摘要 半胱氨酸的巯基具有很高的反应活性，作为亲核、氧化还原催化反应、金属结合及变构调节位点等在蛋白质的结构和功能中发挥着非常重要的作用，且容易发生多种翻译后修饰，调控亦或损伤蛋白功能，与人类许多重要疾病关系密切，因此，定性与定量分析蛋白质半胱氨酸上的翻译后修饰组对理解其生物学功能具有重要意义。本文综述了近年来蛋白质半胱氨酸上常见的翻译后修饰组的质谱和蛋白质组学分析方法进展。
关键词半胱氨酸；蛋白质翻译后修饰；质谱；蛋白质组学；综述
1引言
自20世纪80年代以来，一系列软电离技术如基质辅助激光解吸电离（MALDI）[1＼]和电喷雾电离（ESI）[2＼]发现后，生物质谱（MS）技术得到了迅速发展，为生命科学各领域包括蛋白质翻译后修饰的研究提供了高通量、高灵敏和高分辨的分析平台，并已成为现代生物技术快速发展的重要支撑。它不仅可提供修饰蛋白质的类型和位点信息，且可定量研究其修饰程度及变化，促进了人们对蛋白翻译后修饰的理解。半胱氨酸（Cys，C）是一种存在于大多数蛋白质中频次较低的氨基酸（约占1%～2%）[3＼]，但Cys的巯基反应活性高（亲核性和氧化还原敏感性），常作为氧化还原催化反应、金属结合及变构调节位点等在蛋白质的结构和功能中发挥重要作用，参与调控细胞识别、信号传导等生理过程[4＼]。Cys巯基对细胞内局部环境的变化很敏感，易发生一系列非酶或酶催化的翻译后修饰，从而快速、动态调控蛋白质的构型、活性等，甚至导致蛋白功能损伤，与人类许多重要疾病关系密切，因此，对蛋白质Cys上的翻译后修饰组的研究具有十分重要的生物学意义，受到研究者的广泛关注。但研究对象多为复杂的生物样品，蛋白质丰度变化范围大，而Cys被修饰的蛋白质/肽段大多丰度较低，在质谱分析过程中的信号容易受到抑制，常需特异富集后才能被有效鉴定；Cys上修饰种类多，但性质各异，在样品处理或质谱分析时大多不稳定，常需建立合适的质谱方法进行分析。此外，在质谱分析过程中，不同的离子断裂方式如碰撞诱导解离（Collisioninduceddissociation，CID），高能碰撞解离（Highenergycollisiondissociation，HCD），电子捕获解离（Electroncapturedissociation，ECD）和电子转移解离（Electrontransferdissociation，ETD）等各有特点，能提供的碎片离子信息各不相同，在蛋白质翻译后修饰研究中应用不同。基于此，本文综述了质谱和蛋白质组学分析方法对Cys残基上一些常见的翻译后修饰组的研究进展（如图1示），包括氧化还原依赖的修饰如亚硝基化、Cys氧化和谷胱甘肽化等，脂质衍生亲电试剂（Lipidderivedelectrophiles，LDEs）如4Hydroxy2nonenal（HNE）化修饰，及脂质修饰如棕榈酰化和异戊烯化。
2氧化还原依赖的翻译后修饰
Cys巯基的氧化还原修饰是细胞信号转导的一个重要机制。细胞进行有氧呼吸或代谢时不可避免地会产生“活性氮”（RNS）或“活性氧”（ROS）等高活性物质，这些天然副产物在细胞信号转导及维持细胞稳态中扮演着重要的角色；同时，在外界刺激下过量产生的RNS或ROS也会引起氧化应激甚至抗氧化防御系统的破坏，与心血管、肿瘤等重大疾病关系密切。
LM
2.1S亚硝基化修饰（SNitrosylation）
一氧化氮性质活泼，可共价结合到蛋白质Cys巯基上，使之变成亚硝基硫醇（SNO）形成S亚硝基化，这是一种可逆、氧化还原依赖的翻译后修饰形式，参与调控几乎所有的生物学过程，与人类疾病密切相关[5＼]。但SNO修饰蛋白丰度低，SNO稳定性相对较差，质谱尤其是MALDIMS分析时[6＼]，SNO键比肽段的骨架结构更易碎裂，引起NO丢失，而在相对温和的条件下如ESIMS分析，有时能检测到含NO基团的修饰肽段[7＼]。Hao等[8＼]利用NO的中性丢失，发展了SNO修饰蛋白质及其位点的质谱直接检测方法。Wang等[9＼]通过调节仪器参数（如椎体电压等）和缓冲溶液的组成，可保持SNO键在质谱分析时不断裂。为避免中性丢失，Beuve等[10＼]则先用N（6＼[生物素胺＼]3′（2′吡啶二硫）丙酰胺（biotinHPDP）衍生化NO修饰位点，再联用不同的质谱碎裂方式（CID和HCD）进行分析。由于ETD是通过将电子从活泼的阴离子基团转移到质子化的肽段上，诱发肽段主链发生断裂，而侧链上的SNO等修饰基团仍保留在肽段上，因此被越来越多地用于各种翻译后修饰如亚硝基化的研究中[11＼]。但这些方法均限于纯化的重组蛋白等简单样品的分析。
为高通量分析亚硝基化蛋白质及位点，在蛋白质组学领域中以生物素转换方法（Biotinswitchmethod，BS）应用最为广泛，一般是通过烷基化封闭蛋白质中的自由巯基，用抗坏血酸盐选择性还原SNO产生新的自由巯基，采用生物素化试剂如biotinHPDP标记新产生的自由巯基，再利用其中的生物素亲和纯化后质谱分析[12，13＼]，得到修饰蛋白和位点信息。但这类方法操作繁琐，富集效率受多步反应的影响，内源性生物素化蛋白等可能会带来背景干扰，而且富集材料的理化性质也会在很大程度上影响富集的效果。Camerini等[14＼]将SNO转换成Histag标签，再利用镍柱纯化目标蛋白，避免了内源性生物素化蛋白等的干扰。另外，有机汞树脂[15＼]、丙基硫氧嘧啶功能化的琼脂糖树脂[16＼]和金纳米粒子[17＼]等能直接与巯基反应的固相材料也被用于SNO化蛋白质的富集，通过一步反应即可实现目标蛋白的富集，操作更简便快捷，避免了内源性生物素化蛋白的干扰，进而可提高富集效率。
为进一步研究不同生理、病理条件下SNO蛋白质的动态变化，相应的基于稳定同位素标记的质谱定量分析方法也得到了迅速发展，利用化学衍生、体内代谢等方法在样品中引入稳定同位素标签如13C和18O等，通过比较含“轻”和“重”同位素标签的同一肽段的质谱峰信号强度，可实现定量研究。因此，在BS方法的基础上，Zhang等[18＼]用与巯基反应的ICAT（Isotopecodedaffinitytag）试剂开展了亚硝基化定量蛋白质组研究，发现37条肽段在正常小鼠和Ⅱ型糖尿病小鼠中具有不同的修饰水平；Zhou等[19＼]则利用SILAC（Stableisotopelabelingwithaminoacidsincellculture）技术定量比较了LPS/IFNγ诱导前后RAW264.7细胞中亚硝基化蛋白质组。此外，iTRAQ（Isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation）[20＼]和iodoTMT（Iodoacetyltandemmasstag）[21＼]也相�^用于亚硝基化定量蛋白质组研究中。这些标记定量方法分析原理不同，各有优缺点。SILAC为体内代谢标记方法，“重”同位素标签是在细胞培养过程中引入的，因此可减少实验操作中带来的误差，但它不能用于临床样本等的定量分析。而ICAT、iTRAQ和iodoTMT标记技术则可用于体外样品的标记定量，ICAT和iodoTMT是与巯基特异反应的试剂，质谱分析时，前者根据一级质谱定量，后者利用二级质谱定量；iTRAQ虽也属二级质谱定量，但它是与肽段氨基反应进行同位素标记，因此需与SNO蛋白质特异富集方法结合使用。此外，SILAC和ICAT能同时标记的样品数量相对较少，而iTRAQ和iodoTMT则能进行6组甚至更多样品的同时定量分析，提高了分析通量。实际上，这些富集和定量分析方法大多是通用的，与Cys上特定修饰（如亚磺酰化）的样品预处理方法相结合，也同样适用其它修饰的定性和定量分析，如Wojdyla等[22＼]利用iodoTMT试剂同时定量分析了氧化应激状态下大肠杆菌中亚硝基化和亚磺酰化这两种修饰及其位点占有率，并发现它们常会发生在同一位点上；Araki等[23＼]定量研究了还原（如DTT）和氧化（如H2O2）条件下细胞中不同Cys残基的氧化还原敏感程度。 2.2半胱氨酸氧化（Cysteineoxidation）
Cys巯基是胞内ROS的主要靶点，平均pKa≈8.5。受胞内环境、蛋白质三维结构、附近氨基酸的极性和带电状态等影响，不同蛋白质巯基的pKa不同，对氧化修饰的敏感度也不同，通常pKa较低的巯基较易被氧化，可被选择性氧化生成次磺酸（CysSOH）、亚磺酸（CysSO2H）、磺酸（CysSO3H）及分子内/间二硫键（CysSSCys）[24＼]，其中次磺酸容易进一步氧化成二硫键、亚磺酸或磺酸，成为“氧化还原开关”影响信号转导。
亚磺酰化修饰（SSulfenylation，SOH）由Cys巯基与氧化剂如H2O2、HClO和羟自由基等反应生成，S亚硝基硫醇（SNitrosothiol）也能水解产生亚磺酰化修饰，对催化、信号传导等都有重要作用。为高通量分析亚磺酰化修饰蛋白质，Saurin等[25＼]利用亚砷酸盐将次磺酸还原变为巯基，在BS方法的基础上，建立了选择性富集亚磺酰化修饰蛋白质的方法。由于双甲酮可作为次磺酸的特异受体，所形成的加合物可用于检测蛋白质中的次磺酸[26＼]，带上生物素基团便可实现选择性富集[27＼]用于组学研究中。但生物素偶联的双甲酮对细胞膜的渗透性较低，因此Carroll等[28～30＼]发展了含炔基和叠氮基的双甲酮类似物探针，再利用点击化学结合质谱分析研究了细胞内亚磺酰化修饰蛋白质组，该类探针能直接标记细胞内可能发生修饰的位点，且点击化学反应效率高，提高了富集效率并减少了假阳性结果。为定量研究蛋白质亚磺酰化修饰，Seo等[31＼]发展了基于双甲酮稳定同位素标记试剂的质谱定量分析方法，ElKhatib等[32＼]则利用含金属离子的双甲酮试剂建立了基于ICPMS（Inductivelycoupledplasmamassspectrometry）的定量方法。
由于亚磺酸和磺酸的酸性极强，会明显改变被修饰肽段的电荷特性，因此，Paulech等[33＼]发展了强阳离子交换和亲水作用色谱联用的分离纯化方法，从心肌组织中鉴定到181个亚磺酸和磺酸化修饰位点。JP
二硫键（Disulfidebonds）是一种常见的蛋白质翻译后修饰形式，发生在一级或高级结构中相邻的Cys残基之间，对蛋白质的稳定性和生物活性至关重要。联用不同的烷基化试剂，如先在非还原条件下用碘乙酰胺（IAM）标记蛋白质中原有自由Cys，加入还原剂打开二硫键后，再用N乙基马来酰亚胺（NEM）等其它烷基化试剂封闭新产生的自由巯基，可在一定程度上通过烷基化标签的质量数差异质谱分析其中的二硫键[34＼]。自上而下（Topdown）的蛋白质组技术是在质谱仪上直接对完整蛋白质进行分析，可提供完整蛋白质更丰富的信息，因此，利用质谱碎裂信息可获取相关二硫键及其它翻译后修饰的信息[35，36＼]。Scotcher等[37，38＼]将Topdown与稳定同位素标记技术联用，通过定量测定Cys巯基的氧化还原电位，建立了Cys巯基氧化还原活性位点的分析新方法。由于谱图复杂、解谱困难，上述分析方法仅适用于简单样品的分析。为此，Lu等[39＼]发展了精确解析复杂样品中蛋白质二硫键结构的高通量分析方法，包括克服蛋白质二硫键体外交换、保持其天然结构的样品制备方法，以及二硫键交联肽段的最优质谱分析方法及配套的鉴定软件pLinkSS，并开展了目前最大规模的蛋白质二硫键组学研究。
为富集含二硫键的蛋白质，BS方法也得到了广泛应用。采用还原剂打开二硫键后用带生物素标签的烷基化试剂如biotinIAM、biotinHPDP等[40＼]�思牵�可纯化富集目标蛋白/肽，用于质谱分析；也可用荧光试剂如碘乙酰胺荧光素、Cy3/Cy5马来酰亚胺等标记，结合双向凝胶电泳（2DE）分离进行定量分析[41＼]。对于邻位的两个巯基（一级结构中处于-CXnC-结构域，n=2～6，或三级结构中非常接近）形成的分子内二硫键，可用对、邻位二巯基特异的试剂氧化苯胂（PAO）先封闭临近的两个巯基，用NEM烷基化封闭其它巯基后，用2，3二巯基丙磺酸除去PAO，重新暴露邻位二巯基，再进行生物素化标记纯化或荧光试剂标记结合2DE实现定性与定量分析[42＼]。其中ICAT试剂也常被用于二硫键的定量分析[43＼]。
2.3S谷胱甘肽化（Glutathionylation，proteinSSG）
谷胱甘肽（Glutathione，GSH）是细胞内含量丰富的一种含巯基小分子肽，是体内重要的抗氧化剂和自由基清除剂，它可通过与蛋白质Cys上的巯基形成二硫键使蛋白质发生谷胱甘肽化修饰。这是一种可逆的蛋白质翻译后修饰形式，在基础和氧化应激状态下均能发生，在信号传导、蛋白质稳态、细胞氧化还原状态调节等方面都发挥着重要作用，与心血管、神经系统疾病等相关[44＼]。
质谱是分析蛋白质及其翻译后修饰状态的有力工具，修饰前后蛋白质/肽段分子量的变化以及串级质谱中离子的碎片信息等，都能在一定程度上为蛋白质翻译后修饰的研究提供证据[45＼]。Chen等[46＼]利用二级（MS2）和三级（MS3）谱图信息分析了蛋白质Hemoglobin上104，93和112位点上的谷胱甘肽化修饰及其修饰程度，发现20位吸烟者中Cys104和Cys93的谷胱甘肽化程度显著高于20位不吸烟者，且修饰程度与吸烟者每天吸烟的数量和吸烟指数显著相关。不同的质谱碎裂模式下，产生的碎片离子信息不同，因此能为蛋白质的鉴定分析提供的信息也不尽相同。Chou等[47＼]比较了谷胱甘肽化肽段在不同碎裂模式（CID，HCD，ETD）下的MS/MS碎裂行为，发现HCD能得到更多留有谷胱甘肽化肽段的碎片离子信息，侧链中性丢失较少，有助于修饰位点的鉴定。另外，Topdown技术也在重要蛋白质（如Ras、p53）的谷胱甘肽化等氧化修饰研究中发挥着越来越重要的作用[48～50＼]。
要分析复杂生物样品中的谷胱甘肽化修饰蛋白质组，则需选择性富集纯化后再进行分析。现有高通量的分析方法有两类：（1）基于谷胱甘肽标记的方法。利用生物素化谷胱甘肽类似物如还原型的BiotinGSH、氧化型的BiotinGSSG或谷胱甘肽乙酯（BiotinGEE）等[51＼]标记目标蛋白质，纯化分离后进行组学分析，Zaffagnini等[52＼]用BiotinGEE方法从C.reinhardtii中鉴定到225个谷胱甘肽化修饰蛋白质。尽管能有效标记目标蛋白质，但外加的BiotinGSSG等可能会改变胞内正常巯基含量及GSH/GSSG比例[53＼]，且GSSG并不是生理条件下蛋白质谷胱甘肽化的主要途径，可能会使一些蛋白质得不到分析。Chiang等[54＼]利用谷胱甘肽特异的酶（GspS）发展了一种可选择性分析哺乳动物细胞中谷胱甘肽化蛋白质的方法，该酶能将生物素化的多胺基团连接到GSH上形成GSH衍生物，再利用生物素实现目标蛋白质的分离纯化。这是与常规富集方法不同之处，由于酶的催化效率高且专一性强，因此，可在很大程度上提高富集的特异性和效率。Samarasinghe等[55＼]发现将谷胱甘肽合成酶突变后，可高效、选择性地催化带叠氮基团的Ala代替Gly，产生叠氮标记的谷胱甘肽，进而可利用点击化学反应接上生物素等，实现谷胱甘肽化蛋白质的特异、灵敏检测。（2）基于谷氧还蛋白介导还原反应（GRXmediatedreduction）的方法：谷氧还原蛋白是一种二硫键氧化还原酶，能特异切除与谷胱甘肽混合形成的二硫键，因此，NEM封闭样品中自由巯基后，再用GRXs选择性地还原产生新的自由巯基，最后利用含生物素等富集标签的巯基反应试剂选择性富集目标蛋白/肽[56＼]，结合iTRAQ[57＼]和TMT[58＼]等标记技术还能进行定量分析。 34羟基壬烯酸（HNE）修饰
LDEs如HNE等是细胞代谢和脂质过氧化的产物，具有很高的生物反应活性，能与蛋白质上组氨酸、赖氨酸，尤其是Cys发生迈克尔加成反应，从而改变蛋白质的功能，甚至损伤细胞机制。
尽管通过分析修饰前后分子量的变化，可用质谱直接检测蛋白质的HNE修饰[59＼]，但含HNE修饰的肽段在CID模式下通常会发生中性丢失（156Da）[60＼]，基于此，Rauniyar等[61＼]发展了基于中性丢失扫描质谱直接分析HNE修饰及其位点的方法。Milic等[62＼]则利用7（二乙氨基）香豆素3甲酰肼特异衍生后，在正离子模式下产生特征的碎片离子，建立了HNE修饰肽段的分析方法。
为大规模分析HNE修饰蛋白质组，Roe等[63＼]先用肼化学法富集，再联用中性丢失扫描和Q值脉冲裂解（PulsedQdissociation，PQD）两种质谱扫描方式，鉴定了67个蛋白质上的125个修饰位点。肼化学法是基于肼基与醛基间的反应，由于非特异性吸附少，富集特异性高，在糖组学等领域中也应用广泛。Maier研究组[64，65＼]利用醛基与羟胺反应生成肟的性质，发展了HNE修饰蛋白质组的选择性富集新方法。与Cys上其它修饰类似，生物正交法也得到了广泛的应用，Porter研究组[66，67＼]以含叠氮或炔基的HNE衍生物为分子探针，经施陶丁格连接或点击化学反应连接上生物素后进行分离富集，建立了高通量分析HNE修饰蛋白质组的方法。
为定量研究HNE修饰蛋白质组，Han等[68＼]设计了酰肼功能化的同位素亲和标签（Hydrazidefunctionalizedisotopecodedaffinitytag，HICAT），利用酰肼与醛基的反应选择性标记目标蛋白质，利用“轻”（12C）或“重”（13C）同位素进行质谱相对定量，但该标记试剂只能提供轻重两种标记。Yang等[69＼]利用一种光可裂解的含炔基HNE类似物发展了选择性富集HNE修饰蛋白质的方法，并利用该类似物中轻重同位素标签，从RKO细胞中鉴定并定量了398个含炔基HNE类似物的蛋白质，其中386个发生在Cys上。此外，iTRAQ[70＼]、琥珀酰化[71＼]和二甲基[72＼]标记也被用于HNE修饰定量蛋白质组的研究中。
4S棕榈酰化修饰（SPalmitoylation）
蛋白质的S棕榈酰化修饰[73＼]，即S酰化修饰（SAcylation），通常是指16碳饱和脂肪酸在S酰基转移酶的作用下通过硫酯键共价修饰到蛋白质Cys残基上形成的。它是一种动态、可逆的脂质修饰，通过增加蛋白质的疏水性，调控蛋白质（如离子通道和激酶等）的结构、组装、成熟及其功能，对细胞信号转导、代谢和疾病的发生、发展等都起着重要作用。
棕�磅；�修饰基团不稳定，在样品制备和质谱分析过程中易丢失。Ji等[74＼]考察了不同实验条件（如反应温度、试剂等）和质谱碎裂模式（CID，HCD，ECD和ETD）下棕榈酰化修饰肽段的稳定性，发现在常规的胰酶酶解条件下便可导致修饰基团的明显丢失，相比于其它碎裂模式，ETD更适于直接鉴定棕榈酰化修饰肽段。尽管已有利用质谱方法直接检测棕榈酰化修饰蛋白质的报道[75＼]，但也只限于简单样品的分析。目前用于大规模分离富集棕榈酰化修饰蛋白质组的方法主要有两类，一是酰基生物素置换（Acylbiotinylexchange，ABE）[76，77＼]及其衍生方法[78，79＼]，即将蛋白质Cys残基上的自由巯基烷基化封闭后，利用羟胺溶液选择性水解，在棕榈酰化修饰位点处产生新的自由巯基，再与巯基特异的生物素化试剂反应后进行生物素亲和纯化或直接利用固相载体富集后进行组学分析；另一类则是基于叠氮[80＼]或炔基[81＼]棕榈酸类似物代谢标记的方法，结合点击化学可实现高通量的棕榈酰化修饰蛋白质组定性（含位点确定）甚至定量分析。本研究组也曾对此进行过综述[82＼]。
5S异戊烯化（SPrenylation）
异戊烯化修饰是一种重要的脂质修饰，是法尼基（Farnesyl，C15）或�脚６��脚６�基（Geranylgeranyl，C20）通过硫酯键连接到蛋白质C末端附近保守的CaaX结构域（a指脂肪族氨基酸，X通常为丝氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、谷氨酸或亮氨酸）或双Cys结构域（CC/CXC，X为任意氨基酸）的Cys残基上形成的，由法尼基转移酶（FTase）和�脚６��脚６�基转移酶Ⅰ和Ⅱ（GGTaseⅠ和Ⅱ）[83＼]调控，形成法尼基化（Farnesylation）和�脚６��脚６�基化（Geranylgeranylation）修饰，广泛存在于动物、植物和真菌，在蛋白质的细胞定位、信号传导等方面有重要作用。
法尼基化修饰肽段在质谱碎裂过程中会产生204Da的中性丢失[84＼]，在反相色谱中具有更强的保留，可与非修饰肽段分离[85＼]。Bhawal等[86＼]利用H2O2或间氯过氧苯甲酸将异戊烯化肽段氧化，在修饰位点处会产生巯脂键，再利用亚砜基在气相中可断裂而产生特征串级谱图的性质，发展了一种研究蛋白质异戊烯化修饰的新方法，通过特征的质量丢失可在一次实验中鉴定并区分法尼基化和�脚６��脚６�基化肽段。此外，Topdown技术也被用于异戊烯化修饰蛋白质的研究中[87＼]。
为大规模富集和分析异戊烯化修饰蛋白质组，Nguyen等[88＼]以生物素�脚６�焦磷酸（BGPP）为脂质供体，构建了一整套哺乳动物蛋白质异戊烯转移酶选择性地将BGPP连接到异戊烯化底物中用于分离分析胞内异戊烯化蛋白质的方法。为减小生物素对蛋白质的膜定位和下游信号传导的干扰，研究者们进一步发展了以炔基或叠氮类似物为报告基团[89＼]的分析方法，Chan等[90＼]用azidoGG类似物为探针发展了�脚６��脚６�基化蛋白质组的方法。由于炔基探针比叠氮的灵敏度更高，背景标记少[91＼]，Charron等[92，93＼]设计合成了炔基法尼醇（alkFOH）为报告基团用于异戊烯化蛋白质组的分析。 6展望
Cys作为蛋白质组成序列中一个重要且特殊的氨基酸，正被越来越多的研究者关注，但Cys残基含量较低，被修饰的Cys丰度更低；Cys巯基反应活性高，修饰类型多样，受环境影响大，且常存在Crosstalk，大大增加了Cys翻译后修饰组研究的难度。与其它方法相比，质谱技术能直接分析多种翻译后修饰的类型及位点，与分离富集方法和同位素标记等技术相结合，还能进行大规模地定性和定量分析，在（修饰）蛋白质组学研究中具有非常重要的地位。因此，现代质谱仪器、各种质谱碎裂技术（如CID，HCD，ECD和ETD）、分析策略（如Topdown）和分析�件等的发展，都极大地促进了Cys修饰组的研究。由于这些修饰都发生在Cys上，所以无论是定性还是定量方法大多是通用的，先将样品中自由巯基烷基化封闭，再用特定的还原剂还原特定的修饰获得新的自由巯基，然后利用合适的试剂衍生、分离纯化，进行定性与定量分析。需要指出的是，利用生物正交反应结合质谱分析进行Cys修饰组研究是近年的重要进展，也仍将是今后的研究热点。相信随着各项技术的不断发展与成熟，Cys上的翻译后修饰组分析方法必将得到迅速地发展，为进一步理解蛋白质的结构和功能提供更有力的支持。
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AbstractCysteinethiolshavehighreactionactivityandplaysignificantrolesinproteinstructuresandfunctionsasthesitesofnucleophilic，redoxcatalysis，metalbindingandallostericregulation.Duetothereactivityofthethiolgroup，cysteineresiduesareverypronetoposttranslationalmodifications（PTMs）suchasoxidation，lipidation，andsoon，whichcanregulate/damageproteinfunctionsandareassociatedwithmanydiseases.Thus，itisveryimportanttoqualitativelyandquantitativelyanalyzePTMsinthecysteineresiduesforfurtherunderstandingitsbiologicalfunctions.Thisreviewmainlyfocusesonthedevelopmentofmassspectrometricandhighthroughputproteomicapproachesforinvestigatingsomecommoncysteineposttranslationalmodifications.
KeywordsCysteine；Posttranslationalmodifications；Massspectrometry；Proteomics；Review
HQWT6JY（Received23August2016；accepted26September2016）
ThisworkwassupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina（Nos.21205018，21335002）
摘要 半胱氨酸的巯基具有很高的反应活性，作为亲核、氧化还原催化反应、金属结合及变构调节位点等在蛋白质的结构和功能中发挥着非常重要的作用，且容易发生多种翻译后修饰，调控亦或损伤蛋白功能，与人类许多重要疾病关系密切，因此，定性与定量分析蛋白质半胱氨酸上的翻译后修饰组对理解其生物学功能具有重要意义。本文综述了近年来蛋白质半胱氨酸上常见的翻译后修饰组的质谱和蛋白质组学分析方法进展。
关键词半胱氨酸；蛋白质翻译后修饰；质谱；蛋白质组学；综述
1引言
自20世纪80年代以来，一系列软电离技术如基质辅助激光解吸电离（MALDI）[1＼]和电喷雾电离（ESI）[2＼]发现后，生物质谱（MS）技术得到了迅速发展，为生命科学各领域包括蛋白质翻译后修饰的研究提供了高通量、高灵敏和高分辨的分析平台，并已成为现代生物技术快速发展的重要支撑。它不仅可提供修饰蛋白质的类型和位点信息，且可定量研究其修饰程度及变化，促进了人们对蛋白翻译后修饰的理解。半胱氨酸（Cys，C）是一种存在于大多数蛋白质中频次较低的氨基酸（约占1%～2%）[3＼]，但Cys的巯基反应活性高（亲核性和氧化还原敏感性），常作为氧化还原催化反应、金属结合及变构调节位点等在蛋白质的结构和功能中发挥重要作用，参与调控细胞识别、信号传导等生理过程[4＼]。Cys巯基对细胞内局部环境的变化很敏感，易发生一系列非酶或酶催化的翻译后修饰，从而快速、动态调控蛋白质的构型、活性等，甚至导致蛋白功能损伤，与人类许多重要疾病关系密切，因此，对蛋白质Cys上的翻译后修饰组的研究具有十分重要的生物学意义，受到研究者的广泛关注。但研究对象多为复杂的生物样品，蛋白质丰度变化范围大，而Cys被修饰的蛋白质/肽段大多丰度较低，在质谱分析过程中的信号容易受到抑制，常需特异富集后才能被有效鉴定；Cys上修饰种类多，但性质各异，在样品处理或质谱分析时大多不稳定，常需建立合适的质谱方法进行分析。此外，在质谱分析过程中，不同的离子断裂方式如碰撞诱导解离（Collisioninduceddissociation，CID），高能碰撞解离（Highenergycollisiondissociation，HCD），电子捕获解离（Electroncapturedissociation，ECD）和电子转移解离（Electrontransferdissociation，ETD）等各有特点，能提供的碎片离子信息各不相同，在蛋白质翻译后修饰研究中应用不同。基于此，本文综述了质谱和蛋白质组学分析方法对Cys残基上一些常见的翻译后修饰组的研究进展（如图1示），包括氧化还原依赖的修饰如亚硝基化、Cys氧化和谷胱甘肽化等，脂质衍生亲电试剂（Lipidderivedelectrophiles，LDEs）如4Hydroxy2nonenal（HNE）化修饰，及脂质修饰如棕榈酰化和异戊烯化。
2氧化还原依赖的翻译后修饰
Cys巯基的氧化还原修饰是细胞信号转导的一个重要机制。细胞进行有氧呼吸或代谢时不可避免地会产生“活性氮”（RNS）或“活性氧”（ROS）等高活性物质，这些天然副产物在细胞信号转导及维持细胞稳态中扮演着重要的角色；同时，在外界刺激下过量产生的RNS或ROS也会引起氧化应激甚至抗氧化防御系统的破坏，与心血管、肿瘤等重大疾病关系密切。
LM
2.1S亚硝基化修饰（SNitrosylation）
一氧化氮性质活泼，可共价结合到蛋白质Cys巯基上，使之变成亚硝基硫醇（SNO）形成S亚硝基化，这是一种可逆、氧化还原依赖的翻译后修饰形式，参与调控几乎所有的生物学过程，与人类疾病密切相关[5＼]。但SNO修饰蛋白丰度低，SNO稳定性相对较差，质谱尤其是MALDIMS分析时[6＼]，SNO键比肽段的骨架结构更易碎裂，引起NO丢失，而在相对温和的条件下如ESIMS分析，有时能检测到含NO基团的修饰肽段[7＼]。Hao等[8＼]利用NO的中性丢失，发展了SNO修饰蛋白质及其位点的质谱直接检测方法。Wang等[9＼]通过调节仪器参数（如椎体电压等）和缓冲溶液的组成，可保持SNO键在质谱分析时不断裂。为避免中性丢失，Beuve等[10＼]则先用N（6＼[生物素胺＼]3′（2′吡啶二硫）丙酰胺（biotinHPDP）衍生化NO修饰位点，再联用不同的质谱碎裂方式（CID和HCD）进行分析。由于ETD是通过将电子从活泼的阴离子基团转移到质子化的肽段上，诱发肽段主链发生断裂，而侧链上的SNO等修饰基团仍保留在肽段上，因此被越来越多地用于各种翻译后修饰如亚硝基化的研究中[11＼]。但这些方法均限于纯化的重组蛋白等简单样品的分析。
为高通量分析亚硝基化蛋白质及位点，在蛋白质组学领域中以生物素转换方法（Biotinswitchmethod，BS）应用最为广泛，一般是通过烷基化封闭蛋白质中的自由巯基，用抗坏血酸盐选择性还原SNO产生新的自由巯基，采用生物素化试剂如biotinHPDP标记新产生的自由巯基，再利用其中的生物素亲和纯化后质谱分析[12，13＼]，得到修饰蛋白和位点信息。但这类方法操作繁琐，富集效率受多步反应的影响，内源性生物素化蛋白等可能会带来背景干扰，而且富集材料的理化性质也会在很大程度上影响富集的效果。Camerini等[14＼]将SNO转换成Histag标签，再利用镍柱纯化目标蛋白，避免了内源性生物素化蛋白等的干扰。另外，有机汞树脂[15＼]、丙基硫氧嘧啶功能化的琼脂糖树脂[16＼]和金纳米粒子[17＼]等能直接与巯基反应的固相材料也被用于SNO化蛋白质的富集，通过一步反应即可实现目标蛋白的富集，操作更简便快捷，避免了内源性生物素化蛋白的干扰，进而可提高富集效率。
为进一步研究不同生理、病理条件下SNO蛋白质的动态变化，相应的基于稳定同位素标记的质谱定量分析方法也得到了迅速发展，利用化学衍生、体内代谢等方法在样品中引入稳定同位素标签如13C和18O等，通过比较含“轻”和“重”同位素标签的同一肽段的质谱峰信号强度，可实现定量研究。因此，在BS方法的基础上，Zhang等[18＼]用与巯基反应的ICAT（Isotopecodedaffinitytag）试剂开展了亚硝基化定量蛋白质组研究，发现37条肽段在正常小鼠和Ⅱ型糖尿病小鼠中具有不同的修饰水平；Zhou等[19＼]则利用SILAC（Stableisotopelabelingwithaminoacidsincellculture）技术定量比较了LPS/IFNγ诱导前后RAW264.7细胞中亚硝基化蛋白质组。此外，iTRAQ（Isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation）[20＼]和iodoTMT（Iodoacetyltandemmasstag）[21＼]也相�^用于亚硝基化定量蛋白质组研究中。这些标记定量方法分析原理不同，各有优缺点。SILAC为体内代谢标记方法，“重”同位素标签是在细胞培养过程中引入的，因此可减少实验操作中带来的误差，但它不能用于临床样本等的定量分析。而ICAT、iTRAQ和iodoTMT标记技术则可用于体外样品的标记定量，ICAT和iodoTMT是与巯基特异反应的试剂，质谱分析时，前者根据一级质谱定量，后者利用二级质谱定量；iTRAQ虽也属二级质谱定量，但它是与肽段氨基反应进行同位素标记，因此需与SNO蛋白质特异富集方法结合使用。此外，SILAC和ICAT能同时标记的样品数量相对较少，而iTRAQ和iodoTMT则能进行6组甚至更多样品的同时定量分析，提高了分析通量。实际上，这些富集和定量分析方法大多是通用的，与Cys上特定修饰（如亚磺酰化）的样品预处理方法相结合，也同样适用其它修饰的定性和定量分析，如Wojdyla等[22＼]利用iodoTMT试剂同时定量分析了氧化应激状态下大肠杆菌中亚硝基化和亚磺酰化这两种修饰及其位点占有率，并发现它们常会发生在同一位点上；Araki等[23＼]定量研究了还原（如DTT）和氧化（如H2O2）条件下细胞中不同Cys残基的氧化还原敏感程度。 2.2半胱氨酸氧化（Cysteineoxidation）
Cys巯基是胞内ROS的主要靶点，平均pKa≈8.5。受胞内环境、蛋白质三维结构、附近氨基酸的极性和带电状态等影响，不同蛋白质巯基的pKa不同，对氧化修饰的敏感度也不同，通常pKa较低的巯基较易被氧化，可被选择性氧化生成次磺酸（CysSOH）、亚磺酸（CysSO2H）、磺酸（CysSO3H）及分子内/间二硫键（CysSSCys）[24＼]，其中次磺酸容易进一步氧化成二硫键、亚磺酸或磺酸，成为“氧化还原开关”影响信号转导。
亚磺酰化修饰（SSulfenylation，SOH）由Cys巯基与氧化剂如H2O2、HClO和羟自由基等反应生成，S亚硝基硫醇（SNitrosothiol）也能水解产生亚磺酰化修饰，对催化、信号传导等都有重要作用。为高通量分析亚磺酰化修饰蛋白质，Saurin等[25＼]利用亚砷酸盐将次磺酸还原变为巯基，在BS方法的基础上，建立了选择性富集亚磺酰化修饰蛋白质的方法。由于双甲酮可作为次磺酸的特异受体，所形成的加合物可用于检测蛋白质中的次磺酸[26＼]，带上生物素基团便可实现选择性富集[27＼]用于组学研究中。但生物素偶联的双甲酮对细胞膜的渗透性较低，因此Carroll等[28～30＼]发展了含炔基和叠氮基的双甲酮类似物探针，再利用点击化学结合质谱分析研究了细胞内亚磺酰化修饰蛋白质组，该类探针能直接标记细胞内可能发生修饰的位点，且点击化学反应效率高，提高了富集效率并减少了假阳性结果。为定量研究蛋白质亚磺酰化修饰，Seo等[31＼]发展了基于双甲酮稳定同位素标记试剂的质谱定量分析方法，ElKhatib等[32＼]则利用含金属离子的双甲酮试剂建立了基于ICPMS（Inductivelycoupledplasmamassspectrometry）的定量方法。
由于亚磺酸和磺酸的酸性极强，会明显改变被修饰肽段的电荷特性，因此，Paulech等[33＼]发展了强阳离子交换和亲水作用色谱联用的分离纯化方法，从心肌组织中鉴定到181个亚磺酸和磺酸化修饰位点。JP
二硫键（Disulfidebonds）是一种常见的蛋白质翻译后修饰形式，发生在一级或高级结构中相邻的Cys残基之间，对蛋白质的稳定性和生物活性至关重要。联用不同的烷基化试剂，如先在非还原条件下用碘乙酰胺（IAM）标记蛋白质中原有自由Cys，加入还原剂打开二硫键后，再用N乙基马来酰亚胺（NEM）等其它烷基化试剂封闭新产生的自由巯基，可在一定程度上通过烷基化标签的质量数差异质谱分析其中的二硫键[34＼]。自上而下（Topdown）的蛋白质组技术是在质谱仪上直接对完整蛋白质进行分析，可提供完整蛋白质更丰富的信息，因此，利用质谱碎裂信息可获取相关二硫键及其它翻译后修饰的信息[35，36＼]。Scotcher等[37，38＼]将Topdown与稳定同位素标记技术联用，通过定量测定Cys巯基的氧化还原电位，建立了Cys巯基氧化还原活性位点的分析新方法。由于谱图复杂、解谱困难，上述分析方法仅适用于简单样品的分析。为此，Lu等[39＼]发展了精确解析复杂样品中蛋白质二硫键结构的高通量分析方法，包括克服蛋白质二硫键体外交换、保持其天然结构的样品制备方法，以及二硫键交联肽段的最优质谱分析方法及配套的鉴定软件pLinkSS，并开展了目前最大规模的蛋白质二硫键组学研究。
为富集含二硫键的蛋白质，BS方法也得到了广泛应用。采用还原剂打开二硫键后用带生物素标签的烷基化试剂如biotinIAM、biotinHPDP等[40＼]�思牵�可纯化富集目标蛋白/肽，用于质谱分析；也可用荧光试剂如碘乙酰胺荧光素、Cy3/Cy5马来酰亚胺等标记，结合双向凝胶电泳（2DE）分离进行定量分析[41＼]。对于邻位的两个巯基（一级结构中处于-CXnC-结构域，n=2～6，或三级结构中非常接近）形成的分子内二硫键，可用对、邻位二巯基特异的试剂氧化苯胂（PAO）先封闭临近的两个巯基，用NEM烷基化封闭其它巯基后，用2，3二巯基丙磺酸除去PAO，重新暴露邻位二巯基，再进行生物素化标记纯化或荧光试剂标记结合2DE实现定性与定量分析[42＼]。其中ICAT试剂也常被用于二硫键的定量分析[43＼]。
2.3S谷胱甘肽化（Glutathionylation，proteinSSG）
谷胱甘肽（Glutathione，GSH）是细胞内含量丰富的一种含巯基小分子肽，是体内重要的抗氧化剂和自由基清除剂，它可通过与蛋白质Cys上的巯基形成二硫键使蛋白质发生谷胱甘肽化修饰。这是一种可逆的蛋白质翻译后修饰形式，在基础和氧化应激状态下均能发生，在信号传导、蛋白质稳态、细胞氧化还原状态调节等方面都发挥着重要作用，与心血管、神经系统疾病等相关[44＼]。
质谱是分析蛋白质及其翻译后修饰状态的有力工具，修饰前后蛋白质/肽段分子量的变化以及串级质谱中离子的碎片信息等，都能在一定程度上为蛋白质翻译后修饰的研究提供证据[45＼]。Chen等[46＼]利用二级（MS2）和三级（MS3）谱图信息分析了蛋白质Hemoglobin上104，93和112位点上的谷胱甘肽化修饰及其修饰程度，发现20位吸烟者中Cys104和Cys93的谷胱甘肽化程度显著高于20位不吸烟者，且修饰程度与吸烟者每天吸烟的数量和吸烟指数显著相关。不同的质谱碎裂模式下，产生的碎片离子信息不同，因此能为蛋白质的鉴定分析提供的信息也不尽相同。Chou等[47＼]比较了谷胱甘肽化肽段在不同碎裂模式（CID，HCD，ETD）下的MS/MS碎裂行为，发现HCD能得到更多留有谷胱甘肽化肽段的碎片离子信息，侧链中性丢失较少，有助于修饰位点的鉴定。另外，Topdown技术也在重要蛋白质（如Ras、p53）的谷胱甘肽化等氧化修饰研究中发挥着越来越重要的作用[48～50＼]。
要分析复杂生物样品中的谷胱甘肽化修饰蛋白质组，则需选择性富集纯化后再进行分析。现有高通量的分析方法有两类：（1）基于谷胱甘肽标记的方法。利用生物素化谷胱甘肽类似物如还原型的BiotinGSH、氧化型的BiotinGSSG或谷胱甘肽乙酯（BiotinGEE）等[51＼]标记目标蛋白质，纯化分离后进行组学分析，Zaffagnini等[52＼]用BiotinGEE方法从C.reinhardtii中鉴定到225个谷胱甘肽化修饰蛋白质。尽管能有效标记目标蛋白质，但外加的BiotinGSSG等可能会改变胞内正常巯基含量及GSH/GSSG比例[53＼]，且GSSG并不是生理条件下蛋白质谷胱甘肽化的主要途径，可能会使一些蛋白质得不到分析。Chiang等[54＼]利用谷胱甘肽特异的酶（GspS）发展了一种可选择性分析哺乳动物细胞中谷胱甘肽化蛋白质的方法，该酶能将生物素化的多胺基团连接到GSH上形成GSH衍生物，再利用生物素实现目标蛋白质的分离纯化。这是与常规富集方法不同之处，由于酶的催化效率高且专一性强，因此，可在很大程度上提高富集的特异性和效率。Samarasinghe等[55＼]发现将谷胱甘肽合成酶突变后，可高效、选择性地催化带叠氮基团的Ala代替Gly，产生叠氮标记的谷胱甘肽，进而可利用点击化学反应接上生物素等，实现谷胱甘肽化蛋白质的特异、灵敏检测。（2）基于谷氧还蛋白介导还原反应（GRXmediatedreduction）的方法：谷氧还原蛋白是一种二硫键氧化还原酶，能特异切除与谷胱甘肽混合形成的二硫键，因此，NEM封闭样品中自由巯基后，再用GRXs选择性地还原产生新的自由巯基，最后利用含生物素等富集标签的巯基反应试剂选择性富集目标蛋白/肽[56＼]，结合iTRAQ[57＼]和TMT[58＼]等标记技术还能进行定量分析。 34羟基壬烯酸（HNE）修饰
LDEs如HNE等是细胞代谢和脂质过氧化的产物，具有很高的生物反应活性，能与蛋白质上组氨酸、赖氨酸，尤其是Cys发生迈克尔加成反应，从而改变蛋白质的功能，甚至损伤细胞机制。
尽管通过分析修饰前后分子量的变化，可用质谱直接检测蛋白质的HNE修饰[59＼]，但含HNE修饰的肽段在CID模式下通常会发生中性丢失（156Da）[60＼]，基于此，Rauniyar等[61＼]发展了基于中性丢失扫描质谱直接分析HNE修饰及其位点的方法。Milic等[62＼]则利用7（二乙氨基）香豆素3甲酰肼特异衍生后，在正离子模式下产生特征的碎片离子，建立了HNE修饰肽段的分析方法。
为大规模分析HNE修饰蛋白质组，Roe等[63＼]先用肼化学法富集，再联用中性丢失扫描和Q值脉冲裂解（PulsedQdissociation，PQD）两种质谱扫描方式，鉴定了67个蛋白质上的125个修饰位点。肼化学法是基于肼基与醛基间的反应，由于非特异性吸附少，富集特异性高，在糖组学等领域中也应用广泛。Maier研究组[64，65＼]利用醛基与羟胺反应生成肟的性质，发展了HNE修饰蛋白质组的选择性富集新方法。与Cys上其它修饰类似，生物正交法也得到了广泛的应用，Porter研究组[66，67＼]以含叠氮或炔基的HNE衍生物为分子探针，经施陶丁格连接或点击化学反应连接上生物素后进行分离富集，建立了高通量分析HNE修饰蛋白质组的方法。
为定量研究HNE修饰蛋白质组，Han等[68＼]设计了酰肼功能化的同位素亲和标签（Hydrazidefunctionalizedisotopecodedaffinitytag，HICAT），利用酰肼与醛基的反应选择性标记目标蛋白质，利用“轻”（12C）或“重”（13C）同位素进行质谱相对定量，但该标记试剂只能提供轻重两种标记。Yang等[69＼]利用一种光可裂解的含炔基HNE类似物发展了选择性富集HNE修饰蛋白质的方法，并利用该类似物中轻重同位素标签，从RKO细胞中鉴定并定量了398个含炔基HNE类似物的蛋白质，其中386个发生在Cys上。此外，iTRAQ[70＼]、琥珀酰化[71＼]和二甲基[72＼]标记也被用于HNE修饰定量蛋白质组的研究中。
4S棕榈酰化修饰（SPalmitoylation）
蛋白质的S棕榈酰化修饰[73＼]，即S酰化修饰（SAcylation），通常是指16碳饱和脂肪酸在S酰基转移酶的作用下通过硫酯键共价修饰到蛋白质Cys残基上形成的。它是一种动态、可逆的脂质修饰，通过增加蛋白质的疏水性，调控蛋白质（如离子通道和激酶等）的结构、组装、成熟及其功能，对细胞信号转导、代谢和疾病的发生、发展等都起着重要作用。
棕�磅；�修饰基团不稳定，在样品制备和质谱分析过程中易丢失。Ji等[74＼]考察了不同实验条件（如反应温度、试剂等）和质谱碎裂模式（CID，HCD，ECD和ETD）下棕榈酰化修饰肽段的稳定性，发现在常规的胰酶酶解条件下便可导致修饰基团的明显丢失，相比于其它碎裂模式，ETD更适于直接鉴定棕榈酰化修饰肽段。尽管已有利用质谱方法直接检测棕榈酰化修饰蛋白质的报道[75＼]，但也只限于简单样品的分析。目前用于大规模分离富集棕榈酰化修饰蛋白质组的方法主要有两类，一是酰基生物素置换（Acylbiotinylexchange，ABE）[76，77＼]及其衍生方法[78，79＼]，即将蛋白质Cys残基上的自由巯基烷基化封闭后，利用羟胺溶液选择性水解，在棕榈酰化修饰位点处产生新的自由巯基，再与巯基特异的生物素化试剂反应后进行生物素亲和纯化或直接利用固相载体富集后进行组学分析；另一类则是基于叠氮[80＼]或炔基[81＼]棕榈酸类似物代谢标记的方法，结合点击化学可实现高通量的棕榈酰化修饰蛋白质组定性（含位点确定）甚至定量分析。本研究组也曾对此进行过综述[82＼]。
5S异戊烯化（SPrenylation）
异戊烯化修饰是一种重要的脂质修饰，是法尼基（Farnesyl，C15）或�脚６��脚６�基（Geranylgeranyl，C20）通过硫酯键连接到蛋白质C末端附近保守的CaaX结构域（a指脂肪族氨基酸，X通常为丝氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、谷氨酸或亮氨酸）或双Cys结构域（CC/CXC，X为任意氨基酸）的Cys残基上形成的，由法尼基转移酶（FTase）和�脚６��脚６�基转移酶Ⅰ和Ⅱ（GGTaseⅠ和Ⅱ）[83＼]调控，形成法尼基化（Farnesylation）和�脚６��脚６�基化（Geranylgeranylation）修饰，广泛存在于动物、植物和真菌，在蛋白质的细胞定位、信号传导等方面有重要作用。
法尼基化修饰肽段在质谱碎裂过程中会产生204Da的中性丢失[84＼]，在反相色谱中具有更强的保留，可与非修饰肽段分离[85＼]。Bhawal等[86＼]利用H2O2或间氯过氧苯甲酸将异戊烯化肽段氧化，在修饰位点处会产生巯脂键，再利用亚砜基在气相中可断裂而产生特征串级谱图的性质，发展了一种研究蛋白质异戊烯化修饰的新方法，通过特征的质量丢失可在一次实验中鉴定并区分法尼基化和�脚６��脚６�基化肽段。此外，Topdown技术也被用于异戊烯化修饰蛋白质的研究中[87＼]。
为大规模富集和分析异戊烯化修饰蛋白质组，Nguyen等[88＼]以生物素�脚６�焦磷酸（BGPP）为脂质供体，构建了一整套哺乳动物蛋白质异戊烯转移酶选择性地将BGPP连接到异戊烯化底物中用于分离分析胞内异戊烯化蛋白质的方法。为减小生物素对蛋白质的膜定位和下游信号传导的干扰，研究者们进一步发展了以炔基或叠氮类似物为报告基团[89＼]的分析方法，Chan等[90＼]用azidoGG类似物为探针发展了�脚６��脚６�基化蛋白质组的方法。由于炔基探针比叠氮的灵敏度更高，背景标记少[91＼]，Charron等[92，93＼]设计合成了炔基法尼醇（alkFOH）为报告基团用于异戊烯化蛋白质组的分析。 6展望
Cys作为蛋白质组成序列中一个重要且特殊的氨基酸，正被越来越多的研究者关注，但Cys残基含量较低，被修饰的Cys丰度更低；Cys巯基反应活性高，修饰类型多样，受环境影响大，且常存在Crosstalk，大大增加了Cys翻译后修饰组研究的难度。与其它方法相比，质谱技术能直接分析多种翻译后修饰的类型及位点，与分离富集方法和同位素标记等技术相结合，还能进行大规模地定性和定量分析，在（修饰）蛋白质组学研究中具有非常重要的地位。因此，现代质谱仪器、各种质谱碎裂技术（如CID，HCD，ECD和ETD）、分析策略（如Topdown）和分析�件等的发展，都极大地促进了Cys修饰组的研究。由于这些修饰都发生在Cys上，所以无论是定性还是定量方法大多是通用的，先将样品中自由巯基烷基化封闭，再用特定的还原剂还原特定的修饰获得新的自由巯基，然后利用合适的试剂衍生、分离纯化，进行定性与定量分析。需要指出的是，利用生物正交反应结合质谱分析进行Cys修饰组研究是近年的重要进展，也仍将是今后的研究热点。相信随着各项技术的不断发展与成熟，Cys上的翻译后修饰组分析方法必将得到迅速地发展，为进一步理解蛋白质的结构和功能提供更有力的支持。
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AbstractCysteinethiolshavehighreactionactivityandplaysignificantrolesinproteinstructuresandfunctionsasthesitesofnucleophilic，redoxcatalysis，metalbindingandallostericregulation.Duetothereactivityofthethiolgroup，cysteineresiduesareverypronetoposttranslationalmodifications（PTMs）suchasoxidation，lipidation，andsoon，whichcanregulate/damageproteinfunctionsandareassociatedwithmanydiseases.Thus，itisveryimportanttoqualitativelyandquantitativelyanalyzePTMsinthecysteineresiduesforfurtherunderstandingitsbiologicalfunctions.Thisreviewmainlyfocusesonthedevelopmentofmassspectrometricandhighthroughputproteomicapproachesforinvestigatingsomecommoncysteineposttranslationalmodifications.
KeywordsCysteine；Posttranslationalmodifications；Massspectrometry；Proteomics；Review
HQWT6JY（Received23August2016；accepted26September2016）
ThisworkwassupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina（Nos.21205018，21335002）