免疫沉淀反应，Western印迹法和共免疫沉淀
根据厂商的指示，依靠Grb2, CrkII， Nck2或者PNRC抗体的抗体免疫沉淀反应实验的进行需要使用免疫沉淀试剂盒（蛋白A）（罗氏分子生化药剂,曼海姆,德国）。简单地说，细胞裂解液（冰冻， 50mM Tris-HCl， pH 7.5, 150mM NaCl，1% Nonidet P40， 0.5% 脱氧胆酸钠，以及整套蛋白酶抑制剂的混合物）被添加到经PBS洗过的细胞上。经过20分钟的冰敷后，将细胞刮下，转移至微量离心管，声波处理，然后在4摄氏度、12000的离心力下离心10分钟。用来进行免疫沉淀反应和共反应沉淀的细胞裂解物量分别为2mg,15mg。为了减少本底，将小份溶菌液和50微升蛋白A均匀琼脂悬浮液混合，然后在2至8摄氏度的摇摆平台上培育一夜。用12000g、4摄氏度的离心机离心20s来清除琼脂糖微球。接下来用上清液来培育特定抗体，这需要Grb2,CrkII, Nck2（1:1000稀释,圣克鲁斯生物技术公司,Inc.,Santa Cruz, CA, USA），或者PNRC抗血清（1：500稀释），或者非特异性的免疫球蛋白G(1:1000稀释,杰克逊Immunoresearch实验室），或者rabbit preserum（1：500稀释）作为一种control（control不知道是对照还是抑制还是调控），并且轻轻的在41度下摇晃1小时。在2-8度下，将五十微升的蛋白A的均质琼脂糖悬液添加到摇摆平台上来进一步培养。在4度下，用12000g的离心力离心20秒来收集免疫复合物。沉淀颗粒的洗涤每次都要用三种洗涤缓冲液，洗涤液1（和细胞裂解液相同），洗涤液2（冰冻，50mM Tris-HCl, pH 7.5, 500mM NaCl, 0.1% Nonidet P40, 0.05% 脱氧胆酸钠）。沉淀颗粒用凝胶加样缓冲液洗脱，在一个12% 的SDS– PAGE上进行分离，并用Western印迹法检验，使用Grab2抗体或者PNRC抗血清中的任意一个。免疫蛋白复合体被1:1000稀释的山羊抗兔辣根过氧化物酶共轭（皮尔斯化工有限公司）检测到，紧接着的是二氨基联苯胺（二氨基联苯胺盐酸盐，西格玛）的底物显谱。
免疫沉淀反应，Western印迹法和共免疫沉淀
根据厂商的指示，依靠Grb2, CrkII， Nck2或者PNRC抗体的抗体免疫沉淀反应实验的进行需要使用免疫沉淀试剂盒（蛋白A）（罗氏分子生化药剂,曼海姆,德国）。简单地说，细胞裂解液（冰冻， 50mM Tris-HCl， pH 7.5, 150mM NaCl，1% Nonidet P40， 0.5% 脱氧胆酸钠，以及整套蛋白酶抑制剂的混合物）被添加到经PBS洗过的细胞上。经过20分钟的冰敷后，将细胞刮下，转移至微量离心管，声波处理，然后在4摄氏度、12000的离心力下离心10分钟。用来进行免疫沉淀反应和共反应沉淀的细胞裂解物量分别为2mg,15mg。为了减少本底，将小份溶菌液和50微升蛋白A均匀琼脂悬浮液混合，然后在2至8摄氏度的摇摆平台上培育一夜。用12000g、4摄氏度的离心机离心20s来清除琼脂糖微球。接下来用上清液来培育特定抗体，这需要Grb2,CrkII, Nck2（1:1000稀释,圣克鲁斯生物技术公司,Inc.,Santa Cruz, CA, USA），或者PNRC抗血清（1：500稀释），或者非特异性的免疫球蛋白G(1:1000稀释,杰克逊Immunoresearch实验室），或者rabbit preserum（1：500稀释）作为一种control（control不知道是对照还是抑制还是调控），并且轻轻的在41度下摇晃1小时。在2-8度下，将五十微升的蛋白A的均质琼脂糖悬液添加到摇摆平台上来进一步培养。在4度下，用12000g的离心力离心20秒来收集免疫复合物。沉淀颗粒的洗涤每次都要用三种洗涤缓冲液，洗涤液1（和细胞裂解液相同），洗涤液2（冰冻，50mM Tris-HCl, pH 7.5, 500mM NaCl, 0.1% Nonidet P40, 0.05% 脱氧胆酸钠）。沉淀颗粒用凝胶加样缓冲液洗脱，在一个12% 的SDS– PAGE上进行分离，并用Western印迹法检验，使用Grab2抗体或者PNRC抗血清中的任意一个。免疫蛋白复合体被1:1000稀释的山羊抗兔辣根过氧化物酶共轭（皮尔斯化工有限公司）检测到，紧接着的是二氨基联苯胺（二氨基联苯胺盐酸盐，西格玛）的底物显谱。