［摘要］目的 探讨中药猫眼草对C57BL/6小鼠Lewis肺癌细胞凋亡的影响。方法 将Lewis肺癌C57BL/6小鼠分为模型组、猫眼草7.5、15.0、30.0、60.0 g/kg组和顺铂组，应用流式细胞仪和TUNEL法检测猫眼草对Lewis肺癌细胞凋亡的影响。结果 猫眼草30.0、60.0 g/kg组瘤质量与模型组相比有显著性差异（ F=7.90，q=4.16、6.21， P
［关键词］ 猫眼草;肺肿瘤;细胞凋亡
EFFECTS OF CHINESE MEDICINE CRESCENT EUPHORBIA ON INDUCED CELL APOPTOSIS IN Lewis LUNG CANCER IN MICE
XIAO BAO-HONG， ZHANG CHUN-LING， WANG YING-NIAN， et al
（Department of Respiratory Diseases， Cen-tral Hospital of Qingdao， Qingdao 266042， China）
［ABSTRACT］ObjectiveTo study induced cells apoptosis by Chinese medicine Crescent euphorbia in Lewis lung cancer （LLC） in mice. MethodsThe C57BL/6 mice with LLC were divided into Model， Crescent -euphorbia 7.5， 15.0， 30.0 and 60.0 g/kg and Cisplatin （DDP） groups. Inhibitory rates of each group were detected by flow cytometry and TUNEL. Results The inhibitory rates and the apoptotic rates of Crescent euphorbia in doses of 30.0，60.0 g/kg and DDP group were significantly higher than those of the controls （ F=7.90;q=4.16，6.21;P
［KEY WORDS］Crescent euphorbia; lung neoplasms; apoptosis
为了观察中药猫眼草对肺癌的抑制作用，本实验建立了Lewis肺癌小鼠模型，并采用流式细胞仪及TUNEL法观察猫眼草对肺癌细胞凋亡的影响。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 药物与试剂 猫眼草全草;细胞凋亡测试盒。
1.2 猫眼草水提物的制备 猫眼草生药500 g加水5 000 mL，煮沸 20 min ，连续2次，4层纱布过滤后，浓缩至500 mL，制成口服液，每1 mL含生药1.0 g，高压蒸汽杀菌后，于 4 ℃ 冰箱中贮存备用。
1.3 方法
1.3.1动物分组 取C57BL/6小鼠，随机分为空白对照组、模型组、猫眼草7.5、15.0、30.0、60.0 g/kg组及顺铂组，每组10只。
1.3.2荷瘤动物模型的建立 取传代后14 d的 Lewis肺癌瘤源小鼠，脱颈处死，固定于鼠板上，常规消毒，于超净工作台中，从腋部皮下剥取肿瘤组织，剔除纤维包膜和坏死组织，在无菌平皿中剪碎，置组织研磨器中加4 ℃生理盐水轻轻研磨，过滤，制成瘤细胞悬液，调整细胞浓度为1×1010/L。除空白对照组外，其他各组小鼠均于右腋部皮下注射上述瘤细胞悬液0.2 mL以建立模型。
1.3.3给药方法 从接种瘤细胞次日开始猫眼草各组以7.5、15.0、30.0、60.0 g/kg猫眼草灌胃给药，连续 12 d ;顺铂组每日腹腔注射顺铂1 mg/kg，每天1次，连续7 d。每天观察小鼠饮食及肿瘤生长情况。末次灌胃给药后24 h，小鼠称质量，处死。
1.4 观察指标 观察各组瘤质量、抑瘤率、细胞凋亡率、瘤组织病理学变化及肿瘤细胞凋亡情况。
2 结果
2.1 猫眼草对小鼠Lewis肺癌细胞增殖的影响 猫眼草30.0、60.0 g/kg组瘤质量与模型组比较，差异有显著意义（ F=7.90，q=4.16、6.21， P
表1 各组瘤质量与抑瘤率比较（略）
2.2 各组细胞凋亡率比较 模型组、猫眼草7.5、15.0、30.0、60.0 g/kg组及顺铂组凋亡率分别为 1.19% 、 9.44% 、 15.49% 、 16.43% 、24.37%、15.58%。其中猫眼草后3组及顺铂组细胞凋亡率与模型组比较有明显提高。
2.3 肿瘤组织病理学变化 模型组癌细胞呈片状或巢状分布，细胞生长旺盛，无坏死。猫眼草7.5 g/kg组可见癌细胞生长旺盛，大部分未见明显改变;猫眼草15.0 g/kg组癌细胞生长较旺盛，呈片状分布，可见点状坏死;猫眼草 30.0 g/ kg组可见癌细胞核固缩、小片状坏死;猫眼草60.0 g/kg组可见大片癌细胞核固缩、碎裂、坏死。顺铂组瘤组织内有大片细胞崩解的碎片，细胞核固缩。
2.4 猫眼草对小鼠肿瘤细胞凋亡的影响 模型组、猫眼草30.0、60.0 g/kg组及顺铂组凋亡指数分别为（0.79±1.60）%、（4.00±7.15）%、 （5.93± 5.96）%、（7.07±10.15）%，猫眼草 60.0 g/ kg组及顺铂组的凋亡指数与模型组相比有显著性差异（ t=2.63、1.93，P
3 讨论
肺癌是严重危害人类身体健康的常见癌症之一。其治疗仍以手术、化疗、放疗与生物治疗为主，但有其局限性和明显的毒副作用。近年来大量的研究表明，天然植物中存在具有治疗价值的抗癌药物，天然植物药物以其所特有的低毒、有效、无耐药性及整体调节等多方面的优势，在肿瘤治疗中起着越来越重要的作用［1］。猫眼草全草化学成分含黄酮类成分、猫眼草素、山柰粉、槲皮素、山奈粉-3-单-L鼠李糖甙及槲皮素-3-单-L-鼠李糖甙，还含有甾醇、挥发油、酚类物质、有机酸及蜡质等。有祛寒、镇咳、平喘、拔毒止痒、利尿消肿之功。功能主治:散播结，杀虫。近年来，开始了对猫眼草及其提取物的抗肿瘤作用的研究。 ARISAWA等［2］从猫眼草中提取出黄酮化合物及一种细胞毒成分β-peltoboykinoli cacid，并探讨了β-peltoboykinolic acid对体外不同人体癌细胞株的细胞毒性，证明了该细胞毒成分对Meth-A小鼠纤维肉瘤的抗肿瘤作用。如应用该细胞毒成分和丝裂霉素C及OR-432联合进行治疗，能增强C57BL/6小鼠对B16-BL6小鼠黑瘤的抗肿瘤作用［3］。另外，有泽宗久［4］也从猫眼草中分离出了有抗癌作用的黄酮类成分。高志良［5］应用大剂量猫眼草治疗早期弥漫性肝癌取得了满意的疗效。在中国民间，已经有用猫眼草组方来治疗癌症，如纵隔肿瘤［6］、食管癌及乳癌等，但相关文献资料对猫眼草的抗癌作用机制报道甚少。顺铂抗瘤谱广，目前被临床广泛应用，成为当前最常用的抗癌药物之一。顺铂对肿瘤细胞的杀伤主要是由于顺铂能引起肿瘤细胞的生长抑制和诱导细胞凋亡［7］。细胞凋亡是细胞主动参与的自杀机制，是抗肿瘤药物抑制肿瘤细胞生长的机制之一，被视为评估药物疗效的一项新指标［8］。本实验为观察猫眼草对肺癌生长的影响，采用C57BL/6小鼠移植性Lewis肺癌作为模型，猫眼草水提物灌胃给药，并与应用顺铂相比较。结果显示，不同剂量猫眼草对小鼠移植性肺癌有不同程度的抑制作用，30.0以及 60.0 g/kg 组瘤质量、抑瘤率与模型组比较，差异均有显著意义。本文结果亦显示，随着剂量的增大，猫眼草的抑瘤作用逐渐增强，但猫眼草的最大用药量有待进一步研究。本实验采用TUNEL标记法观察猫眼草对小鼠肺癌细胞凋亡的影响。结果显示，猫眼草60.0 g/kg组小鼠肿瘤的凋亡指数较模型组有显著性差异，提示猫眼草可通过诱导细胞凋亡而发挥其抗癌作用。总之，猫眼草对Lewis肺癌有明显的抑制作用，且猫眼草抑制肺癌细胞的作用随剂量的增加而增高，并有诱导肿瘤细胞凋亡的作用。
［参考文献］
［1］ 陈 聪颖，陆阳，陈泽乃. 天然产物在抗癌药物发现和开发中的作用［J］.中草药，1999，30（2）:144.
［2］ ARISAWA M， TAKAHASHI M， TAKEZAWA E， et al. Construction of chiral 1，2-cycloalkanopyrrolidines from L-pro-line using ring closing metathesis （RCM）［J］. Chem Pharm Bull （Tokyo）， 2000 ，48（10）:1593.
［3］ ARISAWA M， BAI H， SHIMIZU S， et al. Isolation and i-dentification of a cytotoxic principle from Chrysosplenium grayanum Maxim （Saxifragaceae） and its antitumor activities［J］. Chem Pharm Bull （Tokyo）， 1992，40（12）:3274.
［4］ 有 泽宗久. 猫眼草属植物黄酮类对促癌剂的抑制作用［J］.国外医学:中医中药分册，1995，17（4）:39.
［5］ 高 志良. 大剂量泽漆为主治疗早期肝癌［J］.江苏中医，1997，18（2）:28.
［6］ 宋 洪恩，张秀贞，周艳丽. 三子三仁汤及华蟾猫眼草治疗纵隔肿瘤33例疗效观察［J］.中国综合医学杂志，2003，17（3）:56.
［7］ HANNUN J A. Apoptosis and the dilemma of cancer chemo-therapy［J］. Blood， 1997，89:1845-1853.
［8］ MALCOLM R A， CATHCRINE E S. Apoptosis regulation and relevance to toxicology［J］. Hum Toxicol， 1995，14:234-236.
［摘要］目的 探讨中药猫眼草对C57BL/6小鼠Lewis肺癌细胞凋亡的影响。方法 将Lewis肺癌C57BL/6小鼠分为模型组、猫眼草7.5、15.0、30.0、60.0 g/kg组和顺铂组，应用流式细胞仪和TUNEL法检测猫眼草对Lewis肺癌细胞凋亡的影响。结果 猫眼草30.0、60.0 g/kg组瘤质量与模型组相比有显著性差异（ F=7.90，q=4.16、6.21， P
［关键词］ 猫眼草;肺肿瘤;细胞凋亡
EFFECTS OF CHINESE MEDICINE CRESCENT EUPHORBIA ON INDUCED CELL APOPTOSIS IN Lewis LUNG CANCER IN MICE
XIAO BAO-HONG， ZHANG CHUN-LING， WANG YING-NIAN， et al
（Department of Respiratory Diseases， Cen-tral Hospital of Qingdao， Qingdao 266042， China）
［ABSTRACT］ObjectiveTo study induced cells apoptosis by Chinese medicine Crescent euphorbia in Lewis lung cancer （LLC） in mice. MethodsThe C57BL/6 mice with LLC were divided into Model， Crescent -euphorbia 7.5， 15.0， 30.0 and 60.0 g/kg and Cisplatin （DDP） groups. Inhibitory rates of each group were detected by flow cytometry and TUNEL. Results The inhibitory rates and the apoptotic rates of Crescent euphorbia in doses of 30.0，60.0 g/kg and DDP group were significantly higher than those of the controls （ F=7.90;q=4.16，6.21;P
［KEY WORDS］Crescent euphorbia; lung neoplasms; apoptosis
为了观察中药猫眼草对肺癌的抑制作用，本实验建立了Lewis肺癌小鼠模型，并采用流式细胞仪及TUNEL法观察猫眼草对肺癌细胞凋亡的影响。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 药物与试剂 猫眼草全草;细胞凋亡测试盒。
1.2 猫眼草水提物的制备 猫眼草生药500 g加水5 000 mL，煮沸 20 min ，连续2次，4层纱布过滤后，浓缩至500 mL，制成口服液，每1 mL含生药1.0 g，高压蒸汽杀菌后，于 4 ℃ 冰箱中贮存备用。
1.3 方法
1.3.1动物分组 取C57BL/6小鼠，随机分为空白对照组、模型组、猫眼草7.5、15.0、30.0、60.0 g/kg组及顺铂组，每组10只。
1.3.2荷瘤动物模型的建立 取传代后14 d的 Lewis肺癌瘤源小鼠，脱颈处死，固定于鼠板上，常规消毒，于超净工作台中，从腋部皮下剥取肿瘤组织，剔除纤维包膜和坏死组织，在无菌平皿中剪碎，置组织研磨器中加4 ℃生理盐水轻轻研磨，过滤，制成瘤细胞悬液，调整细胞浓度为1×1010/L。除空白对照组外，其他各组小鼠均于右腋部皮下注射上述瘤细胞悬液0.2 mL以建立模型。
1.3.3给药方法 从接种瘤细胞次日开始猫眼草各组以7.5、15.0、30.0、60.0 g/kg猫眼草灌胃给药，连续 12 d ;顺铂组每日腹腔注射顺铂1 mg/kg，每天1次，连续7 d。每天观察小鼠饮食及肿瘤生长情况。末次灌胃给药后24 h，小鼠称质量，处死。
1.4 观察指标 观察各组瘤质量、抑瘤率、细胞凋亡率、瘤组织病理学变化及肿瘤细胞凋亡情况。
2 结果
2.1 猫眼草对小鼠Lewis肺癌细胞增殖的影响 猫眼草30.0、60.0 g/kg组瘤质量与模型组比较，差异有显著意义（ F=7.90，q=4.16、6.21， P
表1 各组瘤质量与抑瘤率比较（略）
2.2 各组细胞凋亡率比较 模型组、猫眼草7.5、15.0、30.0、60.0 g/kg组及顺铂组凋亡率分别为 1.19% 、 9.44% 、 15.49% 、 16.43% 、24.37%、15.58%。其中猫眼草后3组及顺铂组细胞凋亡率与模型组比较有明显提高。
2.3 肿瘤组织病理学变化 模型组癌细胞呈片状或巢状分布，细胞生长旺盛，无坏死。猫眼草7.5 g/kg组可见癌细胞生长旺盛，大部分未见明显改变;猫眼草15.0 g/kg组癌细胞生长较旺盛，呈片状分布，可见点状坏死;猫眼草 30.0 g/ kg组可见癌细胞核固缩、小片状坏死;猫眼草60.0 g/kg组可见大片癌细胞核固缩、碎裂、坏死。顺铂组瘤组织内有大片细胞崩解的碎片，细胞核固缩。
2.4 猫眼草对小鼠肿瘤细胞凋亡的影响 模型组、猫眼草30.0、60.0 g/kg组及顺铂组凋亡指数分别为（0.79±1.60）%、（4.00±7.15）%、 （5.93± 5.96）%、（7.07±10.15）%，猫眼草 60.0 g/ kg组及顺铂组的凋亡指数与模型组相比有显著性差异（ t=2.63、1.93，P
3 讨论
肺癌是严重危害人类身体健康的常见癌症之一。其治疗仍以手术、化疗、放疗与生物治疗为主，但有其局限性和明显的毒副作用。近年来大量的研究表明，天然植物中存在具有治疗价值的抗癌药物，天然植物药物以其所特有的低毒、有效、无耐药性及整体调节等多方面的优势，在肿瘤治疗中起着越来越重要的作用［1］。猫眼草全草化学成分含黄酮类成分、猫眼草素、山柰粉、槲皮素、山奈粉-3-单-L鼠李糖甙及槲皮素-3-单-L-鼠李糖甙，还含有甾醇、挥发油、酚类物质、有机酸及蜡质等。有祛寒、镇咳、平喘、拔毒止痒、利尿消肿之功。功能主治:散播结，杀虫。近年来，开始了对猫眼草及其提取物的抗肿瘤作用的研究。 ARISAWA等［2］从猫眼草中提取出黄酮化合物及一种细胞毒成分β-peltoboykinoli cacid，并探讨了β-peltoboykinolic acid对体外不同人体癌细胞株的细胞毒性，证明了该细胞毒成分对Meth-A小鼠纤维肉瘤的抗肿瘤作用。如应用该细胞毒成分和丝裂霉素C及OR-432联合进行治疗，能增强C57BL/6小鼠对B16-BL6小鼠黑瘤的抗肿瘤作用［3］。另外，有泽宗久［4］也从猫眼草中分离出了有抗癌作用的黄酮类成分。高志良［5］应用大剂量猫眼草治疗早期弥漫性肝癌取得了满意的疗效。在中国民间，已经有用猫眼草组方来治疗癌症，如纵隔肿瘤［6］、食管癌及乳癌等，但相关文献资料对猫眼草的抗癌作用机制报道甚少。顺铂抗瘤谱广，目前被临床广泛应用，成为当前最常用的抗癌药物之一。顺铂对肿瘤细胞的杀伤主要是由于顺铂能引起肿瘤细胞的生长抑制和诱导细胞凋亡［7］。细胞凋亡是细胞主动参与的自杀机制，是抗肿瘤药物抑制肿瘤细胞生长的机制之一，被视为评估药物疗效的一项新指标［8］。本实验为观察猫眼草对肺癌生长的影响，采用C57BL/6小鼠移植性Lewis肺癌作为模型，猫眼草水提物灌胃给药，并与应用顺铂相比较。结果显示，不同剂量猫眼草对小鼠移植性肺癌有不同程度的抑制作用，30.0以及 60.0 g/kg 组瘤质量、抑瘤率与模型组比较，差异均有显著意义。本文结果亦显示，随着剂量的增大，猫眼草的抑瘤作用逐渐增强，但猫眼草的最大用药量有待进一步研究。本实验采用TUNEL标记法观察猫眼草对小鼠肺癌细胞凋亡的影响。结果显示，猫眼草60.0 g/kg组小鼠肿瘤的凋亡指数较模型组有显著性差异，提示猫眼草可通过诱导细胞凋亡而发挥其抗癌作用。总之，猫眼草对Lewis肺癌有明显的抑制作用，且猫眼草抑制肺癌细胞的作用随剂量的增加而增高，并有诱导肿瘤细胞凋亡的作用。
［参考文献］
［1］ 陈 聪颖，陆阳，陈泽乃. 天然产物在抗癌药物发现和开发中的作用［J］.中草药，1999，30（2）:144.
［2］ ARISAWA M， TAKAHASHI M， TAKEZAWA E， et al. Construction of chiral 1，2-cycloalkanopyrrolidines from L-pro-line using ring closing metathesis （RCM）［J］. Chem Pharm Bull （Tokyo）， 2000 ，48（10）:1593.
［3］ ARISAWA M， BAI H， SHIMIZU S， et al. Isolation and i-dentification of a cytotoxic principle from Chrysosplenium grayanum Maxim （Saxifragaceae） and its antitumor activities［J］. Chem Pharm Bull （Tokyo）， 1992，40（12）:3274.
［4］ 有 泽宗久. 猫眼草属植物黄酮类对促癌剂的抑制作用［J］.国外医学:中医中药分册，1995，17（4）:39.
［5］ 高 志良. 大剂量泽漆为主治疗早期肝癌［J］.江苏中医，1997，18（2）:28.
［6］ 宋 洪恩，张秀贞，周艳丽. 三子三仁汤及华蟾猫眼草治疗纵隔肿瘤33例疗效观察［J］.中国综合医学杂志，2003，17（3）:56.
［7］ HANNUN J A. Apoptosis and the dilemma of cancer chemo-therapy［J］. Blood， 1997，89:1845-1853.
［8］ MALCOLM R A， CATHCRINE E S. Apoptosis regulation and relevance to toxicology［J］. Hum Toxicol， 1995，14:234-236.