黄曲霉毒素的检测方法研究
应用化学 20096842 杨兰森
摘要：黄曲霉毒素(AFT)是一类有毒致癌化合物，污染粮食及其制品，给人类健康造成严重威胁。黄曲霉毒素(AFT)是迄今发现的毒性最强的一类生物毒素，有AFB1、AFB2、AFG1、AFG2等多种形式。本文介绍了黄曲霉毒素的理化性质，对人
和动物的危害等，并且对目前用于黄曲霉毒素的检测方法进行了综述。在对薄层层析法、高效液相色谱法、微柱法及酶联免疫吸附法等检测方法综合分析的基础上，评述了上述方法的优劣和适用条件。
关键词：黄曲霉毒素 危害 检测方法 进展
黄曲霉毒素(AFT)主要是由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的一类有毒次生代谢物。在世界不同地区都发现了这些真菌大量存在于供人类食用的食品中，黄曲霉毒素污染已导致严重的食品安全问题[1,2]。自20世纪60年代以来，有关黄曲霉毒素的危害被大量报道,以致黄曲霉毒素已成为最受人们关注的一种真菌毒素
[3]。阐明黄曲霉毒素的治病机理，快速，准确地检测食品中黄曲霉度的含量，并制定相应的标准，采取适当的预防措施来降低其危害已成为近来食品、饲料检测研究的重点。
1 黄曲霉毒素概述
1.1 黄曲霉毒素的理化性质
黄曲霉毒素是一组化学结构类似的化合物，目前已分离鉴定出12种，包括B1，B2，G1，G2，M1，M2，P1，Q，H1，GM，B2a和毒醇[4]。黄曲霉毒素的的基本结构为二呋喃环和香豆素，B1是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，即含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮(香豆素)，前者为基本毒性结构，后者与其致癌性有关[5]。M1是黄曲霉毒素B1在体内经过羟化而衍生成的代谢产物。黄曲霉毒素的主要分子形式含 B1，B2，G1，G2，M1，M2等，其中M1和M2主要存在于牛奶中，B1为毒性及致癌性最强的物质。
黄曲霉毒素难溶于水、己烷、乙醚和石油醚，易溶于甲醇、乙醇、氯仿和二甲基甲酰胺等有机溶剂，分子量为312-346，熔点为200-300℃。黄曲霉毒素耐高温，通常加热处理对其破坏很小，只有在熔点温度下才发生分解。黄曲霉毒素遇碱能迅速分解，但此反应可逆，即在酸性条件下又复原。一般来说，温度30℃、相对湿度80%、谷物水份在14%以上（花生的水份在9%以上）最适合黄曲霉繁殖和生长。在24-34℃之间，黄曲霉菌产毒量最高[6]。几乎所有谷物、饲草和各种食品（包括畜产品）都可作为黄曲霉基质[7]。
1.2 黄曲霉毒素与动物疾病和人类健康
黄曲霉毒素中毒主要对动物肝脏的伤害，受伤害的个体因动物种类年龄、性别和营养状态而异。研究结果表明，黄曲霉毒素可导致肝功能下降，降低牛奶产量和产蛋率，并使动物的免疫力降低，易受有害微生物的感染。此外，长期食用含低浓度黄曲霉毒素的饲料也可导致胚胎内中毒，通常年幼的动物对黄曲霉毒素更敏感。黄曲霉毒素的临床表现为消化系统功能紊乱，降低生育能力，降低饲料利用率，贫血等。黄曲霉毒素不仅能够使奶牛的产奶量下降，而且还使牛奶中含有转型的黄曲霉毒素M1和M2。据美国农业经济学家统计，由于食用黄曲霉毒素污染的饲料，每年至少要使美国畜牧业遭受10%的经济损失。在我国由此而带来的畜牧业损失可能会更大。
人类健康受黄曲霉毒素的危害主要是由于人们食用被黄曲霉毒素污染的食物。对于这一污染的预防是非常困难的，其原因是由于真菌在食物或食品原料中的存在是很普遍的。国家卫生部门禁止企业使用被严重污染的粮食进行食品加工生产，并制定相关的标准监督企业执行，但对于含黄曲霉毒素浓度较低的粮食和食品无法进行控制。在发展中国家，食用被黄曲霉毒素污染的食物与癌症的发病率呈正相关性。亚洲和非洲的疾病研究机构的研究工作表明，食物中黄曲霉毒素与肝细胞癌变呈正相关性，长时间食用含低浓度黄曲霉毒素的食物被认为是导致肝癌、胃癌、肠癌等疾病的主要原因[8]。1988年国际肿瘤研究机构将黄曲霉毒素B1列为人类致癌物。
2 黄曲霉毒素的检测方法
黄曲霉毒素的检测方法从最初以薄层层析法为主，发展到高效液相色谱法、微柱法、酶联免疫吸附法等多种方法普遍应用，其进展与新的化学检测手段和新仪器的出现密不可分。这些新方法、新手段的快速应用，为黄曲霉毒素的检测提供了更广泛的选择余地，适应了不同的检测目的和要求。
2.1 薄层层析法(TLC)
薄层层析法是测定黄曲霉毒素的经典方法，其原理是将样品经过提取、柱层析、洗脱、浓缩、薄层分离后，在波长365 nm紫外光下产生蓝紫色或黄绿色荧光，并根据其在薄层上显示的最低检出量来确定其含量。
聂孝同等[9]应用薄层层析法采用以下步骤对饲料中的黄曲霉毒素进行了检测。首先是黄曲霉毒素的提取：把粉碎过20目筛的样品放人具塞三角瓶中，加入
甲醇(55：45)溶液，再加入石油醚盖严，静置片刻后，用慢速定量滤纸过滤于分液漏斗中，通人三氯甲烷，再过滤并将滤液在65℃水浴上通风挥干，冷却后加入苯一乙腈(98：2)充分混合，然后吸取上清液待用。对杂质少的样品，采取直板定性。依次点板、展开、观察；其中预展展开剂为无水乙醚，正展展开剂为丙酮一三氯甲烷(1：9)，且展开剂要事先加入到展开槽内；通过观察，无荧光出现为阴性．出现荧光则为阳性，需作直板确证，若继续有荧光出现，则进一步作定量确证；样品的某一点荧光强度与标样点的荧光强度相一致，则取此点为样本的黄曲霉毒素含量值，否则作稀释定量检测；但是对于杂质多的样品，须采取横板定性；同样经过点板、展开、观察，有荧光者为阳性检出，进一步作横向确证，经再次检测观察呈阳性，则需要定量确证黄曲霉毒素含量。
为了提高薄层层析法的精度，建立薄层扫描法来测定黄曲霉毒素，它是薄层层析法的仪器化，样品的处理和层析条件与薄层层析法相同，只是在标准品的设定和结果判定上有所不同。杨焱等[10]把粉碎过筛的样品加水湿润后通人氯仿过滤，取滤液在65℃水浴上挥干，再用苯一乙脯溶液转移；通过点板，用乙醚预展后，再用氯仿一丙酮(92：8)展开，在365 nm紫外光下观察，根据AFB1、AFB2 、AFG1和AFG2分别显示的蓝紫色、蓝紫色、绿色和绿色荧光，在扫描仪上绘制AFrr扫描图谱，并由此分辨出黄曲霉毒素种类；最后作定量分析：以斑点面积积分值为纵坐标，标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线，建立回归方程，得到样品的黄曲霉毒素浓度。
2.2 高效液相色谱法(HPLC)
用高效液相色谱法测定黄曲霉毒素，一般分提取、净化、衍生和测定几个步骤。
提取通常是黄曲霉毒素分析的第一步，所用的仪器和溶剂有很多种[2,11]韩红岩等[12]对于受黄曲霉毒素污染不同程度的玉米用60％甲醇、80％丙酮、90％ 乙腈提取，均得到较高的回收率，其中，80％丙酮的毒性与乙腈、甲醇相比较小，操作较为安全，是提取黄曲霉毒素的最佳选择；王光建等[13]给样品中加入甲醇(6：
4)溶液，高速捣碎，将提取物于离心管离心5～10 min后，给上清液中加入氢氧化铁悬浮液搅匀，再加人Tris一盐酸缓冲液，离心后待用；李佐卿等[14] 首先加人氯化钠，再加人甲醇(1：9)超声震荡，经0.45um滤膜过滤即可，而加人氯化钠
的目的是作为抗原与抗体的稀释液，调节抗原与抗体反应时的pH值、电解质等，提高提取效果。文镜[15] 把经粉碎过20目筛的样品放人具塞锥形瓶内，用重蒸水湿润，通人氯仿振摇，然后加人无水硫酸钠经快速滤纸过滤备用。
专用于黄曲霉毒素净化分离的固相萃取方法主要有2类：一类是免疫亲和柱(IAC)，另一类是多功能净化柱(MFC)。免疫亲和柱是根据单克隆抗体与载体蛋白偶联后将其填柱形成IAC，并与黄曲霉毒素抗原产生一一对应的特异性吸附关系制作的。随着抗体抗原一一对应的特异性吸附关系，IAC只能高选择性地吸附黄曲霉毒素，而让其他杂质通过柱子，同时这种吸附又可被极性有机溶剂洗脱，供定量检测。王光建等[16] 用免疫亲和柱分离黄曲霉毒素，先加人DDH2O搅匀，以2～ 3 mL/min 速度通过免疫亲和柱，用10％ 甲醇溶液洗涤烧杯、针筒等。将洗涤液过柱，再用水洗涤，抽气除去柱中水滴，最后用甲醇洗脱，收集洗脱液。李佐卿等[17] 用免疫亲和柱净化黄曲霉毒素，先以2．5 mL/min 左右的流速过柱，再以4mL/min 左右的流速用水洗柱，弃去流出液，最后用甲醇以每秒1滴的速度洗脱，收集洗脱液；他认为样品过柱时的流速对回收率影响最大，建议用水洗柱时流速以4．0 mL/min 为佳，而以甲醇洗脱时应自然滴下，直至空气进人柱内，并且当甲醇的含量小于20％时，黄曲霉毒素B属的结果不受影响，而G属以甲醇(1：9)为佳。即使如此，G属的回收率也没有B属回收率高，这可能是因为B1的毒性最大，为了保证B1的回收率，在设计柱体时牺牲部分G属的回收率，使条件尽量对B1不十分苛刻。多功能净化柱(MFC)以极性、非极性及离子交换等几类基团组成填充剂，可选择性地吸附样液中的脂类、蛋白质等杂质，黄曲霉毒素不被吸附而直接通过，这样样品不需要进行活化、淋洗和洗脱操作，10 s内即可完成整个净化过程，净化效果理想。柳洁等[18] 利用该种方法，使提取液通过固定相进入套管，再将套管中的纯化液移至试管。除了上述方法外，宋欢[19] 应用佛罗里硅土层析柱，用氯仿一甲醇(9：1)淋洗，弃去流出液，最后用丙酮(99：1)溶液洗脱。文镜[20] 利用硅镁吸附柱，依次加人氯仿一乙烷(1：1)、氯仿一甲醇(9：1)，以2 mL/min 流速淋洗除去杂质，再用丙酮(99：1)溶液将混合液洗脱。
衍生方法可分为柱前衍生法和柱后衍生法。对黄曲霉毒素衍生的目的主要是为了增加测定时的荧光强度，柱前衍生法主要有三氟乙酸和稀盐酸法，柱后衍生法主要有溴法和碘法。柱后衍生需增加泵、校后反应器和控温箱等装量。在实践
中以柱前衍生较多，因柱前衍生法容易推广，且大多采用三氟乙酸衍生，并在衍生前后分别用氮气或直接吹气挥干[21]。还可用其他溶剂衍生，如李佐卿[22] 利用己烷和三氟乙酸，文镜[23] 利用正己烷和三氟乙酸进行衍生等，亦取得了理想效果。
高效液相色谱法测定黄曲霉毒素，选用的激发波长为365 nm，发射波长为450 nm，以保留时间定性，峰面积定量，这些基本参数大致相同，但在流动相的选用上却差异较大。宋欢采用30％ 甲醇溶液作为流动相，流速为1.2 mL/min;王光建等采用水一甲醇一四氢呋喃(575：420：5)作为流动相，流速为1 mL/min；文镜 131采用磷酸二氢钾一甲醇(1：1)作为流动相，流速为1.5 mL/min；李佐卿等采用水一异丙醇一乙腈(80：12：8)作为流动相，流速为0.7 mL/min；柳洁等采用甲醇一乙腈一水(15：13：72)作为流动相。此外，高效液相色谱法测定黄曲霉毒素还有许多其他的流动相组合，例如水一乙脂一乙酸(45：53：2)、乙腈一水(3：
7)、水一乙腈一甲醇(60：30：10)等。
2.3 微柱法
微柱法测定黄曲霉毒素，是利用微柱管内的硅镁型吸附剂吸附黄曲霉毒素并在365 nm紫外光下显示荧光，其强度与一定浓度的黄曲霉毒素含量成正比关系，由此可简略定量黄曲霉毒素。
陈达民通过微柱法采用以下步骤测定黄曲霉毒素：先把粉碎过20目筛的样品放在碘价瓶中，加入石油醚和甲醇溶液，给瓶塞上涂一层水，盖严防漏，放在振荡器上振荡；等静置分层后，用快速定性滤纸过滤，用移液管吸取甲醇溶液并加人氯仿，再静置分层，将氯仿提取液经无水硫酸钠脱水过滤，加人制好的微柱管中，待加液流至顶层时，加人氯仿一丙酮(9：1)展开剂展开，流完后即可在365 nm紫外光下观察结果，有微黄色荧光出现，则样品不含黄曲霉毒素，若蓝紫色荧光出现，则为阳性检出，再根据其荧光强度与事先已知含量的黄曲霉毒素标准管相比较确定其含量。
2.4 酶联免疫吸附法(ELISA)
酶联免疫吸附法是抗原(抗体)吸附剂和用酶标记的抗体(抗原)与标本中的待测物(抗原和抗体)起特异的免疫学反应，用测定酶活力的方法来增加测定的敏感度。大致采用两种方式检测黄曲霉毒素，一种是用双抗体夹心法，另一种是用竞
中以柱前衍生较多，因柱前衍生法容易推广，且大多采用三氟乙酸衍生，并在衍生前后分别用氮气或直接吹气挥干[21]。还可用其他溶剂衍生，如李佐卿[22] 利用己烷和三氟乙酸，文镜[23] 利用正己烷和三氟乙酸进行衍生等，亦取得了理想效果。
高效液相色谱法测定黄曲霉毒素，选用的激发波长为365 nm，发射波长为450 nm，以保留时间定性，峰面积定量，这些基本参数大致相同，但在流动相的选用上却差异较大。宋欢采用30％ 甲醇溶液作为流动相，流速为1.2 mL/min;王光建等采用水一甲醇一四氢呋喃(575：420：5)作为流动相，流速为1 mL/min；文镜 131采用磷酸二氢钾一甲醇(1：1)作为流动相，流速为1.5 mL/min；李佐卿等采用水一异丙醇一乙腈(80：12：8)作为流动相，流速为0.7 mL/min；柳洁等采用甲醇一乙腈一水(15：13：72)作为流动相。此外，高效液相色谱法测定黄曲霉毒素还有许多其他的流动相组合，例如水一乙脂一乙酸(45：53：2)、乙腈一水(3：
7)、水一乙腈一甲醇(60：30：10)等。
2.3 微柱法
微柱法测定黄曲霉毒素，是利用微柱管内的硅镁型吸附剂吸附黄曲霉毒素并在365 nm紫外光下显示荧光，其强度与一定浓度的黄曲霉毒素含量成正比关系，由此可简略定量黄曲霉毒素。
陈达民通过微柱法采用以下步骤测定黄曲霉毒素：先把粉碎过20目筛的样品放在碘价瓶中，加入石油醚和甲醇溶液，给瓶塞上涂一层水，盖严防漏，放在振荡器上振荡；等静置分层后，用快速定性滤纸过滤，用移液管吸取甲醇溶液并加人氯仿，再静置分层，将氯仿提取液经无水硫酸钠脱水过滤，加人制好的微柱管中，待加液流至顶层时，加人氯仿一丙酮(9：1)展开剂展开，流完后即可在365 nm紫外光下观察结果，有微黄色荧光出现，则样品不含黄曲霉毒素，若蓝紫色荧光出现，则为阳性检出，再根据其荧光强度与事先已知含量的黄曲霉毒素标准管相比较确定其含量。
2.4 酶联免疫吸附法(ELISA)
酶联免疫吸附法是抗原(抗体)吸附剂和用酶标记的抗体(抗原)与标本中的待测物(抗原和抗体)起特异的免疫学反应，用测定酶活力的方法来增加测定的敏感度。大致采用两种方式检测黄曲霉毒素，一种是用双抗体夹心法，另一种是用竞
争法。
Holladay等采取间接ELISA技术，检测了抗黄曲霉毒素M。一牛血清白蛋白(AFM 一BSA)免疫原的特异性AFM，抗体。为了使用方便，利用酶联免疫原理研制出黄曲霉毒素快速测试盒，能简便地定量测定黄曲霉毒素含量。赵晓联等应用这种快速测试盒测定黄曲霉毒素含量，先用三氯甲烷提取样品，过滤，收集并水浴挥干提取液，再以甲醇(5：5)溶解，最后用专用黄曲霉毒素试剂盒测定。
2.5 其他方法
超光谱(HS)方法是基于反射能基础上的一种非侵入无破坏的映像技术，用于农产品检测中，能够快速地提供该产品的有关化学和其他方面的内部细节。David Casasent等尝试性地用它来检测玉米中黄曲霉毒素含量，但它似乎能更好地用于霉菌识别。进一步地开发利用还有待于解决HS特征选择的最优化问题。另据研究报道，培训黄蜂可用于黄曲霉毒素检测。由于黄曲霉毒素主要是由黄曲霉产生的，寄生黄蜂通过培训能把黄曲霉的气味和糖水联系起来，并对这些气味产生有区别的行为反应，借此来识别目标气味的存在。这种培训反应正在应用于储藏玉米、花生的黄曲霉毒素监控和检测实践当中，目前还未给出有关的结果评定。
3 黄曲霉检测技术的展望
薄层层析法对样品处理繁琐，实验过程复杂，所需时间多，易受杂质干扰，较适合于对黄曲霉毒素的定性检测，是研究黄曲霉毒素初期所使用的主要方法。今后，虽然薄层层析法在不断地改进，并在一般实验室均可完成操作，但由于它复杂的前处理过程致使在应用中仍然会受到一定程度的限制。
高效液相色谱法测定黄曲霉毒素，技术水平要求较高，目前采用这种方法检测黄曲霉毒素较多，但具体一次实验所使用的化学药剂和处理途径差别很大，对实验结果的精度造成影响，这种方法还应在实践中进一步改进。但总体上说高效液相色谱法操作较为简便，同时可检测多个黄曲霉毒素种类，适于大批量样品的分析。将免疫亲和柱与高效液相色谱法结合应用，是目前采用较多的一种方法，今后将被广泛应用。
微柱法测定黄曲霉毒素，主要是用来检验黄曲霉毒素的存在与否以及快速筛选出超标样品，而要对黄曲霉毒素种类进行区分定量检验，则需要对不同黄曲霉
毒素组分进行分离，再利用其他方法检测。因此．微柱法并不能完成整个黄曲霉毒素检测过程，仅适用于定性检验。
酶联免疫吸附法操作简便，使用较为安全，但由于酶本身的不稳定性，用此方法检验黄曲霉毒素有可能带来假阳、阴性结果，而且研制出的黄曲霉毒素快速测试盒多以测定最具毒性的种属为主，食品和饲料工业上利用它来界定食品或饲料中黄曲霉毒素的超标问题。酶联免疫吸附法的检测精度还有待于提高。 参考文献
[1] 李荣启，范自营.粮食中黄曲霉毒素污染.粮食与油脂，2006, 8,17.
[2] 蔡静平.真菌对食品安全性的影响..粮油食品微生物学,2003, 1:296～301.
[3] 吴梅松.浅谈黄曲霉毒素的预防及去除.西部粮油科技.1997, 1,45.
[4] 吴丹.黄曲霉毒素在粮食和食品中的危害及防治.粮食加工,2007,3,91.
[5] 栾丽杰.黄曲霉毒素与食品安全.山东省农业管理干部学院学报,2005,6.
[6] Kwak MK，Patricia AE，Patrick MD，et a1．Role ofphase 2 enzyme induction in
chemoprotection by dithiolethiones[J]．Mut Res／Fun and Mol Mec of Mut，2001，480—481(1)：305—315.
[7] Wang JS，Huang T，Su JJ，et a1．Hepatocellular Carcinoma and Aflatoxin Exposure in Zhuqing
Village，Fusui County，Peoples Republic of China．Cancer Epidemiology[J]．Bio＆Pre，2001，10(2)：143—146.
[8] 李荣启，范自营.粮食中黄曲霉毒素污染.粮食与油脂，2006,8.17.
[9] 蔡静平.真菌对食品安全性的影响..粮油食品微生物学,2003,1:296～301.
[10] 吴梅松.浅谈黄曲霉毒素的预防及去除.西部粮油科技.1997,1.45.
[11] 聂孝同，卢大云．饲料黄曲霉毒素的检测方法[J]．贵州畜牧兽医，1993，17(1)：4l～
42.
[12] 杨焱，宓晓黎，成恒嵩等．薄层扫描法测定饲料中黄曲霉毒素B，的含量[J]．饲料工
业，1996，17(10)：36～37.
[13] Edward J T．Improved liquid chromatographic method for determination of aflatoxins in
peanut butter and other commodities[J]．J AOAC，1984，67(3)：597～600.
[14] 韩红岩，汪军．玉米中黄曲霉毒素提取方法的评价[J]．山东农业大学学报，1999，30(3)：
241～244.
[15] 王光建，何才云，鲁长豪等1995，13(4)：238～240.
[16] 李佐卿，谢东华，孙大为等.用免疫亲和柱分离、高效液相色谱法测定花生和玉米中黄
曲霉毒素的研究[J]．色谱，免疫亲和柱HPLC荧光检测酒中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2 [J]．光谱实验室，2001，8(1)：28—31.
[17] 文镜．玉米中黄曲霉毒素B1的硅镁吸附柱层析分离纯化及HPLC的定量分析[J]．食品
科学，1996，17(1)：68～70.
[18] 柳洁，何碧英．高效液相色谱法测定食品中黄曲霉毒素的方法研究[J]．现代预防医学，
2002，29(2)：137～140.
[19] 宋欢．液相色谱法测定饲料中的黄曲霉毒素B1[J]．山西农业大学学报，2001，21(3)：
257～258.
[20] 黄惠明，徐群英，胡敏．黄曲霉毒素检测方法研究的概述[J]．中国卫生检验杂志，2001，
11(4)：510～512.
[21] 陈达民．微柱法快速测定饲料中黄曲霉素的总量[J]．饲料工业，1993，14(1)：29～ 30.
[22] S D Holladay．问接酶联免疫吸附试验检测黄曲霉毒素抗体的评价[J]．贵州畜牧兽医，
1993，17(1)：46～47.
[23] 赵晓联，赵春城，钮伟民等．酶联免疫吸附法测定黄曲霉毒素B1误差分析[J]．中国卫
生检验杂志，2001，11(4)：473～ 474.
黄曲霉毒素的检测方法研究
应用化学 20096842 杨兰森
摘要：黄曲霉毒素(AFT)是一类有毒致癌化合物，污染粮食及其制品，给人类健康造成严重威胁。黄曲霉毒素(AFT)是迄今发现的毒性最强的一类生物毒素，有AFB1、AFB2、AFG1、AFG2等多种形式。本文介绍了黄曲霉毒素的理化性质，对人
和动物的危害等，并且对目前用于黄曲霉毒素的检测方法进行了综述。在对薄层层析法、高效液相色谱法、微柱法及酶联免疫吸附法等检测方法综合分析的基础上，评述了上述方法的优劣和适用条件。
关键词：黄曲霉毒素 危害 检测方法 进展
黄曲霉毒素(AFT)主要是由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的一类有毒次生代谢物。在世界不同地区都发现了这些真菌大量存在于供人类食用的食品中，黄曲霉毒素污染已导致严重的食品安全问题[1,2]。自20世纪60年代以来，有关黄曲霉毒素的危害被大量报道,以致黄曲霉毒素已成为最受人们关注的一种真菌毒素
[3]。阐明黄曲霉毒素的治病机理，快速，准确地检测食品中黄曲霉度的含量，并制定相应的标准，采取适当的预防措施来降低其危害已成为近来食品、饲料检测研究的重点。
1 黄曲霉毒素概述
1.1 黄曲霉毒素的理化性质
黄曲霉毒素是一组化学结构类似的化合物，目前已分离鉴定出12种，包括B1，B2，G1，G2，M1，M2，P1，Q，H1，GM，B2a和毒醇[4]。黄曲霉毒素的的基本结构为二呋喃环和香豆素，B1是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，即含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮(香豆素)，前者为基本毒性结构，后者与其致癌性有关[5]。M1是黄曲霉毒素B1在体内经过羟化而衍生成的代谢产物。黄曲霉毒素的主要分子形式含 B1，B2，G1，G2，M1，M2等，其中M1和M2主要存在于牛奶中，B1为毒性及致癌性最强的物质。
黄曲霉毒素难溶于水、己烷、乙醚和石油醚，易溶于甲醇、乙醇、氯仿和二甲基甲酰胺等有机溶剂，分子量为312-346，熔点为200-300℃。黄曲霉毒素耐高温，通常加热处理对其破坏很小，只有在熔点温度下才发生分解。黄曲霉毒素遇碱能迅速分解，但此反应可逆，即在酸性条件下又复原。一般来说，温度30℃、相对湿度80%、谷物水份在14%以上（花生的水份在9%以上）最适合黄曲霉繁殖和生长。在24-34℃之间，黄曲霉菌产毒量最高[6]。几乎所有谷物、饲草和各种食品（包括畜产品）都可作为黄曲霉基质[7]。
1.2 黄曲霉毒素与动物疾病和人类健康
黄曲霉毒素中毒主要对动物肝脏的伤害，受伤害的个体因动物种类年龄、性别和营养状态而异。研究结果表明，黄曲霉毒素可导致肝功能下降，降低牛奶产量和产蛋率，并使动物的免疫力降低，易受有害微生物的感染。此外，长期食用含低浓度黄曲霉毒素的饲料也可导致胚胎内中毒，通常年幼的动物对黄曲霉毒素更敏感。黄曲霉毒素的临床表现为消化系统功能紊乱，降低生育能力，降低饲料利用率，贫血等。黄曲霉毒素不仅能够使奶牛的产奶量下降，而且还使牛奶中含有转型的黄曲霉毒素M1和M2。据美国农业经济学家统计，由于食用黄曲霉毒素污染的饲料，每年至少要使美国畜牧业遭受10%的经济损失。在我国由此而带来的畜牧业损失可能会更大。
人类健康受黄曲霉毒素的危害主要是由于人们食用被黄曲霉毒素污染的食物。对于这一污染的预防是非常困难的，其原因是由于真菌在食物或食品原料中的存在是很普遍的。国家卫生部门禁止企业使用被严重污染的粮食进行食品加工生产，并制定相关的标准监督企业执行，但对于含黄曲霉毒素浓度较低的粮食和食品无法进行控制。在发展中国家，食用被黄曲霉毒素污染的食物与癌症的发病率呈正相关性。亚洲和非洲的疾病研究机构的研究工作表明，食物中黄曲霉毒素与肝细胞癌变呈正相关性，长时间食用含低浓度黄曲霉毒素的食物被认为是导致肝癌、胃癌、肠癌等疾病的主要原因[8]。1988年国际肿瘤研究机构将黄曲霉毒素B1列为人类致癌物。
2 黄曲霉毒素的检测方法
黄曲霉毒素的检测方法从最初以薄层层析法为主，发展到高效液相色谱法、微柱法、酶联免疫吸附法等多种方法普遍应用，其进展与新的化学检测手段和新仪器的出现密不可分。这些新方法、新手段的快速应用，为黄曲霉毒素的检测提供了更广泛的选择余地，适应了不同的检测目的和要求。
2.1 薄层层析法(TLC)
薄层层析法是测定黄曲霉毒素的经典方法，其原理是将样品经过提取、柱层析、洗脱、浓缩、薄层分离后，在波长365 nm紫外光下产生蓝紫色或黄绿色荧光，并根据其在薄层上显示的最低检出量来确定其含量。
聂孝同等[9]应用薄层层析法采用以下步骤对饲料中的黄曲霉毒素进行了检测。首先是黄曲霉毒素的提取：把粉碎过20目筛的样品放人具塞三角瓶中，加入
甲醇(55：45)溶液，再加入石油醚盖严，静置片刻后，用慢速定量滤纸过滤于分液漏斗中，通人三氯甲烷，再过滤并将滤液在65℃水浴上通风挥干，冷却后加入苯一乙腈(98：2)充分混合，然后吸取上清液待用。对杂质少的样品，采取直板定性。依次点板、展开、观察；其中预展展开剂为无水乙醚，正展展开剂为丙酮一三氯甲烷(1：9)，且展开剂要事先加入到展开槽内；通过观察，无荧光出现为阴性．出现荧光则为阳性，需作直板确证，若继续有荧光出现，则进一步作定量确证；样品的某一点荧光强度与标样点的荧光强度相一致，则取此点为样本的黄曲霉毒素含量值，否则作稀释定量检测；但是对于杂质多的样品，须采取横板定性；同样经过点板、展开、观察，有荧光者为阳性检出，进一步作横向确证，经再次检测观察呈阳性，则需要定量确证黄曲霉毒素含量。
为了提高薄层层析法的精度，建立薄层扫描法来测定黄曲霉毒素，它是薄层层析法的仪器化，样品的处理和层析条件与薄层层析法相同，只是在标准品的设定和结果判定上有所不同。杨焱等[10]把粉碎过筛的样品加水湿润后通人氯仿过滤，取滤液在65℃水浴上挥干，再用苯一乙脯溶液转移；通过点板，用乙醚预展后，再用氯仿一丙酮(92：8)展开，在365 nm紫外光下观察，根据AFB1、AFB2 、AFG1和AFG2分别显示的蓝紫色、蓝紫色、绿色和绿色荧光，在扫描仪上绘制AFrr扫描图谱，并由此分辨出黄曲霉毒素种类；最后作定量分析：以斑点面积积分值为纵坐标，标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线，建立回归方程，得到样品的黄曲霉毒素浓度。
2.2 高效液相色谱法(HPLC)
用高效液相色谱法测定黄曲霉毒素，一般分提取、净化、衍生和测定几个步骤。
提取通常是黄曲霉毒素分析的第一步，所用的仪器和溶剂有很多种[2,11]韩红岩等[12]对于受黄曲霉毒素污染不同程度的玉米用60％甲醇、80％丙酮、90％ 乙腈提取，均得到较高的回收率，其中，80％丙酮的毒性与乙腈、甲醇相比较小，操作较为安全，是提取黄曲霉毒素的最佳选择；王光建等[13]给样品中加入甲醇(6：
4)溶液，高速捣碎，将提取物于离心管离心5～10 min后，给上清液中加入氢氧化铁悬浮液搅匀，再加人Tris一盐酸缓冲液，离心后待用；李佐卿等[14] 首先加人氯化钠，再加人甲醇(1：9)超声震荡，经0.45um滤膜过滤即可，而加人氯化钠
的目的是作为抗原与抗体的稀释液，调节抗原与抗体反应时的pH值、电解质等，提高提取效果。文镜[15] 把经粉碎过20目筛的样品放人具塞锥形瓶内，用重蒸水湿润，通人氯仿振摇，然后加人无水硫酸钠经快速滤纸过滤备用。
专用于黄曲霉毒素净化分离的固相萃取方法主要有2类：一类是免疫亲和柱(IAC)，另一类是多功能净化柱(MFC)。免疫亲和柱是根据单克隆抗体与载体蛋白偶联后将其填柱形成IAC，并与黄曲霉毒素抗原产生一一对应的特异性吸附关系制作的。随着抗体抗原一一对应的特异性吸附关系，IAC只能高选择性地吸附黄曲霉毒素，而让其他杂质通过柱子，同时这种吸附又可被极性有机溶剂洗脱，供定量检测。王光建等[16] 用免疫亲和柱分离黄曲霉毒素，先加人DDH2O搅匀，以2～ 3 mL/min 速度通过免疫亲和柱，用10％ 甲醇溶液洗涤烧杯、针筒等。将洗涤液过柱，再用水洗涤，抽气除去柱中水滴，最后用甲醇洗脱，收集洗脱液。李佐卿等[17] 用免疫亲和柱净化黄曲霉毒素，先以2．5 mL/min 左右的流速过柱，再以4mL/min 左右的流速用水洗柱，弃去流出液，最后用甲醇以每秒1滴的速度洗脱，收集洗脱液；他认为样品过柱时的流速对回收率影响最大，建议用水洗柱时流速以4．0 mL/min 为佳，而以甲醇洗脱时应自然滴下，直至空气进人柱内，并且当甲醇的含量小于20％时，黄曲霉毒素B属的结果不受影响，而G属以甲醇(1：9)为佳。即使如此，G属的回收率也没有B属回收率高，这可能是因为B1的毒性最大，为了保证B1的回收率，在设计柱体时牺牲部分G属的回收率，使条件尽量对B1不十分苛刻。多功能净化柱(MFC)以极性、非极性及离子交换等几类基团组成填充剂，可选择性地吸附样液中的脂类、蛋白质等杂质，黄曲霉毒素不被吸附而直接通过，这样样品不需要进行活化、淋洗和洗脱操作，10 s内即可完成整个净化过程，净化效果理想。柳洁等[18] 利用该种方法，使提取液通过固定相进入套管，再将套管中的纯化液移至试管。除了上述方法外，宋欢[19] 应用佛罗里硅土层析柱，用氯仿一甲醇(9：1)淋洗，弃去流出液，最后用丙酮(99：1)溶液洗脱。文镜[20] 利用硅镁吸附柱，依次加人氯仿一乙烷(1：1)、氯仿一甲醇(9：1)，以2 mL/min 流速淋洗除去杂质，再用丙酮(99：1)溶液将混合液洗脱。
衍生方法可分为柱前衍生法和柱后衍生法。对黄曲霉毒素衍生的目的主要是为了增加测定时的荧光强度，柱前衍生法主要有三氟乙酸和稀盐酸法，柱后衍生法主要有溴法和碘法。柱后衍生需增加泵、校后反应器和控温箱等装量。在实践
中以柱前衍生较多，因柱前衍生法容易推广，且大多采用三氟乙酸衍生，并在衍生前后分别用氮气或直接吹气挥干[21]。还可用其他溶剂衍生，如李佐卿[22] 利用己烷和三氟乙酸，文镜[23] 利用正己烷和三氟乙酸进行衍生等，亦取得了理想效果。
高效液相色谱法测定黄曲霉毒素，选用的激发波长为365 nm，发射波长为450 nm，以保留时间定性，峰面积定量，这些基本参数大致相同，但在流动相的选用上却差异较大。宋欢采用30％ 甲醇溶液作为流动相，流速为1.2 mL/min;王光建等采用水一甲醇一四氢呋喃(575：420：5)作为流动相，流速为1 mL/min；文镜 131采用磷酸二氢钾一甲醇(1：1)作为流动相，流速为1.5 mL/min；李佐卿等采用水一异丙醇一乙腈(80：12：8)作为流动相，流速为0.7 mL/min；柳洁等采用甲醇一乙腈一水(15：13：72)作为流动相。此外，高效液相色谱法测定黄曲霉毒素还有许多其他的流动相组合，例如水一乙脂一乙酸(45：53：2)、乙腈一水(3：
7)、水一乙腈一甲醇(60：30：10)等。
2.3 微柱法
微柱法测定黄曲霉毒素，是利用微柱管内的硅镁型吸附剂吸附黄曲霉毒素并在365 nm紫外光下显示荧光，其强度与一定浓度的黄曲霉毒素含量成正比关系，由此可简略定量黄曲霉毒素。
陈达民通过微柱法采用以下步骤测定黄曲霉毒素：先把粉碎过20目筛的样品放在碘价瓶中，加入石油醚和甲醇溶液，给瓶塞上涂一层水，盖严防漏，放在振荡器上振荡；等静置分层后，用快速定性滤纸过滤，用移液管吸取甲醇溶液并加人氯仿，再静置分层，将氯仿提取液经无水硫酸钠脱水过滤，加人制好的微柱管中，待加液流至顶层时，加人氯仿一丙酮(9：1)展开剂展开，流完后即可在365 nm紫外光下观察结果，有微黄色荧光出现，则样品不含黄曲霉毒素，若蓝紫色荧光出现，则为阳性检出，再根据其荧光强度与事先已知含量的黄曲霉毒素标准管相比较确定其含量。
2.4 酶联免疫吸附法(ELISA)
酶联免疫吸附法是抗原(抗体)吸附剂和用酶标记的抗体(抗原)与标本中的待测物(抗原和抗体)起特异的免疫学反应，用测定酶活力的方法来增加测定的敏感度。大致采用两种方式检测黄曲霉毒素，一种是用双抗体夹心法，另一种是用竞
中以柱前衍生较多，因柱前衍生法容易推广，且大多采用三氟乙酸衍生，并在衍生前后分别用氮气或直接吹气挥干[21]。还可用其他溶剂衍生，如李佐卿[22] 利用己烷和三氟乙酸，文镜[23] 利用正己烷和三氟乙酸进行衍生等，亦取得了理想效果。
高效液相色谱法测定黄曲霉毒素，选用的激发波长为365 nm，发射波长为450 nm，以保留时间定性，峰面积定量，这些基本参数大致相同，但在流动相的选用上却差异较大。宋欢采用30％ 甲醇溶液作为流动相，流速为1.2 mL/min;王光建等采用水一甲醇一四氢呋喃(575：420：5)作为流动相，流速为1 mL/min；文镜 131采用磷酸二氢钾一甲醇(1：1)作为流动相，流速为1.5 mL/min；李佐卿等采用水一异丙醇一乙腈(80：12：8)作为流动相，流速为0.7 mL/min；柳洁等采用甲醇一乙腈一水(15：13：72)作为流动相。此外，高效液相色谱法测定黄曲霉毒素还有许多其他的流动相组合，例如水一乙脂一乙酸(45：53：2)、乙腈一水(3：
7)、水一乙腈一甲醇(60：30：10)等。
2.3 微柱法
微柱法测定黄曲霉毒素，是利用微柱管内的硅镁型吸附剂吸附黄曲霉毒素并在365 nm紫外光下显示荧光，其强度与一定浓度的黄曲霉毒素含量成正比关系，由此可简略定量黄曲霉毒素。
陈达民通过微柱法采用以下步骤测定黄曲霉毒素：先把粉碎过20目筛的样品放在碘价瓶中，加入石油醚和甲醇溶液，给瓶塞上涂一层水，盖严防漏，放在振荡器上振荡；等静置分层后，用快速定性滤纸过滤，用移液管吸取甲醇溶液并加人氯仿，再静置分层，将氯仿提取液经无水硫酸钠脱水过滤，加人制好的微柱管中，待加液流至顶层时，加人氯仿一丙酮(9：1)展开剂展开，流完后即可在365 nm紫外光下观察结果，有微黄色荧光出现，则样品不含黄曲霉毒素，若蓝紫色荧光出现，则为阳性检出，再根据其荧光强度与事先已知含量的黄曲霉毒素标准管相比较确定其含量。
2.4 酶联免疫吸附法(ELISA)
酶联免疫吸附法是抗原(抗体)吸附剂和用酶标记的抗体(抗原)与标本中的待测物(抗原和抗体)起特异的免疫学反应，用测定酶活力的方法来增加测定的敏感度。大致采用两种方式检测黄曲霉毒素，一种是用双抗体夹心法，另一种是用竞
争法。
Holladay等采取间接ELISA技术，检测了抗黄曲霉毒素M。一牛血清白蛋白(AFM 一BSA)免疫原的特异性AFM，抗体。为了使用方便，利用酶联免疫原理研制出黄曲霉毒素快速测试盒，能简便地定量测定黄曲霉毒素含量。赵晓联等应用这种快速测试盒测定黄曲霉毒素含量，先用三氯甲烷提取样品，过滤，收集并水浴挥干提取液，再以甲醇(5：5)溶解，最后用专用黄曲霉毒素试剂盒测定。
2.5 其他方法
超光谱(HS)方法是基于反射能基础上的一种非侵入无破坏的映像技术，用于农产品检测中，能够快速地提供该产品的有关化学和其他方面的内部细节。David Casasent等尝试性地用它来检测玉米中黄曲霉毒素含量，但它似乎能更好地用于霉菌识别。进一步地开发利用还有待于解决HS特征选择的最优化问题。另据研究报道，培训黄蜂可用于黄曲霉毒素检测。由于黄曲霉毒素主要是由黄曲霉产生的，寄生黄蜂通过培训能把黄曲霉的气味和糖水联系起来，并对这些气味产生有区别的行为反应，借此来识别目标气味的存在。这种培训反应正在应用于储藏玉米、花生的黄曲霉毒素监控和检测实践当中，目前还未给出有关的结果评定。
3 黄曲霉检测技术的展望
薄层层析法对样品处理繁琐，实验过程复杂，所需时间多，易受杂质干扰，较适合于对黄曲霉毒素的定性检测，是研究黄曲霉毒素初期所使用的主要方法。今后，虽然薄层层析法在不断地改进，并在一般实验室均可完成操作，但由于它复杂的前处理过程致使在应用中仍然会受到一定程度的限制。
高效液相色谱法测定黄曲霉毒素，技术水平要求较高，目前采用这种方法检测黄曲霉毒素较多，但具体一次实验所使用的化学药剂和处理途径差别很大，对实验结果的精度造成影响，这种方法还应在实践中进一步改进。但总体上说高效液相色谱法操作较为简便，同时可检测多个黄曲霉毒素种类，适于大批量样品的分析。将免疫亲和柱与高效液相色谱法结合应用，是目前采用较多的一种方法，今后将被广泛应用。
微柱法测定黄曲霉毒素，主要是用来检验黄曲霉毒素的存在与否以及快速筛选出超标样品，而要对黄曲霉毒素种类进行区分定量检验，则需要对不同黄曲霉
毒素组分进行分离，再利用其他方法检测。因此．微柱法并不能完成整个黄曲霉毒素检测过程，仅适用于定性检验。
酶联免疫吸附法操作简便，使用较为安全，但由于酶本身的不稳定性，用此方法检验黄曲霉毒素有可能带来假阳、阴性结果，而且研制出的黄曲霉毒素快速测试盒多以测定最具毒性的种属为主，食品和饲料工业上利用它来界定食品或饲料中黄曲霉毒素的超标问题。酶联免疫吸附法的检测精度还有待于提高。 参考文献
[1] 李荣启，范自营.粮食中黄曲霉毒素污染.粮食与油脂，2006, 8,17.
[2] 蔡静平.真菌对食品安全性的影响..粮油食品微生物学,2003, 1:296～301.
[3] 吴梅松.浅谈黄曲霉毒素的预防及去除.西部粮油科技.1997, 1,45.
[4] 吴丹.黄曲霉毒素在粮食和食品中的危害及防治.粮食加工,2007,3,91.
[5] 栾丽杰.黄曲霉毒素与食品安全.山东省农业管理干部学院学报,2005,6.
[6] Kwak MK，Patricia AE，Patrick MD，et a1．Role ofphase 2 enzyme induction in
chemoprotection by dithiolethiones[J]．Mut Res／Fun and Mol Mec of Mut，2001，480—481(1)：305—315.
[7] Wang JS，Huang T，Su JJ，et a1．Hepatocellular Carcinoma and Aflatoxin Exposure in Zhuqing
Village，Fusui County，Peoples Republic of China．Cancer Epidemiology[J]．Bio＆Pre，2001，10(2)：143—146.
[8] 李荣启，范自营.粮食中黄曲霉毒素污染.粮食与油脂，2006,8.17.
[9] 蔡静平.真菌对食品安全性的影响..粮油食品微生物学,2003,1:296～301.
[10] 吴梅松.浅谈黄曲霉毒素的预防及去除.西部粮油科技.1997,1.45.
[11] 聂孝同，卢大云．饲料黄曲霉毒素的检测方法[J]．贵州畜牧兽医，1993，17(1)：4l～
42.
[12] 杨焱，宓晓黎，成恒嵩等．薄层扫描法测定饲料中黄曲霉毒素B，的含量[J]．饲料工
业，1996，17(10)：36～37.
[13] Edward J T．Improved liquid chromatographic method for determination of aflatoxins in
peanut butter and other commodities[J]．J AOAC，1984，67(3)：597～600.
[14] 韩红岩，汪军．玉米中黄曲霉毒素提取方法的评价[J]．山东农业大学学报，1999，30(3)：
241～244.
[15] 王光建，何才云，鲁长豪等1995，13(4)：238～240.
[16] 李佐卿，谢东华，孙大为等.用免疫亲和柱分离、高效液相色谱法测定花生和玉米中黄
曲霉毒素的研究[J]．色谱，免疫亲和柱HPLC荧光检测酒中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2 [J]．光谱实验室，2001，8(1)：28—31.
[17] 文镜．玉米中黄曲霉毒素B1的硅镁吸附柱层析分离纯化及HPLC的定量分析[J]．食品
科学，1996，17(1)：68～70.
[18] 柳洁，何碧英．高效液相色谱法测定食品中黄曲霉毒素的方法研究[J]．现代预防医学，
2002，29(2)：137～140.
[19] 宋欢．液相色谱法测定饲料中的黄曲霉毒素B1[J]．山西农业大学学报，2001，21(3)：
257～258.
[20] 黄惠明，徐群英，胡敏．黄曲霉毒素检测方法研究的概述[J]．中国卫生检验杂志，2001，
11(4)：510～512.
[21] 陈达民．微柱法快速测定饲料中黄曲霉素的总量[J]．饲料工业，1993，14(1)：29～ 30.
[22] S D Holladay．问接酶联免疫吸附试验检测黄曲霉毒素抗体的评价[J]．贵州畜牧兽医，
1993，17(1)：46～47.
[23] 赵晓联，赵春城，钮伟民等．酶联免疫吸附法测定黄曲霉毒素B1误差分析[J]．中国卫
生检验杂志，2001，11(4)：473～ 474.