq （ 5U/μl ） 0.5μl
Add ddH2O to 19.5μl
2.反应程序设置:
预变性 94℃ 3min
变性 94℃ 退火 62℃共33循环
延伸 72℃ 30s
延伸 72 ℃ 10min
3.PCR产物纯化
根据天北京鼎国科技有限公司提供的小量DNA胶回收试剂盒纯化PCR产物，（按照试剂盒说明书）操作过程如下：
1）在DNA凝胶成像系统下切下所需的DNA条带装入已知重量的Eppendorf管中，并称重计算胶条的重量（W毫克）；
2）加入2倍于W体积的S1液，置50℃水浴10min,使琼脂糖完全融化，不时颠倒混匀；
3）转移到柱子上如果总体积大于750uL, 过柱时要分批上柱，每一次离心30s,倒掉收集管中的液体；
4） 加入500uL的含乙醇的W1液，12000转，离心15s,弃去收集管中的液体；
5）加入500uL的W1液，静置1min,离心15s，弃去收集管中的液体；
6）再离心1min；
7）将吸附柱放入一干净的1.5ml的离心管中，在吸附膜中央加入30uL T1（2mM Tris）液或水，静置5min，离心1min；
8）将1.5ml离心管存于-20℃。
5.目的基因PCR产物和载体的酶切及产物纯化回收：
1）按照下面酶切体系，分别依次加入纯化好的2b DNA，ddH2O，Buffer，BSA，酶。
I.PCR产物酶切体系：
DNA 20ul
10 × buffer ℃，保温5-6h.
SalI 2ul
ddH2O
II.载体pMAL-c2x酶切体系：
载体DNA 10ul
10 × buffer 5ul
℃，保温5-6h.
SalI 2ul
ddH2O 31ul
2) 酶切产物检测：分别取 3μl 外源片段酶切产物和 3μl载体pMAL-c2x酶切产物于 1.0% 琼脂糖凝胶检测酶切是否完全.
3）酶切产物回收：（按照北京鼎国DNA胶回收试剂盒的操作方法）
①将PCR酶切产物和载体酶切产物按照1：3加入溶液A
②转移到柱上，静置3min，10000g离心1min。
③将滤过的溶液，再次吸入柱内，重复步骤2.
④弃掉滤液，向柱内加500ul溶液C，12000g离心1min。
⑤重复操作④后，12000g再次离心3min。
⑥将吸附柱放入一干净的1.5ml的离心管中，在吸附膜中央加入30uL T1（2mM Tris）液或水，静置5min，离心1min。（加水前保证乙醇完全除净）
⑦回收酶切产物放存于-20℃。
4）酶切回收产物检测：取2ul于1.0% 琼脂糖凝胶检测.
6. DNA体外连接反应
1）按照下列体系完成连接体系：
2b酶切回收产物 13uL
载体 4uL
T4DNA 连接酶 1 uL 20ul
10×T4DNA ligase Buffer 2.0 uL
ddH2O 0uL
2）混合均匀后，于16℃或者4℃连接过夜。
4.大肠杆菌CaCl2法制备感受态细胞
1） 挑取保存的感受态细胞在平板上划单菌落；
2） 挑取长好的单菌落接入到装有5ml LB的三角瓶中，摇床过夜培养；
3） 从universal中取1ml过夜培养物，转接于装有20ml LB（用SOC或SOB可提高感受态效率）的250ml三角瓶中，培养2.5~3小时至OD600＝0.6；
4） 将培养物倒入50ml已预冷的大离心管中，置于冰上待冷却；
5） 离心，4℃.5000rpm.3分钟；
6） 倒去上清液，先加少量0.1M CaCl2 ，打散沉淀，再加10ml，混匀，于冰上放置至少30分或过夜；
7） 离心，4℃.5000rpm，3分钟；
8） 弃上清，加1ml 0.1M CaCl2，在冰上轻轻打散沉淀，即可使用。
以上步骤均需注意无菌和低温操作。
附注：
影响感受态细胞转化效率的因素及实际操作过程中应注意的事项：
1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。DH5α菌株 OD600为 0.5 时细胞密度是 5 × 107/ml ）；
2．所有操作均应在无菌条件和冰上进行；
3．经 CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加， 24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；
4．化合物及无机离子的影响：在 Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如 Mn2+或 Co2+）、 DMSO 或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（ 100-1000 倍）；
5．所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；
6．质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的 DNA ；
7．一定范围内，转化效率与外源 DNA 的浓度呈正比；
8..DNA转化
实验原理：
热激法：大肠杆菌在 0 ℃ CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的 DNA 形成抗 DNase 的羟基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42 ℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收 DNA 复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子 实验步骤：
1) 取100μl感受态细胞和5ul的酶连产物或1-2ul质粒混合；
2) 冰上静置30分钟；
3) 42℃热激90秒，然后在冰上放置5min；
4) 加0.75ml LB培养基，在37度摇床上培养45分钟。然后3600转离心2分钟，去掉大部分上清（此步不作为快转，作为慢转，慢转可提高效率，有些抗生素如Kan筛选时用慢转较好）；
5) 涂布于有抗生素的筛选平板，一般12小时可有转化子出现。
9.重组质粒pMAL-c2X-2b鉴定
1）用消毒的牙签仔无菌工作台上挑取白斑，放于含5ml的LB培养基（加入Amp）过夜培养。
2）按以上步骤1提取质粒
3）按以上步骤3做 PCR扩增，用琼脂糖凝胶电泳检测片段的大小。
4）对提取的质粒步骤4酶切，然后用琼脂糖凝胶电泳检测片段的大小，是否为目的带。
5）对提取的质粒进行测序进一步检测克隆片段完全正确。
实验二：融合蛋白MBP -2b的诱导表达
一.实验目的：
通过本实验了解蛋白质的原核表达
二.实验原理；
将外源基因克隆在pMAL-c2x表达载体中，让其在E．coli如中表达。先让宿主菌生长， IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖)诱导的tac启动子紧邻多克隆位点和rrnb终止子，连接区跨越B—半乳糖苷酶a-互补片段氨基末端，可以通过蓝白斑筛选质粒中有外源片段插入的克隆。由于质粒中同时含有lacI基因的cIq等位基因，因此在大多数的大肠杆菌中都可以利用IPTG诱导MBP融合蛋白的表达。表达的融合蛋白（MBP -2b）可经SDS-PAGE检测或做Western-blotting，用抗体识别之。
三. 实验内容
1. 融合蛋白（MBP -2b）小规模诱导表达
2.SDS－PAGE电泳 技术；
3.western Blot 技术
4.银染对SDS－PAGE胶显色
四．实验用品
１. 材料：重组质粒pMAL-c2x-2b （Amp抗性）大肠杆菌DH5a
２. 器材：离心机、电泳仪、试管、摇床、酒精灯等
３. 试剂与药品：PBS、氨苄青霉素、碱性裂解液、电泳缓冲液、低分子量标准蛋白Marker 、X-gal 贮液、 IPTG 贮液、Amylose纯化柱、Western Blotting 使用的一抗和二抗等：
五. 实验方法与步骤
（一）培养基配制：
1.培养基
LB液体培养基（per liter）:
胰蛋白胨酵母膏（二）. SDS-PAGE及WB所用试剂：
1.配制母液：
30%丙稀酰胺(Acr母液)：29g丙烯酰胺和1g N,N‘ –亚甲双丙烯酰胺加入温热的去离子水中，确保溶液的pH值不超过7.0,置暗色瓶中室温保存。
10％的SDS溶液: 10g SDS加蒸馏水至100ml，50℃水浴下溶解，室温保存
10％的过硫酸铵溶液: 0.1g过硫酸胺加入1.0ml超纯水中，溶解后，4℃保存，保存时间为1周。 四甲基乙二胺（TEMED）
分离胶缓冲液（1.5mol/L Tris·HCl） ：45.43g Tris (MW121.14) 加入200ml 超纯水中溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。
浓缩胶缓冲液（1.0M Tris·HCl）：30.28g Tris (MW121.14) 加入200ml超纯水中，溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。 50%（v/v）甘油：取50ml甘油加入50ml去离子水
1%（w/v）溴酚蓝：100mg溴酚蓝加去离子水至10ml，搅拌直到完全溶解，过滤除去聚合的染料。
20％Tween20： 20ml Tween20 加蒸馏水至 100ml，混匀后4℃保存。
使用液
表一 10％分离胶、12％分离胶和5%浓缩胶
Table.1. 10％ separation gel, 12％ separation gel, and 5% concentrated plastic
10％分离胶（15ml） 12％分离胶（15ml） 5%浓缩胶（5ml）
超纯水 5.9ml 4.9ml 3.4ml
30％丙烯酰胺 5.0ml 6.0ml 830μl
1.5 mol/L Tris·HCl 3.8ml 3.8ml －
（pH8.8）
1.0mol/L Tris·HCl － － 630μl
（pH6.8）
10％SDS 150μl 150μl 50μl
10%AP（过硫酸胺） 150μl 150 μl 50μl
TEMED 6μl 6 μl 5μl
加TEMED后，立即混匀即可灌胶。（为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，一般加至原来的2倍，根据实验当时的温度适当调整）
5 X SDS 上样缓冲液 10ml
1.0mol/L Tris·HCl（pH6.8） 0.6ml
2-巯基乙醇 0.5ml
10%SDS 2.0ml
1%溴酚蓝 1.0ml
50%甘油 5.0ml
去离子水 0.9ml
混匀后，分装于1.5ml离心管中，4℃保存。
电泳液缓冲液 1000ml
Tris（MW121.14） 3.03g
甘氨酸（MW75.07） 18.77g
SDS 1g
蒸馏水至 1000ml
溶解后室温保存，可重复使用3～5次。
（电泳液可以回收重复利用，一般将回收的电泳液加入垂直电泳槽的下半部分，上半部分最好使用新鲜的电泳缓冲液,可以配制成10×电泳液缓冲液进行保存，稀释10倍使用）
转移缓冲液 1000ml
甘氨酸（MW75.07） 2.9g
Tris（MW121.14） 5.8g
SDS 0.37g
甲醇 200ml
蒸馏水至 1000ml
溶解后室温保存，可重复使用3～5次（先用蒸馏水溶解甘氨酸、Tris和SDS，然后再加入甲醇，最后补足水。如果先加入甲醇，溶解甘氨酸、Tris和SDS等比较困难。可以配制成2×转移缓冲液进行保存，稀释后使用）
TBS缓冲液 1000ml
Tris·HCl 1.21g
NaCl 8.8g
去离子水至 1000ml
用浓盐酸调pH至7.5
（可以配制成10×TBS缓冲液进行保存，稀释10倍使用）
TBST缓冲液
20％ Tween 20 1.65ml
TBS 700ml
混匀后即可使用，最好现用现配。
封闭液
1%BSA（牛血清蛋白）-TBS：称量1.0gBSA溶解于100mlTBS溶液中
或者5%脱脂奶粉-TBS：称量5g脱脂奶粉溶解于100mlTBS溶液中
最好现用现配。
抗体缓冲液：1%BSA-TBST或者5%脱脂奶粉-TBST
一抗溶液：用抗体缓冲液按1:1000-1:2000稀释
二抗溶液：用抗体缓冲液按1:2000-1:5000稀释
显色液：将10mg AEC 溶于0.5 ml DMF，再加入 9.5ml Aectate buffer，再加10ul 过
氧化氢，立即使用。
2.电泳缓冲液
TAE: 50×TAE缓冲液配制（1L溶液各成分的用量）:
2mol/L Tris碱+1mol/L 乙酸+100 mmol/L EDTA+水
首先称 242g Tris碱，加57.1 ml的冰乙酸和 200ml的0.5 mol/L EDTA， 加水至850ml，调pH到 8.0， 然后定容至1L。
3. 抗生素
试验中用到的抗生素及各抗生素使用浓度如下：
氨苄青霉素（Amp） 100mg/ml,无菌水配制
卡那霉素（kana） 50mg/ml,无菌水配制
IPTG（200mg/ml）:将1g IPTG溶于4ml超纯水，定容至5ml,于0.2um细菌过滤除菌，分装成1ml每份，存于-20℃。
X-gal试剂(20mg/ml)：将20mg X-gal溶于1ml 二甲基甲酰胺中，-20℃避光保。
（三）融合蛋白（MBP -2b）小规模诱导表达;
1. 将上述在大肠杆菌DH5a鉴定得到的重组菌落（pMAL-c2x-2b）诱导表达，取100微升接种于5毫升含氨苄青霉素LB液体培养基中，37 ℃，220 rpm/min振摇培养过夜。
2. 次日将培养过夜的菌液50μl再接种于5 ml（1:50）LB液体培养基中，37℃，220 rpm/min振摇培养至光密度（OD600=0.6）时，取1 ml样本作为诱导前标本，12000g离心1 min收集菌体沉淀，－20℃冻存备用。
3. 加入IPTG（设置不同的浓度，温度，时间梯度）于菌液中， 220 rpm/min取1 ml
样本作为诱导后标本，同上法收集菌体沉淀，－20℃冻存备用。
4. 将诱导前后菌体离心沉淀加入等体积的2×SDS上样缓冲液，煮沸加热5 min。
（四）SDS聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分离。具体步骤如下：
1． 清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用去离子水冲洗干净后立在盘里晾干。
2． 灌胶与上样
(1) 玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
(2)按前面方法配10％或者12%的分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用1ml枪沿玻璃放出胶，待胶面升到离玻璃板口2cm-3cm时即可。然后胶上加一层水赶走气泡，且水封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要慢，否则胶会被冲变型。）
(3)当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了，再等几分钟使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
(4)按前面方法配5％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。插梳子时要使梳子保持水平，由于胶凝固时体积会收缩减小，使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
(5)将其放入电泳槽中。
(6) 加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板）用微量进样器或者枪头贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头或者枪头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤一下，以免交叉污染）
(7)电泳：电泳时间一般2～3 h，电压为浓缩胶时用80V-100V，到分离胶以后用120V-150V。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜（做转膜的SDS-Page胶蛋白marker要预染的）或者考染。
(五)western blot 具体步骤如下；
1.SDS-PAGE 电泳完成后，用适量的半干转移液浸泡胶大约 15 min。
2.根据胶的大小，剪一张同样大小的硝酸纤维素膜转至半干转移液中大约 10 min。
3.用适量干转移液湿润海绵垫和比胶略小的24层滤纸2张。
4.戴手套按照以下顺序组装电转夹：电转夹阳极面、24层滤纸、硝酸纤维素膜
（Nitrocellulose Blotting Membranes，NC、胶、24层滤纸、电转夹
阴极面，用吸量管在滤纸表面慢慢滚动，以排出胶和膜之间的气泡。
5.在伯乐半干转印槽（Biorad Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell）， 15V 电转 30 min；
6.拆卸伯乐半干转印槽，可用预染 marker 直接观察转移的效率（看原来的SDS-PAGE胶上条带颜色的深浅）。
7.用TBS-T洗脱NC膜三次每次5 min用 5％脱脂牛奶封闭膜，放在水平摇床上震摇，室温2小时，之后再用TBS-T洗脱NC膜三次每次10 min，封闭液稀释一抗，工作浓度大约在 一抗与封闭比值为1：2000，放在水平摇床上震摇，室温至少 12小时直至过夜。
8.TBS-T 洗NC膜三次每次10 min，按照操作说明用封闭液稀释MBP标记的二抗，（初次使用建议按照 1：3000 稀释，以后可根据实验情况调整稀释比例），膜在二抗中室温于摇
床 2小时。
9.TBS-T 洗膜三次，每次大约10 min；之后TBS 洗膜三次，每次于摇床洗5min,洗去残留的 Tween-20。
10.将膜置于底物溶液（如：用0.01克的AEC加入500微升的DMF中，再加入9.5毫升的
Acetate Buffer最后加入15微升的30％ H2O2 显色缓冲液混匀）中，在水平摇床避光显色，观察变化。与预染蛋白Marker对比（融合蛋白MBP -2b分子量约56KDa）
实验三：融合蛋白MBP -2b纯化
一.实验目的；
通过本实验了解融合蛋白MBP -2b纯化
二.实验原理；
亲和层析法几乎可以将麦芽糖结合蛋白纯化成单组分，麦芽糖结合蛋白（MBP）是一个有大肠杆菌malE基因编码的周质蛋白，是细菌麦芽糖转运系统的成员之一。MBP能结合微摩水平的麦芽糖和麦芽糊精，因此可以交联了的麦芽糖的琼脂糖进行纯化。然后用含有Amylose的纯化柱对融合蛋白亲和层析以得到较为单一的蛋白。
三. 实验内容
1. 融合蛋白（MBP -2b）大规模诱导表达
2. 融合蛋白（MBP -2b）纯化；
四．实验用品
１.材料：重组质粒pMAL-c2x-2b（Amp抗性）大肠杆菌DH5a
２.器材：离心机、锥形瓶、试管、摇床、酒精灯等
３.试剂与药品：column Bufffer、氨苄青霉素、IPTG 贮液、Amylose纯化柱等
五. 实验方法与步骤
（一）培养基配制、
1.培养基
含葡萄糖的LB液体培养基（per liter）:
胰蛋白胨 10g
酵母膏 5g
NaCl 5g
葡萄糖 2g
pH 7.0
2.column Bufffer（per liter）
:
3.洗脱液：
. Water: 3 column volumes
0 .1% SDS: 3 column volumes Water
1 column volumes Column Buffer: 3 column volumes
（二）.方法与步骤（参见NEB公司，英文版）
用含10 mM麦芽糖（maltose）Column Buffer 过柱
稀释融合蛋白（MBP -2b） . 收集约两倍柱体积的液体，
保存-80℃备用.
具体步骤如下:
(1）将过夜活化的含pMAL-c2X-2b重组质粒的大肠杆菌，
以1%加入400ml含葡萄糖的LB培养基37℃培养。
(2）生长至OD600 为0.5，在冰中降温至零度，再加入IPTG
至终浓度为0.8mM，继续37℃培养4h。
(3）以4000g，4℃离心20min收集细菌，以每克细菌（湿
重）加入10ml Column Buffer,将细菌悬浮。
（4）将悬浮的细菌置于-20℃过夜。
（5）将过夜冻存的细菌放在冰水浴中使其融解，加入
cocktail混合蛋白抑制剂或者PMSF。
（6）以15sec的短促脉冲超声波（0.3，40%）破碎细菌，
并每次停顿15sec降温，每间隔1min取蛋白粗提物，用紫
外分光光度计测量蛋白浓度，以检测蛋白的最大释放量的
时间。
（7）9000g离心，保留上清。将此粗提物以1：5用Column
Buffer稀释。
（8）将填充料直链淀粉琼脂（Amylose Resin）加入纯化柱上，以8柱体积（column volume）的Column Buffer洗柱 。
(9）粗提物以1ml/min的速度过柱 。
(10）以12柱体积（column volume）的Column Buffer洗柱，以洗去杂蛋白。
(11）用含有10mM的麦芽糖的column volume洗脱目的蛋白，收集洗脱液，每管1ml左右，大约收集7管。
(12）分别用3倍柱体积的水，3倍柱体积0.1%SDS，1柱体积水，3柱体积Column Buffer 依次清洗柱子以回收利用。
（13）跑SDS-PAGE或者western blot检测，样品纯化情况。