TUNEL细胞凋亡检测程序（Promega公司）
一、 原理与意义：
TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况，其原理是生物素biotinylate标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的链霉亲和素streptavidin特异性结合，后者又与POD底物H2O2、二氨基联苯胺（DAB）产生深棕色反应，特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。
二、 器材与试剂
1. 器材：光学显微镜及其成像系统、摇床、组化笔、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的移液器及枪头等。
2. 试剂：试剂盒含TdT 2×、Biotinylated标记的dUTP、标记streptavidin的HRP、SSC 20×、Proteinase k、DAB 20×、DAB底物Buffer 20×、H2O2 20×；
3. 自备试剂：
1) 1×PBS（pH 7.4，2.5L＝20.0157g 137mM NaCl＋0.499552g 2.68mM KCl＋0.50013075g 1.47mM KH2PO4＋7.253337g 8.1mM Na2HPO4），115℃×15 min；
2) 0.85％NaCl 500 ml＝4.25 g Nacl＋500 ml三蒸水，115 ℃×15 min；
3) 4％多聚甲醛500 ml＝20 g多聚甲醛＋500 ml PBS在65 ℃水箱中3 h多，再放入4 ℃保存。
4) DNase I buffer：40 mM Tris-HCl (pH 7.9)＋10 mM NaCl＋6 mM MgCl2＋10 mM CaCl2；
5) Proteinase K buffer：100 mM Tris-HCl (pH 8.0)＋50 mM EDTA；
6) DNase 1（原液1000 U/ml按1:99DNase 1缓冲液稀释至10 U/ml）；
7) DAB工作液（临用前配制，5 µl 20×DAB＋1 μl 30％H2O2＋94 µl PBS）
8) 20 μg/ml Proteinase K工作液（按1:500稀释贮存液1 mg/ml）。
9) 另外，双蒸水、无菌0.85％NaCl、二甲苯、梯度乙醇（100、95、85、70、50％）、 1
苏木素。
三、 实验步骤
1.
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8.
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10.
11. 脱蜡：用二甲苯浸洗5 min×2次； 水化：用梯度乙醇（100％×5 min、100％×3 min、95％×3 min、85％×3 min、70％×3 min、50％×3 min）； 浸洗：0.85％NaCl×5 min→PBS洗5 min； 固定：浸入4％多聚甲醛15 min； 浸洗：PBS 5 min×2次； 细胞通透：用每片100 ul 20 μg/ml Proteinase K处理组织15（10~30） min RT； 浸洗：PBS洗5 min； 固定: 浸入4％多聚甲醛5 min； 浸洗：PBS 5 min×2次； 平衡：加100 ul平衡液，湿盒平衡10（5～10） min； 制备TUNEL反应混合液：处理组用1 μl rTdT＋1 μl 生物素标记的dUTP＋
98 ul平衡液混匀；而阴性对照组不加rTdT，改为三蒸水；阳性对照组先加入100 μl DNase 1 缓冲液孵育5 min，甩掉液体后再加100 ul DNase 1（10 U/ml）酶切10 min，用去离子水冲洗4次，PBS浸洗5 min，后面步骤从第10步开始。
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标记反应：加100 μl TUNEL反应混合液于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37 ℃×1 h。 终止反应：浸入2×SSC 15 min； 浸洗：PBS 5 min×3次； 封闭POD：浸入0.3％H2O2 15 min； 浸洗：PBS 5 min×3次； 酶标反应：加100 ul streptavidin标记HRP（按1:500 PBS稀释）30 min； 浸洗：PBS 5 min×3次； DAB显色（避光）：加100 ulDAB混合液（50 ulDAB+50 ulDAB底物缓冲液＋50 ul H2O220×＋950 ul三蒸水）10 min左右，镜下出现浅棕色背景时。 用去离子水冲洗几次； 用苏木素复染，3 s左右后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水（50、70、85、95、100、100％各1 min）、二甲苯透明1 min×2次、中性树胶封片。 加一滴PBS或甘油在视野下，用光学显微镜观察凋亡细胞（共计200～500个细胞）并拍照。可结合凋亡细胞形态特征来综合判断（未染色细胞变小，2
胞膜完整但出现发泡现象，晚期出现凋亡小体，贴壁细胞出现邹缩、变圆、脱落；而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状/凋亡小体）。
四、 注意事项
1. 结果分析时注意：在坏死的晚期阶段或在高度增殖/代谢的组织细胞中可产
生大量DNA片断，从而引起假阳性结果；而有些类型的凋亡性细胞死亡缺乏DNA断裂或DNA裂解不完全，以及细胞外的矩阵成分阻止TdT进入胞内反应，进而产生假阴性结果。
2. 初次检测细胞凋亡，最好设置阳性对照片。
3. 血细胞含量高的组织，尽可能延长过氧化氢的灭活时间。
4. 苏木素的复染时间需要摸索。
5. 每片所加试剂可调整，一般30～100 l不等，但也要防止液体挥发而干片，
且反应均在放置湿盒内。
参照Promega公司TUNEL检测说明书。
（王 华）
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TUNEL细胞凋亡检测程序（Promega公司）
一、 原理与意义：
TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况，其原理是生物素biotinylate标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的链霉亲和素streptavidin特异性结合，后者又与POD底物H2O2、二氨基联苯胺（DAB）产生深棕色反应，特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。
二、 器材与试剂
1. 器材：光学显微镜及其成像系统、摇床、组化笔、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的移液器及枪头等。
2. 试剂：试剂盒含TdT 2×、Biotinylated标记的dUTP、标记streptavidin的HRP、SSC 20×、Proteinase k、DAB 20×、DAB底物Buffer 20×、H2O2 20×；
3. 自备试剂：
1) 1×PBS（pH 7.4，2.5L＝20.0157g 137mM NaCl＋0.499552g 2.68mM KCl＋0.50013075g 1.47mM KH2PO4＋7.253337g 8.1mM Na2HPO4），115℃×15 min；
2) 0.85％NaCl 500 ml＝4.25 g Nacl＋500 ml三蒸水，115 ℃×15 min；
3) 4％多聚甲醛500 ml＝20 g多聚甲醛＋500 ml PBS在65 ℃水箱中3 h多，再放入4 ℃保存。
4) DNase I buffer：40 mM Tris-HCl (pH 7.9)＋10 mM NaCl＋6 mM MgCl2＋10 mM CaCl2；
5) Proteinase K buffer：100 mM Tris-HCl (pH 8.0)＋50 mM EDTA；
6) DNase 1（原液1000 U/ml按1:99DNase 1缓冲液稀释至10 U/ml）；
7) DAB工作液（临用前配制，5 µl 20×DAB＋1 μl 30％H2O2＋94 µl PBS）
8) 20 μg/ml Proteinase K工作液（按1:500稀释贮存液1 mg/ml）。
9) 另外，双蒸水、无菌0.85％NaCl、二甲苯、梯度乙醇（100、95、85、70、50％）、 1
苏木素。
三、 实验步骤
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11. 脱蜡：用二甲苯浸洗5 min×2次； 水化：用梯度乙醇（100％×5 min、100％×3 min、95％×3 min、85％×3 min、70％×3 min、50％×3 min）； 浸洗：0.85％NaCl×5 min→PBS洗5 min； 固定：浸入4％多聚甲醛15 min； 浸洗：PBS 5 min×2次； 细胞通透：用每片100 ul 20 μg/ml Proteinase K处理组织15（10~30） min RT； 浸洗：PBS洗5 min； 固定: 浸入4％多聚甲醛5 min； 浸洗：PBS 5 min×2次； 平衡：加100 ul平衡液，湿盒平衡10（5～10） min； 制备TUNEL反应混合液：处理组用1 μl rTdT＋1 μl 生物素标记的dUTP＋
98 ul平衡液混匀；而阴性对照组不加rTdT，改为三蒸水；阳性对照组先加入100 μl DNase 1 缓冲液孵育5 min，甩掉液体后再加100 ul DNase 1（10 U/ml）酶切10 min，用去离子水冲洗4次，PBS浸洗5 min，后面步骤从第10步开始。
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标记反应：加100 μl TUNEL反应混合液于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37 ℃×1 h。 终止反应：浸入2×SSC 15 min； 浸洗：PBS 5 min×3次； 封闭POD：浸入0.3％H2O2 15 min； 浸洗：PBS 5 min×3次； 酶标反应：加100 ul streptavidin标记HRP（按1:500 PBS稀释）30 min； 浸洗：PBS 5 min×3次； DAB显色（避光）：加100 ulDAB混合液（50 ulDAB+50 ulDAB底物缓冲液＋50 ul H2O220×＋950 ul三蒸水）10 min左右，镜下出现浅棕色背景时。 用去离子水冲洗几次； 用苏木素复染，3 s左右后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水（50、70、85、95、100、100％各1 min）、二甲苯透明1 min×2次、中性树胶封片。 加一滴PBS或甘油在视野下，用光学显微镜观察凋亡细胞（共计200～500个细胞）并拍照。可结合凋亡细胞形态特征来综合判断（未染色细胞变小，2
胞膜完整但出现发泡现象，晚期出现凋亡小体，贴壁细胞出现邹缩、变圆、脱落；而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状/凋亡小体）。
四、 注意事项
1. 结果分析时注意：在坏死的晚期阶段或在高度增殖/代谢的组织细胞中可产
生大量DNA片断，从而引起假阳性结果；而有些类型的凋亡性细胞死亡缺乏DNA断裂或DNA裂解不完全，以及细胞外的矩阵成分阻止TdT进入胞内反应，进而产生假阴性结果。
2. 初次检测细胞凋亡，最好设置阳性对照片。
3. 血细胞含量高的组织，尽可能延长过氧化氢的灭活时间。
4. 苏木素的复染时间需要摸索。
5. 每片所加试剂可调整，一般30～100 l不等，但也要防止液体挥发而干片，
且反应均在放置湿盒内。
参照Promega公司TUNEL检测说明书。
（王 华）
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